Acercamiento al estudio de la interacción y salida de Leishmania amazonensis en un modelo in vitro con macrófagos murinos de la línea celular J774a.1

Los miembros del género Leishmania son parásitos intracelulares obligados, responsables de numerosas enfermedades humanas. Cumplen una parte muy importante de su ciclo de vida dentro del mamífero hospedero, en donde después de la fagocitosis por los macrófagos, los parásitos son confinados dentro de un compartimiento endolisosomal denominado vacuola parasitófora (VP), en el cual se replican siendo finalmente liberados infectando otros macrófagos y de esta forma ampliando la infección. Poco es el conocimiento que se tiene acerca de cómo ocurre el proceso de liberación de amastigotes de Leishmania que infectan macrófagos. Se sospecha que este mecanismo puede estar ocurriendo por un proceso de fusión de membranas. Mediciones de capacitancia
de la membrana del macrófago y el uso de inhibidores de fusión de membranas soportan esta idea. El objetivo de este trabajo fue realizar seguimientos del ciclo infectivo de Leishmania amazonensis, para confirmar los hallazgos
previos en cuanto a los tiempos en que probablemente puede estar ocurriendo la salida del amastigote. Además, se buscó determinar la viabilidad del parásito a lo largo del ciclo infectivo con el fin de comprender mejor la interacción hospedero-patógeno en el modelo in vitro; para ello se midió: viabilidad del parásito con tinción de diacetato de fluoresceína (DAF) y ioduro de propidio (IP), porcentaje de infección y número de parásitos por célula (p/c). Los resultados sugieren que la salida de los parásitos puede presentarse entre las 72 y 78 horas post infección (hpi) y entre las 96 y 120 hpi. Con los resultados de trabajos previos, y los datos presentados en este estudio, se ha propuesto que L. amazonensis puede presentar dos ciclos infectivos que se desarrollan durante cinco días en nuestras condiciones de cultivo in vitro. En las primeras 36-48 hpi el parásito se diferencia a amastigote. Después de su diferenciación comienza su división celular. Luego de las 72 hpi ocurre una disminución en el número de parásitos por célula (p/c) que ha sido relacionada con el momento en el cual podría salir el parásito de su célula hospedera. La recuperación del número de p/c a las 96 hpi y la disminución presentada a las 120 hpi sugieren la ocurrencia de un nuevo ciclo infectivo. La viabilidad del amastigote se vio afectada a medida que transcurrió la infección. Durante las primeras 24 hpi prácticamente todos los parásitos fueron viables (93,85%)
y se observaron de color verde intenso dentro de las VP por marcaje con la sonda DAF. Entre el tercer y cuarto
día se presentó una disminución significativa en la viabilidad de los parásitos p = 0,017 y p = 0,0097 respectivamente.
Entre el tercer y quinto día post infección el cultivo en general se observó más deteriorado y se encontró
una cantidad considerable de macrófagos no viables, pero aún con parásitos viables en el interior de la VP. Estas
observaciones se han interpretado como competencia en el cultivo, lo que generaría déficit alimenticio,
explicando la drástica disminución en la viabilidad general del cultivo. El descenso diario de un grupo de células infectadas podría ser la causa de la disminución en los porcentajes de infección. En este trabajo se desarrolló un método eficiente para marcar la membrana de macrófagos infectados con los análogos fluorescentes de fosfolípidos NBD-PE y RHO-PE con el fin de implementar la técnica FRET, y así evidenciar la fusión de una membrana no marcada como la de la VP, con una membrana previamente marcada como la del macrófago. Se estipuló que la concentración de 5 μg/mL y 10 μg/mL para las pruebas RHO-PE y NBD-PE respectivamente, puestas en contacto con macrófagos infectados en nuestras condiciones, fueron capaces de marcar clara y continuamente la membrana celular del 95,9% y 97,0% de los macrófagos. Asi mismo, con la menor formación de vesículas de la sonda comparada con otras concentraciones y con una permanencia del marcaje más halla de las cinco horas. Este marcaje constituye un gran avance que permitirá obtener mediciones cuantitativas de procesos de fusión de membranas en sistemas complejos como los constituidos por el macrófago y el parásito Leishmania. El hecho de haber marcado la membrana de macrófagos infectados con estas sondas resulta interesante y se convierte en una herramienta clave que permitirá aplicar la técnica de FRET para determinar la ocurrencia de eventos de
fusión relacionados con la salida del parásito.