Nuevos genotipos de arroz resistentes a la Piriculariosis obtenidos por cultivo de anteras

Título en inglés: New blast resistant rice genotypes obtained by and anthers culture.

Resumen: En la Estación Experimental del Arroz Los Palacios, perteneciente al Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas de Cuba (INCA), se efectuaron cruzamientos entre cuatro cultivares resistentes a la Piriculariosis y seis de buen comportamiento agronómico y las anteras de las plantas F₂ fueron cultivadas in vitro para evaluar la formación de callos en tres medios líquidos: N_6-1, N_6-m y NL, así como la regeneración de plantas verdes y albinas, en el medio MS. Las dos primeras generaciones de las nuevas líneas obtenidas fueron evaluadas para caracteres agronómicos y la segunda generación, además, para resistencia frente a la  Piriculariosis. Las líneas que combinaron resistencia a la Piriculariosis y buenos caracteres agronómicos fueron evaluadas en condiciones de infección natural, con alta presión del patógeno. La utilización de la técnica del cultivo de anteras mostró alta dependencia del genotipo y el medio de cultivo. Con el medio NL se lograron los valores más altos para la formación de callos. Se obtuvieron nuevos genotipos resistentes a la Piriculariosis y  de alto rendimiento agrícola.

Palabras clave: Arroz; Mejoramiento genético; Cultivo in Vitro de anteras

Summary: Crosses were made between four blast resistant and six rice varieties of good agronomic performance, at the Los Palacios Rice Research Station of the National Agricultural Sciences Institute of Cuba (INCA) and the anthers from F₂ plants were in vitro culture using three liquid media: N_6-1, N_6m, and NL, for callus formation and after plants regenerations using MS medium. The first two generations of breeding lines were evaluated for agronomic characters and the second generations, also, for Blast resistant. The lines that combined resistance to Blast and good agronomic performance were evaluated under high pressure of natural Blast infection conditions. The success rate of anther culture was highly dependent on the genotype and culture media used. NL medium led to the highest callus formation values. In the process, new blast resistant and high yielding genotypes were obtained.

Key words: Rice; Rice Breeding; Anther culture

ARTÍCULO CORTO

New blast resistant rice genotypes obtained by and anthers culture.

Noraida de Jesús Pérez1, María Caridad González2, Rodolfo I. Castro1, Manuel Aguilar3.

1Investigadores Auxiliares de la Estación Experimental del Arroz, Los Palacios, Instituto Nacional de Ciencias Agrícola, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, La Habana, Cuba, CP 32700. Autor para correspondencia:nory@inca.edu.cu 
2 Investigadora Titular del Departamento de Genética y Mejoramiento Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícola. 
3 Investigador del Departamento de Arroz y Maíz del Centro de Investigaciones y Formación Agraria Las Torres Tomejil, Alcalá del Río, Sevilla España. 

Recibido: enero 20 de 2011 Aprobado: junio 19 de 2012

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Resumen

En la Estación Experimental del Arroz Los Palacios, perteneciente al Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas de Cuba (INCA), se efectuaron cruzamientos entre cuatro cultivares resistentes a la Piriculariosis y seis de buen comportamiento agronómico y las anteras de las plantas F2 fueron cultivadas in vitro para evaluar la formación de callos en tres medios líquidos: N6-1, N6-m y NL, así como la regeneración de plantas verdes y albinas, en el medio MS. Las dos primeras generaciones de las nuevas líneas obtenidas fueron evaluadas para caracteres agronómicos y la segunda generación, además, para resistencia frente a la Piriculariosis. Las líneas que combinaron resistencia a la Piriculariosis y buenos caracteres agronómicos fueron evaluadas en condiciones de infección natural, con alta presión del patógeno. La utilización de la técnica del cultivo de anteras mostró alta dependencia del genotipo y el medio de cultivo. Con el medio NL se lograron los valores más altos para la formación de callos. Se obtuvieron nuevos genotipos resistentes a la Piriculariosis y de alto rendimiento agrícola.

Abstract

Crosses were made between four blast resistant and six rice varieties of good agronomic performance, at the Los Palacios Rice Research Station of the National Agricultural Sciences Institute of Cuba (INCA) and the anthers from F2 plants were in vitro culture using three liquid media: N6-1, N6m, and NL, for callus formation and after plants regenerations using MS medium. The first two generations of breeding lines were evaluated for agronomic characters and the second generations, also, for Blast resistant. The lines that combined resistance to Blast and good agronomic performance were evaluated under high pressure of natural Blast infection conditions. The success rate of anther culture was highly dependent on the genotype and culture media used. NL medium led to the highest callus formation values. In the process, new blast resistant and high yielding genotypes were obtained.

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Introducción

El arroz (Oryza sativa L.) es uno de los cereales de mayor producción a nivel mundial, ocupa el segundo lugar en superficie cosechada, pero desde el punto de vista alimenticio una mayor cantidad de población depende de él (Tan et al., 2001 y Álvarez et al., 2008). En Cuba, constituye unas de las principales fuentes de carbohidratos en la alimentación de la población pero la producción nacional no satisface esas necesidades (Madruga 2004) debido a la obtención de muy bajos rendimientos motivado por diferentes causas, entre las que se encuentra un extenso grupo de agentes infecciosos que causan enfermedades (Cordero y Rivero 2001).

El hongo Magnaporthe grisea Barr (Pyricularia grisea Sacc) produce la más devastadora enfermedad del arroz a nivel mundial, debido a su amplia distribución y las graves pérdidas económicas que ocasiona (Castejón-Muñoz 2008), constituyendo el desarrollo de variedades resistentes la vía más económica para su control y con menor impacto ambiental (Zambrano et al., 2006).

Por su parte, en todo programa de mejora para resistencia a enfermedades, se necesita conocer la fuente de resistencia genética, establecer las condiciones idóneas de infección del patógeno, con el fin de garantizar una efectiva selección y escoger el método adecuado. Dentro de ellos, el cultivo in vitro de anteras de plantas F2presenta numerosas ventajas, ya que la población proveniente de esta combinación de métodos de mejora (hibridaciones y cultivo in vitro), representa la variabilidad genética de la población F2 y las plantas obtenidas in vitro son genéticamente homocigóticas. Esto reduce el tiempo para la obtención de los nuevos cultivares, ahorra recursos financieros y materiales y se aumenta la eficiencia de la selección, facilitando la identificación de individuos superiores (Pérez-Almeida 2004; Jiang et al., 2004; Ramakrishnan et al., 2005; Chen et al., 2006).

Teniendo en cuenta estos antecedentes y conociendo que en Cuba las variedades comerciales de arroz son de tipo índica, conocidas por ser más recalcitrantes al cultivo de tejidos (Saharan et al., 2004) se llevó a cabo este trabajo cuyo objetivo fue obtener genotipos de arroz tolerantes a la Piriculariosis con la utilización del cultivo in vitro de anteras de plantas F2, procedentes de cruces en los que intervienen variedades con cierto grado de resistencia al hongo, así como la evaluación de 3 medios de cultivo para mejorar la eficiencia en el proceso de mejoramiento.

Materiales y métodos

En la Estación Experimental del Arroz, ubicada en Los Palacios y perteneciente al Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, se realizaron cruzamientos entre cultivares resistentes a la Piriculariosis y cultivares de buen comportamiento agrícola (tabla 1) y cada cultivar de buen comportamiento agrícola fue empleado como parental materno y paterno, con los cultivares resistentes, para posteriormente utilizar la progenie en el cultivo in vitro de anteras.

Cultivo in vitro de anteras de plantas F2

En el laboratorio de cultivo de tejidos, de las mejores plantas F2 por cada cruce, teniendo en cuenta el vigor y su estado fitosanitario, entre los 60 - 70 días de edad, se seleccionaron de dos a tres panículas, que poseían una distancia de 4 - 8 cm entre las aurículas de las dos últimas hojas, a las que se les conservó el entrenudo y la vaina de la hoja para protegerlas de la contaminación con patógenos del campo. Posteriormente fueron desinfectadas y sembradas in vitro, según la metodología propuesta por Lentini et al. (1995).

Se utilizaron 3 medios líquidos (tabla 2) para la inducción de callos a partir del polen inmaduro: N6-1, (MeiFang 1992) y N6-m y NL (Lentini et al., 1995) y de 3 a 10 frascos por réplica, dependiendo de la disponibilidad de anteras y 3 réplicas por cada medio. Después de la siembra, los frascos se mantuvieron en ausencia de luz de 30 a 60 días, hasta la formación de los micro callos. Se evaluó la cantidad de anteras que formaron callos.

Los callos de 1-2 mm de diámetro (10 callos por frasco, replicados hasta 10 veces, dependiendo de su disponibilidad) fueron transferidos a un medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 1mg.L -1 de ANA, 2 mg.L -1 de AIA, 4mg.L -1 de Kinetina, 30 g.L -1 de sacarosa y solidificado con 7g.L-1 de Phytagel. Los frascos fueron incubados a 26±20C con un fotoperiodo de 16 horas luz y entre los 30 y 40 días se evaluó la regeneración de plantas verdes y albinas.

El diseño estadístico empleado fue un bloque completamente aleatorio, los datos obtenidos fueron procesados mediante análisis de varianza simple y las medias comparadas con la prueba de Duncan al 5%, además fueron procesados mediante análisis de componentes principales. Para el procesamiento automatizado de los datos se utilizó el paquete estadístico SPSS versión 11.0 sobre Windows.

Evaluación de los regenerantes obtenidos

Cuando las plantas alcanzaron suficiente desarrollo foliar y radical, se retiraron del frasco y se sumergieron en agua por varios días, luego se trasplantaron a bandejas, donde permanecieron a temperatura ambiente y protegidas del sol, después de 15 días se pasaron a la luz directa y a las 3 semanas se trasplantaron al campo, donde recibieron el manejo apropiado del cultivo, según los instructivos técnicos (MINAG 2005).

En el momento de la cosecha, las plantas fueron evaluadas morfológicamente para asociarlas de manera visual con su nivel de ploidía. Posteriormente, a 142 líneas isogénicas fértiles obtenidas (supuestamente diploides), provenientes de 14 cruces (tabla 3), se les evaluó la altura final, el número de panículas por planta, la longitud de la panícula, el número de granos llenos por panícula, el peso de 1000 granos y el largo y ancho del grano y los datos obtenidos fueron procesados mediante análisis de componentes principales, además se determinaron valores máximo y mínimo, la media, error estándar y coeficiente de variación. Para el procesamiento automatizado de los datos se utilizó el paquete estadístico SPSS versión 11.0 sobre windows.

Evaluación de la segunda generación

Las semillas obtenidas, de las plantas cosechadas de la primera generación de líneas isogénicas, fueron sembradas en campo a chorrillo en surcos de 5 m de largo, para realizar las pruebas de uniformidad. A cada línea isogénica (surco) se le evaluó el ciclo y en 1m lineal, el rendimiento agrícola y el número de panículas. La altura final fue medida a 20 plantas y, en 20 panículas tomadas al azar, se contaron los granos llenos por panícula, el peso de 1000 granos, la longitud de la panícula, el largo y ancho del grano. Los datos obtenidos fueron sometidos a análisis multivariado de clasificación automática (Cluster) (Varela 1998). Para el procesamiento automatizado de los datos se utilizó el paquete estadístico SPSS versión 11.0 sobre windows.

Las evaluaciones frente a la Piriculariosis se realizaron bajo infección natural en campo, en las hojas, en la fase vegetativa y en el cuello de la panícula, en la fase reproductiva, de acuerdo con las escalas propuestas por el IRRI (2002).

Evaluación de las mejores líneas obtenidas frente a la incidencia de la Piriculariosis en canteros de infección

En la Granja Caribe, perteneciente al CAI Arrocero "Los Palacios", se sembraron en el mes de marzo, durante cuatro años, sobre un suelo Gley Nodular Ferralítico Concrecionario (Hernández et al., 1999), las mejores líneas obtenidas por cultivo de anteras (aquellas que combinaron alto rendimiento agrícola y resistencia a la Piriculariosis), los cultivares resistentes: Moroberekan, Tetep, IR 759-54-2-2 y 2077 y el cultivar susceptible J-104. Se utilizó la metodología de campo propuesta por el Centro Internacional de Agricultura Tropical y validada en Cuba por Cárdenas et al., (2000), la cual propone realizar los ensayos de selección para la resistencia a la enfermedad en un sitio "hot spot", que presente una alta incidencia de la enfermedad, favorecida por condiciones ambientales y una alta diversidad del patógeno P. grisea.

Se estimó el porcentaje de área foliar afectada (% AFA) por la Piriculariosis en 10 plantas por línea, durante la fase vegetativa, entre 25 y 35 días después de la germinación y, en la fase reproductiva, se evaluaron los porcentajes de cuellos dañados y se determinó la resistencia de las variedades de acuerdo con las escalas propuesta por el IRRI (2002). Los datos fueron procesados mediante análisis de varianza de clasificación simple y las medias se docimaron según la prueba de rangos múltiples de Duncan al 5% de probabilidad de error.

Resultados y discusión

Cultivo in vitro de anteras de plantas F2

Con la utilización de la técnica del cultivo de anteras se observó una respuesta diferenciada para los diferentes cruces empleados, ya que no todos los híbridos fueron capaces de formar callos y los que tuvieron éxito, no lo hicieron en igual magnitud. La frecuencia de anteras que formaron callos, como se aprecia en la tabla 4, osciló entre 0 y 55.3 %, dependiendo del genotipo y el medio de cultivo.

El valor máximo fue alcanzado por Amistad'82 / 2077 en el medio NL (55.3 callos por 100 anteras sembradas), seguido de este mismo cruce en el medio N6m (44,6) y el cruce Amistad'82 / IR 759-54-2-2 también en el medio NL (43,2).

Es interesante señalar que en estos cruces aparece Amistad'82 y coincide además que participa como progenitor femenino, sin embargo en otros cruces donde interviene esta variedad se apreciaron valores muy inferiores (entre 0 y 6,6%) y su participación es indistinta como madre o padre.

Al respecto muchos autores han encontrado que tanto el medio de cultivo como el genotipo, son factores de gran importancia para la obtención de diploides a través del cultivo in vitro de anteras (Grewal, Gill y Gosal, 2006, Niroula y Bimb, 2009, Khatun, Islam y Bari, 2010 y Gueye y Ndoye, 2010).

Con la utilización del medio NL se lograron los valores más altos para la formación de callos. Los tres medios evaluados difieren en la concentración de sales (macro y microelementos) vitaminas y reguladores del crecimiento, razón por la que se hace difícil atribuir una mejor respuesta al efecto de componentes individuales que posee este medio en particular, no obstante es el único de ellos en el que fue sustituida la sacarosa por maltosa y además se emplea nitrato de plata.

En este sentido Lentini et al. (1997) mostraron que al reemplazar la sacarosa por maltosa se obtienen incrementos significativos en la inducción de callos de genotipos índica recalcitrantes y como hecho más notable, la producción de plantas verdes de estos callos se incrementa significativamente.

Otros autores recomiendan también el empleo de maltosa en sustitución de sacarosa para el medio de inducción de callos, sobre todo para la especie índica (Bishnoi et al., 2000 y Chen y Qin, 2008). Por otro lado, la utilización del nitrato de plata en el medio de inducción reduce notablemente la senescencia de las anteras de arroz de tipo índica recalcitrantes, este resultado indica que el etileno acumulado en el envase pudiera estar inhibiendo la formación de callos, efecto que probablemente es revertido con la aplicación de este compuesto (Bishnoi et al., 2000; Bhojwani et al., 2002 y Lentini et al., 1997).

Otro aspecto de interés fue la diferencia en cuanto al tipo de plantas regeneradas (verdes o albinas); INCA LP1 / IR 759-54-2-2, solamente formó plantas albinas (0,3 plantas por 100 anteras sembradas) y los cruces IR 759-54-2-2 / Amistad'82, 6066 / IR 759-54-2-2, Moroberekan / 6066 y IR 1529-430 / IR 759-54-2-2, solo formaron plantas verdes (0.3; 7.6; 0.7 y 5.2; respectivamente, por 100 anteras sembradas).

En este sentido los resultados que se obtienen por diversos autores son muy variables, por ejemplo Sharmin et al. (2004) obtuvieron entre 57 y 75 plantas verdes por 100 callos y sólo de 1 a 8 callos por 100 anteras, Asaduzzaman et al. (2003) obtuvieron regeneración de plantas verdes entre 15 y 30 días después del cultivo y los valores más altos obtenidos fueron 33,3 % y Tran y Voung (2004) sólo obtienen entre 3 y 9 callos por 100 anteras y de 1 a 6 plantas por 100 callos.

La producción de plantas albinas, carentes de clorofila, es un fenómeno común en el cultivo de anteras de arroz, predominante en plantas derivadas de híbridos interespecíficos o híbridos intraespecífico entre las subespecies japónicas e índica con una frecuencia entre 10 y 100 % (Sangwan 2004).

Diversos estudios sugieren que la formación de plantas albinas es debida a alteraciones de los plastidios durante la microsporogénesis in vivo y que el albinismo está relacionado con el deterioro del ADN de los cloroplastos. Otros han encontrado deleciones y moléculas completas en el ADN de los plastidios sugiriendo que tal heterogeneidad pudiera ser la causa del albinismo (Yamagishi 2002). Por su parte Ankele et al. (2005) sugieren que la formación de la planta albina es un fenómeno complejo en el cual están envueltos los plastidios y factores nucleares o sus interacciones defectivas.

Para analizar de manera conjunta la formación de callos y regeneración de plantas verdes y albinas logradas y de esta forma determinar el mejor cruce, se efectuó, con toda la información obtenida, un análisis de componentes principales (tabla 5), el cual explicó el 93% de la variación total en las dos primeras componentes. Los caracteres formación de callos en los tres medios evaluados (N6-1, N6m y NL), así como la regeneración de plantas verdes tuvieron una fuerte contribución a la formación de la primera componente, mientras que la regeneración de plantas albinas contribuyó con un valor más alto a la segunda componente.

La representación gráfica de los cultivares, tomando en consideración estas dos componentes (figura 1), presenta a los cruces 1, 2 y 3 (Amistad'82 / 2077, 2077 / Amistad`82 y Amistad'82 / IR 759-54-2-2), ubicados en el cuadrante inferior derecho con la mejor respuesta a la utilización de la técnica de cultivo in vitro, ya que combinaron mayor formación de callos en los 3 medios (14.6 - 55.3 callos por cada 100 anteras sembradas) con mayor regeneración de plantas verdes (12.7 - 22.6 plantas verdes por cada 100 anteras sembradas) (figura 2) y menos plantas albinas por cada 100 anteras sembradas.

Javed et al. (2007) y Silva y Ratnayake (2009) encontraron que variedades con una alta habilidad para formar callos también mostraron las mejores frecuencias de regeneración de plantas. Por otro lado Talebi et al., 2007; encontraron casos en los que a pesar de presentar una gran habilidad para formar callos la regeneración fue pobre, lo cual estos autores atribuyen al medio empleado para la inducción de callos que puede influir en su capacidad posterior para regenerar plantas.

El genotipo, como es conocido, posee también un efecto significativo sobre la regeneración de plantas verdes, aun cuando es posible producir un alto número de dobles haploides de muchas variedades e híbridos de arroz de tipo japónica, la regeneración de plantas verdes de la mayoría de las variedades tipo índica es baja (Pérez-Almeida 2004). Jain y Maluszynski (2004) plantearon que para obtener una buena respuesta del cultivo de anteras es necesario trabajar con cruzamientos donde uno de los progenitores sea del tipo japónica, mientras que otros autores proponen, como una vía para mejorar la eficiencia del cultivo in vitro de anteras, la utilización de diferentes medios teniendo en cuenta el tipo de arroz (índica o japónica) (MeiFang 1992; Bishnoi et al., 2000; Bhojwani et al., 2002; Tran y Voung 2004 y Chen y Qin 2008).

De los tres medios evaluados para la formación de callos a partir de anteras de plantas F2, los mejores resultados fueron obtenidos con el medio NL y tres cruces: Amistad'82 / 2077, Amistad / IR 759-54-2-2 y Amistad'82 / 2077, aportaron la mayor formación de callos y posterior generación de plantas verdes.

Evaluación de los regenerantes obtenidos

Las plantas maduras fueron evaluadas morfológicamente para de esta forma asociarlas de manera visual con su nivel de ploidía. Las plantas haploides (n = x) son, por lo general, pequeñas, débiles, con problemas de crecimiento y estériles, las diploides DH (n = 2x) son plantas fértiles con un desarrollo similar al de las plantas derivadas de semilla y las plantas poliploides muestran un mayor crecimiento, con estructuras florales más desarrolladas, granos con aristas largas, y parcialmente estériles (Lentini et al., 1997).

Los resultados del análisis de componentes principales realizado a las líneas, con características fenotípicas similares a las diploides, provenientes de los cruces Amistad'82/2077, 2077/Amistad'82, Amistad'82/IR759-54-2-2, Moroberekan/ Amistad'82, IR759-54-2-2/INCA LP-6, INCA LP-6/Moroberekan, Tetep/INCA LP-6, IR75954-2-2/6066, 6066/IR759-54-2-2, 2077/INCA LP-1, Tetep/INCA LP-1, INCA LP-1/Tetep, IR 1529-430/IR 759-54-2-2, y 2077/CP1C8, se presentan en la tabla 6.

El porcentaje de contribución de las dos primeras componentes (C1 y C2) fue alto, nótese que explican el 82.5% de la variación total, lo que pudiera estar relacionado con la correlación existente entre las variables iniciales y por tanto el análisis realizado puede brindar información acertada sobre la clasificación de los genotipos y las relaciones de asociación entre las variables. Todos los caracteres evaluados presentaron una fuerte contribución a la formación de la primera componente y la segunda estuvo representada por los granos llenos por panícula.

La representación gráfica de las dos primeras componentes (figura 3) mostró una amplia dispersión en la distribución de los 142 individuos y no fue posible la formación de grupos. En el extremo positivo del eje de la primera componente se ubicaron los mejores genotipos, dentro de ellos los valores medios de los cruces Amistad'82 / 2077, 2077 / Amistad'82, Amistad'82 / IR759-54-2-2, INCA LP-6 / Moroberekan, IR 759-54-2-2 / 6066 e INCA LP-1 / Tetep.

Estos cruzamientos aportaron mayor cantidad de líneas que combinan valores altos de panículas por planta, granos llenos por panícula y peso de 1000 granos, componentes importantes que definen el rendimiento de las plantas de arroz, y también presentan mayor longitud de la panícula y el grano, así como ancho del grano.

Dentro de las combinaciones que aportaron las mejores líneas se destacan tres, de las cuatro evaluadas, que incluyen a la variedad Amistad'82 como progenitor, sin importar su utilización ya sea como parental paterno o materno, también coincide que estos cruces lograron mayor cantidad de plantas, se evaluaron 58 en este estudio, que representan el 41% del total.

Al analizar para cada carácter evaluado los valores máximos y mínimos alcanzados, así como la media, el error estándar y el coeficiente de variación, se pudo reafirmar la variabilidad presentada entre los diploides, en esta primera generación (tabla 7), en este sentido se destacan las panículas por planta, seguidas de los granos llenos por panícula con los coeficientes de variación más altos dentro de los obtenidos en el estudio. El largo del grano resultó ser el carácter con el coeficiente de variación más bajo.

Roy y Mandal (2005) señalan a los caracteres panículas por planta, granos llenos por panícula y el rendimiento por planta como los de más altos coeficientes de variación.

Los valores medios de las líneas obtenidas para todos los caracteres evaluados se redujeron con respecto a la media de los progenitores (seleccionados por poseer buenos caracteres agrnómicos) que les dieron origen. Resultados similares fueron obtenidos por Mandal et al., 2000; y Roy y Mandal (2005), al evaluar 180 diploides obtenidos mediante el cultivo de anteras, pero en este caso fueron utilizadas como donantes un grupo de variedades locales. Diversos autores han informado variaciones fenotípicas con relación al número de tallos por planta, la longitud media de la panícula, número de granos llenos y altura de la planta en la primera generación de diploides de arroz, las que pudieran ser debidas por un lado, a la técnica de mejoramiento empleada antes del cultivo de anteras (hibridación) y también a factores fisiológicos, químicos, a los componentes del medio de cultivo, condiciones biológicas del explante, recombinación somática, mutaciones, entre otras (Roy y Mandal 2005).

Según Lentini et al., 1997; al realizar la selección de las plantas regeneradas (R1), se debe tener en cuenta que éstas han pasado por diferentes situaciones de estrés en su desarrollo y, debido a esto, es posible que ciertas características fenotípicas tales como altura, floración, macollamiento, fertilidad y centro blanco, puedan verse afectadas y no se expresen en forma normal. Por consiguiente, los datos que se tomen en las plantas regeneradas R1 deben interpretarse con cuidado, teniendo en cuenta estas consideraciones no se efectuó selección en la primera generación.

Evaluación de la segunda generación de plantas diploides

Al evaluar las plantas de la segunda generación de dobles haploides sembradas en condiciones de campo, se observo un alto grado de homogeneidad fenotípica dentro de cada línea, lo que mostró la rápida fijación de los caracteres que se alcanza al utilizar la técnica del cultivo de anteras.

Sobre la base de la clasificación automática (cluster), se agruparon los genotipos en estudio en 10 clases (tabla 8) y se destaca la clase 4 con las 20 mejores líneas que presentan valores más altos de rendimiento y sus principales componentes (panículas por metro cuadrado y granos llenos por panícula), que superan la media del experimento y de los progenitores comerciales que las originaron, los que fueron ubicados en las clases 2 (INCA LP-6 y 6066), 5 (Amistad'82) y 9 (INCA LP-1 y IR 1529-430).

Las 7 líneas agrupadas en la clase 9 le siguen a las anteriores aunque con 0,9 t.ha-1 menos de rendimiento y resalta dentro de sus resultados el largo y ancho de los granos con los valores más altos dentro del estudio.

En las clases 3, 7, 8 y 10 se aprecian los valores más bajos para la formación de panículas y en las clases 7, 8 y 10 para los granos llenos por panícula, lo que puede ser la causa de los bajos rendimientos obtenidos por los genotipos agrupados en estas clases. Muchos autores hablan en sus resultados de las correlaciones existentes entre el rendimiento y dos componentes importantes como lo son las panículas por metro cuadrado y los granos llenos por panícula.

Al respecto, Díaz et al. (2003) en trabajos realizados con la variedad IR 1529-430 encontraron altas correlaciones del rendimiento agrícola con las panículas por metro cuadrado y los granos llenos por panícula. Mientras que Castillo et al. (2008), al evaluar el rendimiento y sus componentes en la variedad de arroz IIACuba 20, encontraron que el número de panículas por metro cuadrado, fue el componente del rendimiento que mayor contribución directa ejerció sobre el rendimiento agrícola.

Con relación a la evaluación realizada frente a la Piriculariosis los resultados mostraron que sólo 9 líneas (8394, 8425, 8432, 8837, 8838, 8839, 8840, 8841 y 8842), dentro del estudio mostraron resistencia a la enfermedad en los dos momentos evaluados, ubicadas todas en la clase 4, que coincide además con la clase que presentó los valores más altos de rendimiento y sus componentes principales. Cuatro de estas líneas tuvieron como progenitor resistente a la variedad IR 759-54-2-2 (8425, 8432, 8837 y 8838) cruzado con Amistad'82, 6066 e IR 1529-430.

También resultaron resistentes, en la evaluación efectuada tanto en la hoja como en el cuello de la panícula, cinco de las variedades utilizadas como progenitores, ubicados en las clases 2 (INCA - LP 6, IR 759-54-2-2 y Tetep), 3 (Moroberekan)y 9 (2077). Otras 93 líneas distribuidas en las 10 clases mostraron resistencia a la enfermedad cuando esta fue evaluada en uno de los dos momentos y susceptibilidad en el otro, lo que pudo ser un factor que contribuyó a la obtención de bajos rendimientos.

En este sentido Zambrano et al. (2006) plantean que cuando no hay destrucción total del cultivo es bastante difícil estimar las pérdidas, por lo que no hay una estimación exacta de las mismas, pero se considera que las pérdidas son proporcionales al porcentaje del área foliar o del cuello de la panícula afectada.

Las líneas que resultaron resistentes deben ser evaluadas en un sitio donde exista una alta presión de la enfermedad y diversidad del patógeno asociada a condiciones ambientales favorables al desarrollo del hongo, lo que permite la selección de materiales con resistencia duradera a la enfermedad causada por el hongoMagnaporthe grisea Barr. En tal sentido Fabregat (1984), citada por Cárdenas (1998), informó que la presencia de la enfermedad en las diferentes fenofases del cultivo está muy relacionada con lo óptimo de las condiciones ambientales, pero su desarrollo depende de las características genéticas de las variedades y de la variabilidad del patógeno, de ahí la necesidad de evaluar las líneas obtenidas en la época de mayor incidencia de la enfermedad y en la localidad seleccionada en Cuba como "Hot Spot ", la Unidad Económica Básica Caribe perteneciente al Complejo Agroindustrial Arrocero "Los Palacios", por poseer condiciones de alta presión de la enfermedad favorecida por condiciones ambientales y una alta diversidad en virulencia del patógeno (Cárdenas et al., 2005).

Evaluación de las nuevas líneas obtenidas por cultivo de anteras frente a la incidencia de la Piriculariosis en canteros de infección

Si analizamos la media anual del comportamiento de las líneas evaluadas en canteros de infección en la localidad Caribe (tabla 9) se aprecian, en todos los casos, valores de la enfermedad considerados como susceptibles, o sea afectaciones del área foliar y cuellos superiores a 3 y 10% respectivamente.

Se observaron además diferencias en los cuatro años evaluados y exhibió los valores más altos el tercero. En este sentido Cárdenas et al. (2007) al valorar los resultados, de un ensayo similar pero con variedades y épocas diferentes, plantean que la enfermedad no exhibe un patrón común en su expresión, lo que consideran está muy relacionado con las condiciones climáticas.

En términos epidemiológicos es conocido que para el desarrollo de cualquier enfermedad debe coexistir un hospedero susceptible, el patógeno y las condiciones ambientales favorables, siendo éstas las que determinan el éxito de la relación patógeno hospedero. La incidencia y severidad del hongo Magnaporthe grisea Barr (Pyricularia grisea Sacc) están influenciadas por diversos factores, tales como la fertilización nitrogenada, la susceptibilidad de los materiales y el tipo de suelo, los cuales interactúan con los factores ambientales que condicionan el progreso de la enfermedad (Meneses et al. 2001).

El conocimiento de la dinámica poblacional del hongo y el desarrollo de estrategias de mejoramiento que incluyan la selección y evaluación de germoplasma de arroz en sitios y época donde exista alta variabilidad del mismo, así como una alta presión de inóculo, permite implementar programas de mejoramiento para desarrollar una resistencia durable a la Piriculariosis. En tal sentido, la selección de localidades y épocas de evaluación de P. grisea, es un factor crítico, en el cual hay que tomar en consideración las variantes climáticas imperantes (Navas et al., 2003).

Si se analiza el comportamiento individual de las líneas ante la infección en la hoja y cuello de la panícula, en los 4 años evaluados, en ella se aprecia una reacción diferente de las mismas, por años y dentro de un mismo año en dependencia del momento evaluado (plántula y paniculación), lo cual puede ser explicado por la existencia en la localidad de una alta diversidad genética del patógeno (Fuentes et al., 1998) que unido a la falta de protección al cultivo permitió la infección de las variedades.

El cultivar J-104 mostró siempre los valores más altos de incidencia de la enfermedad, con diferencias estadísticamente significativas del resto de los genotipos. Así mismo se observaron en esta variedad manchas típicas de la enfermedad y porcentajes de área foliar afectada comprendidos entre los grados susceptibles 6-9 de la escala, lo que coincide con el comportamiento de esta variedad en áreas de producción que además es considerada la principal causa de los bajos rendimientos, tanto de esta variedad como de los cultivares susceptibles que se siembran en producción en la localidad en estudio (UEB Caribe).

Con excepción del tercer año evaluado para el cultivar IR 759-54-2-2, el resto de los testigos resistentes presentaron afectaciones de área foliar por debajo de 3%, mientras que para la incidencia en el cuello, Moroberekan e IR 759-54-2-2 superaron el 10% límite considerado como resistentes, en las cuatro evaluaciones en el caso de Moroberekan y el tercer año IR 759-54-2-2. Teniendo en consideración estos resultados y conociendo además que la localidad utilizada para la evaluación (UEB Caribe) históricamente ha mostrado una alta incidencia de la plaga, razón por la que ha sido seleccionada como hot spot, es meritorio destacar el comportamiento de las líneas 8394, 8425 y 8840 quienes mantienen, durante los 4 años evaluados, los valores más bajos de porcentajes de área foliar y cuellos afectados dentro de los grados 0 y 3 de las escalas utilizadas, superando incluso a los progenitores que les dieron origen.

El mejoramiento tradicional ha jugado un papel importante en el mejoramiento del rendimiento y calidad de las variedades de arroz en el mundo, mientras que la utilización de los métodos biotecnológicos puede asistir el desarrollo de variedades con rendimiento más alto y resistencia a enfermedades y estrés abióticos. El cultivo in vitro de anteras acelera el proceso de obtención debido a su producción rápida de líneas homocigóticas y por consiguiente la retención de alelos recesivos o mutaciones útiles. Existen en la actualidad un gran número de variedades desarrolladas combinando las técnicas convencionales con el cultivo de anteras (Chen et al., 2006).

Conclusiones

Los resultados obtenidos permiten concluir que la utilización de la técnica del cultivo de anteras mostró alta dependencia del genotipo y el medio de cultivo, las dos primeras generaciones de las líneas obtenidas presentaron un alto grado de homocigosis fenotípica. De los 3 medios líquidos empleados para la formación de callos a partir de anteras, resultó el NL con los valores más altos y se obtuvieron nuevos genotipos resistentes a la Piriculariosis y de alto rendimiento agrícola.

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