Análisis de expresión génica durante la respuesta de defensa de la yuca a la bacteriosis vascular (Añublo Bacteriano)

Gene expression analysis during cassava defense response to bacterial blight disease

La bacteriosis vascular de la yuca es una destructiva enfermedad en Sur AmØrica y África, causada por la bacteria Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). Produce pérdidas entre el 12% y 100% de los cultivos. Algunos estudios se han realizado a nivel bioquímico y citoquímico para conocer las respuestas de defensa de la yuca a Xam; sin embargo, las bases moleculares de los mecanismos de defensa no han sido aún caracterizadas. Con el propósito de identificar genes diferencialmente expresados durante la respuesta de la planta al patógeno, se ha construido una librería sustractiva, usando el método de Sustracción Diferencial en Cadena (DSC), con 1536 clones de dos variedades resis­tentes (MBRA 685 y SG 107-35). De esta librería fueron seleccionados al azar 110 clones para ser secuenciados y realizar búsquedas de similitud en bases de datos públicas. El análisis de secuencia mostró 14 clones con similitud a genes previamente reportados como involucrados en procesos de defensa en plantas, 70 clones con similitud a genes de plantas sin función conocida o que no presentaron similitud, representando nuevos genes potencialmente involucrados en las respuestas de defensa de la yuca. Finalmente fueron construidos microarreglos de ADNc, usando los clones seleccionados de las librerías sustractivas para confirmar su expresión diferencial durante el desarrollo de la infección. Palabras clave: yuca, añublo bacteriano, identificación de genes, librerías sustractivas, microarreglos.

Cassava bacterial blight (CBB) caused by Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) is a destructive disease in the South América and África and yield losses range between 12 and 100%. Cytochemistry and biochemistry of defense response to CBB have been well studied. However, the response of the plant to pathogen attack at the molecular and cellular level remains uncharacterized. Identification of genes associated with defense responses is one of most critical steps leading to the elucidation of disease resistance mechanisms in cassava. In this study, we identified differentially expressed genes during pathogen attack by subtractive hybridization, using the Differential Subtraction Chain method (DSC). A population of cDNA obtained from infected plants was used as "treatment" and a population of cDNA obtained from healthy plants was used as "control". 1536 clones were isolated from the resistant varieties (MBRA 685 and SG 107-35). Of these, 110 randomly selected clones were sequenced and a homology search was conducted. The sequence analysis showed that 14 cDNA clones shared homology with plant genes involved in defense responses, 70 clones were either homologous to plant genes of unknown function or showed no homology, representing new genes potentially involved in cassava defense responses. A cDNA microarray was constructed by spotting the clones identified from our subtractive libraries. Other clones potentially involved in cassava defense responses were also included. The cassava defense cDNA microarray was used to confirm the differential expression of the clones. Keywords: cassava, bacterial blight, gene expression, subtractive library, microarrays.

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Análisis de expresión génica durante la respuesta de defensa de la yuca a la bacteriosis vascular (Añublo Bacteriano) Gene expression analysis during cassava defense response to bacterial blight disease Mauricio Soto-Suárez*, Silvia Restrepo**, Gloria Mosquera***, y aleñe Verdier****, Joe Tohme***** RESUMEN La bacteriosis vascular de la yuca es una destructiva enfermedad en Sur América y África, causada por la bacteria Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). Produce pérdidas entre el 12% y 100% de los cultivos. Algunos estudios se han realizado a nivel bioquímico y citoquímico para conocer las respuestas de defensa de la yuca a Xam; sin embargo, las bases moleculares de los mecanismos de defensa no han sido aún caracterizadas. Con el propósito de identificar genes diferencialmente expresados durante la respuesta de la planta al patógeno, se ha construido una librería sustractiva, usando el método de Sustracción Diferencial en Cadena (DSC), con 1536 clones de dos variedades resistentes (MBRA 685 y SG 107-35). De esta librería fueron seleccionados al azar 110 clones para ser secuenciados y realizar búsquedas de similitud en bases de datos públicas. El análisis de secuencia mostró 14 clones con similitud a genes previamente reportados como involucrados en procesos de defensa en plantas, 70 clones con similitud a genes de plantas sin función conocida o que no presentaron similitud, representando nuevos genes potencialmente involucrados en las respuestas de defensa de la yuca. Finalmente fueron construidos microarreglos de ADNc, usando los clones seleccionados de las librerías sustractivas para confirmar su expresión diferencial durante el desarrollo de la infección. Palabras clave: yuca, añublo bacteriano, identificación de genes, librerías sustractivas, microarreglos. ABSTRACT Cassava bacterial blight (CBB) caused by Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) is a destructive disease in the South América and África and yield losses range between 12 and 100%. Cytochemistry and biochemistry of defense response to CBB have been well studied. However, the response of the plant to pathogen attack at the molecular and cellular level remains uncharacterized. Identification of genes associated with defense responses is one of most critical steps leading to the elucidation of disease resistance mechanisms in cassava. In this study, we identified differentially expressed genes during pathogen attack by subtractive hybridization, using the Differential Subtraction Chain method (DSC). A population of cDNA obtained from infected plants was used as "treatment" and a population of cDNA obtained from healthy plants was used as "control". 1536 clones were isolated from the resistant varieties (MBRA 685 and SG 107-35). Of these, 110 randomly selected clones were sequenced and a homology search was conducted. The sequence analysis showed that 14 cDNA clones shared homology with plant genes involved in defense responses, 70 clones were either homologous to plant genes of unknown function or showed no homology, representing new genes potentially involved in cassava defense responses. A cDNA microarray was constructed by spotting the clones identified from our subtractive libraries. Other clones potentially involved in cassava defense responses were also included. The cassava defense cDNA microarray was used to confirm the differential expression of the clones. Keywords: cassava, bacterial blight, gene expression, subtractive library, microarrays.

Recibido: octubre 22 de 2004 Aceptado: mayo 11 de 2005

* Biólogo. Asistente Investigación. Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT, Cali-Palmira, Colombia. Correo electrónico: m.soto.suarez@gmail.com ** Ph. D Fitopatología Molecular. Profesor asociado. Universidad de los Andes. ***MS. c Microbiología. Estudiante doctorado. Kansas State University. **** Ph. D Fitopatología Molecular. Líder Proyecto Bacteriosis. CIAT-IRD. ***** Ph. D Genetista. Líder Proyecto Agro-biodiversidad y Biotecnología. CIAT.

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__GENOMICA FUNCIONAL EN YUCA
INTRODUCCIÓN La yuca (Manihot esculenta Crantz) es la especie productora de carbohidratos más eficiente por unidad de área en el trópico. Es el cuarto producto básico más importante en el mundo y hace parte de la dieta de más de 1000 millones de personas. La bacteriosis vascular de la yuca es considerada una de las enfermedades más limitantes para la producción de yuca en el trópico, las pérdidas del cultivo oscilan entre 12% y 100% (Lozano, 1986). Algunos trabajos han sido desarrollados con el ánimo de caracterizar citoquímicay bioquímicamente la interacción con el agente etiológico Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) (Boher et ál., 1997; Kpémoua et ál., 1996), identificar las variedades resistentes y susceptibles a las diferentes cepas del patógeno (Restrepo et ál., 2000) y medir su diversidad genética y diferenciación geográfica (Restrepo and Verdier, 1997), entre otros. Sin embargo, los genes que gobiernan las respuestas de defensa en contra del ataque del patógeno no han sido aœn identificados. Muchos detalles de los procesos de interacción planta-patógeno son conocidos (Baker et ál., 1997). Una vez la planta y el patógeno entran en contacto, el organismo hospedero activa una serie de respuestas de defensa. Son inducidas diferentes vías de señalización, entre ellas las mediadas por Intermediarios con Oxígeno Reactivo (ROS), ácido salicílico, óxido nítrico, etileno y ácido jasmónico. También es activada la expresión de genes Relacionados con Patogenicidad (PR) y la síntesis de compuestos antimicrobianos que son generalmente fitoalexinas, defensinas, compuestos fenólicos y flavonoides producidos para atacar directamente al patógeno (Baker etál., 1997). La activación de todas estas vías de señalización termina en la inducción de la Respuesta Hipersensible (HR), una muerte celular programada localizada en el sitio del ataque, con el fin de impedir la dispersión del patógeno, y la Respuesta Sistémica Adquirida (SAR) mediada por el ácido salicílico, que distribuye la resistencia a todos los órganos de la planta (Hammond-Kosack and Jones, 1996). En yuca no han sido aún caracterizadas las vías de respuesta a sus diferentes patógenos. Utilizando innovadoras herramientas de genómica funcional se ha avanzado en el entendimiento de la biología molecular en los pro	cesos de resistencia a enfermedades y condiciones de estrés en general. Con la aplicación de estas herramientas, tales como la construcción de librerías sustractivas y la tecnología de microarreglos, se pueden realizar análisis globales de expresión de cientos o miles de genes bajo condiciones ambientales y fisiológicas específicas; por ejemplo identificar genes involucrados en las respuestas de defensa en contra del ataque de patógenos. En el caso particular de la yuca, la aplicación de genómica funcional en el estudio de su interacción con Xam podrá contribuir en la solución de un problema que le resta interés al cultivo y lo hace menos rentable en comparación con otros productores de carbohidratos. En este trabajo se han utilizado herramientas de la genómica funcional: construcción de librerías sustractivas y microarreglos de ADN, a fin de identificar genes expresados en las respuestas de la yuca para defenderse del ataque de Xam. MATERIALES Y MÉTODOS Inoculación de dos variedades resistentes de yuca con Xanthomonas axonopodis pv. manihotis Las estacas de plantas de las dos variedades resistentes a la cepa de Xam (CIO-151) SG 107-35 y MBRA 685 (Restrepo et al., 2002) mantenidas en campo fueron sembradas en bolsas de plástico perforadas de 6 cm x 7 cm. con una proporción de tierra:arena (1:3) estéril, cuatro semanas después fueron transferidas a condiciones de invernadero (temperatura de 28 °C /19 °C (temperaturas día/ noche), 12 horas de fotoperíodo (luz de día) y 80% de humedad relativa, en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). Se inocularon las dos variedades con la cepa CIO-151 de Xanthomonas axonopodis pv. manihotis por punción de tallos en la variedad SG 107-35 y de hojas en la variedad MBRA 685. Se colectaron los tallos y hojas respectivamente pasadas 6, 12, 24, 48, 72 horas y 7 días de la inoculación. Fueron utilizadas 4 plantas para inocular con Xam por cada tiempo. Adicionalmente, para cada conjunto de 4 plantas tratamiento (tiempos de inoculación con
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Xam) se colectaron el mismo nœmero de plantas sanas y estresadas por punción, para un total de 24 plantas inoculadas (6 tiempos, 4 réplicas por tiempo), 24 plantas sanas (4 réplicas control por cada tiempo) y 24 plantas estresadas por punción (6 tiempos, 4 réplicas por tiempo). Para la inoculación en hojas se abrieron orificios de 2 mm de diámetro y se colocaron sobre ellos 10 |j,L de una suspensión bacteriana (108 unidades formadoras de colonias/mL) (Restrepo et al., 2000a). Inmediatamente después de colectar el tejido se introdujo en nitrógeno líquido para su preservación y luego fue almacenado a -80 °C. Extracción de ARN total, aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc Para cada variedad dos extracciones de ARN total fueron hechas paralelamente. En la primera se pesaron 600 mg de cada tejido perteneciente a los tiempos 6, 12, 24, 48, 72 horas y 7 días después de la inoculación, para un total de 3 gr. de tejido, cuyo ARN representa todos los tiempos del proceso de infección por Xam. En la segunda se pesaron 420 mg del tejido estresado por punción perteneciente a los tiempos 0, 6, 12, 24, 48, 72 horas y 7 días, para un total de 3 g de tejido, cuyo ARN representa los genes expresados por una planta sana y los expresados en respuesta al estrés por punción. De esta manera se extrajo manualmente ARN total de tallos y hojas de SG 107-35 y MBRA 685 respectivamente, siguiendo las modificaciones hechas por Rocha, P.J. (1995) al protocolo descrito por Hall et al., (1978). Se aisló el ARNm utilizando el kit "Oligotex mRNA Midi (QIAGEN, CA)", siguiendo fielmente las indicaciones del productor, luego se sintetizó el ADNc usando el kit "SMART™ PCR cDNA synthesis (CLONTECH, CA)", siguiendo las instrucciones del productor, a partir de 400-500 ng de ARNm. Al final de este proceso se contaba con una "Población 1" de ADNc que representa la expresión génica en todos los tiempos de la infección después de la inoculación y una "Población 2" deADNc perteneciente a plantas sanas y estresadas. Todo esto para cada variedad. Librería sustractiva de ADNc por el método de DSC Con el fin de aislar œnicamente los genes que se expresan en respuesta al ataque del patógeno,	fue implementada una metodología de sustracción que puede hallar rápidamente diferencias entre dos poblaciones de ADN Luo et al. (1999). Brevemente, El ADNc de la "Población 1" proveniente de plantas inoculadas fue usado como "tratamiento" y el ADNc de la "Población 2" proveniente de plantas sanas y estresadas fue usado como "control". Ambos ("control" y "tratamiento") fueron digeridos con la enzima de restricción Dpnll. Seguidamente, el producto de la digestión fue ligado con un adaptador/primer diferente para cada población deADNc (Población 1: BamIa, ATGAAGTGCACCCTACGATTCGAG; BamIb, pGATCCTCGAAATCGTAGGGGTGCACT. Población 2: BamIIa, ATGAGAC ATGTTTCGTAGCCTAGG, BamIIb, pGATCCC TAGGCTACGAAACATGTC). El producto de la ligación fue sujeto a amplificación por PCR bajo las siguientes condiciones: 94 °C por 2 min., 94 °C por 30 seg., 68 °C por 2 min. por 30 ciclos de amplificación. Para la primera ronda de hibridación del DSC, 10 |j,g de "control" previamente digerido con DpnII (para remover de nuevo los adaptadores) fue mezclado con 100 ng de "tratamiento", la mezcla fue precipitada y resuspendida en un volumen final de 32 jaL de buffer de hibridación (50 mM Hepes, 1M CTAB). La mezcla fue calentada a 98-100 °C por 5 min y se adicionaron 8 |aL de 5 M NaCl para un volumen de 40 |j,L. Luego se incubó a 67 °C por 14-16 h. El ADN renaturado fue purificado con el kit "QIAquick PCR purificaron" (QIAGEN, CA) y resuspendido en 50 |_lL de buffer 1X para la enzima exonucleasa "mung bean" (New England Biolabs, MA) con 10U de enzima "mung bean" e incubado a 30 °C por 25-30 min. Para inactivar la exonucleasa, la muestra fue purificada con el kit "QIAquick PCR purificaron" (QIAGEN, CA). Una alícuota de 2.5 |j,L del ADN purificado fue tomada para examinar la eficiencia de la sustracción por PCR bajo las siguientes condiciones: 94 °C por 2 min., 94 °C por 30 seg., 68 °C por 2 min. por 35 ciclos de amplificación. El producto restante (+/- 55 |aL) fue concentrado al vacío, resuspendido en 32 |j,L de buffer de hibridación y recalentado a 98 °C para una segunda ronda de hibridación. Con el producto de PCR de la segunda y tercera ronda de hibridación para SG 107-35, y la tercera y cuarta ronda de hibridación para MBRA 685, se construyó una librería de 384 clones para cada va-
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riedad. Para ello se transformaron por electroporación células competentes de la cepa DH-5oc de E. coli. El vector utilizado fue el pGEM®-Teasy. Secuenciación y análisis de secuencias Cuarenta y ocho clones para las dos œltimas rondas de hibridación en ambas variedades fueron secuenciados utilizando el secuenciador automático ABI Prism 377, disponible en el CIAT. Estas secuencias fueron editadas usando el programa Sequencher 4.1 (Gene Codes Corporation). De los 192 clones secuenciados en total (48 de cada ronda de sustracción para las dos variedades) se obtuvieron en total 110 secuencias œnicas, 63 para MBRA 685 y 47 para SG 107-35. Con el fin de encontrar posibles funciones para el grupo de secuencias, se realizaron bœsquedas de similitud con BLASTn y BLASTx contra la base de datos del NCBI, teniendo como valor de probabilidad límite E = 1,0 xiO"4. Construcción del microarreglo, hibridación y análisis de datos Los 110 clones seleccionados de la librería sustractiva fueron utilizados para construir un microarreglo. Cada clon fue replicado 8 veces en el microarreglo. Con el propósito de ejercer un control de calidad sobre el microarreglo, fueron organizados genes control de tomate, papa, humano y genes constitutivos de yuca. Los clones fueron organizados en láminas de polilisina (Telechem International, Sunnyvale, CA) usando el robot SPBIO Microarray Spotting Station (MiraiBio Inc.). Plantas de MBRA 685 y SG 107-35 fueron inoculadas como se describió anteriormente y colectadas después de 24, 48 horas (h) de infección, el tejido fue agrupado por genotipo. La hibridación al microarreglo fue realizada con el conjunto de ADNc de plantas infectadas vs. plantas sanas. Para confirmar la reproducción del experimento cada hibridación se hizo por duplicado. El ARN fue extraído usando el kit SV total RNA isolation system (Promega Corp.). El ADNc fue sintetizado usando el kit SMARTTM PCR cDNA synthesis (CLONTECH, CA). En el mareaje con fluorescencia se incorporó Cye3-dUTP (fluorescencia verde) al ADNc de plantas	sanas y Cye5-dUTP (fluorescencia roja) al ADNc de plantas infectadas. El arreglo fue escaneado usando el escáner Virtek Chip-Reader scanner (BIO-RAD). La obtención de valores para cada señal, eliminación de hibridación inespecífica y normalización de los datos por LOESS, fue realizada usando el programa ArrayPro 4.0. (BIO-RAD). Los genes diferencialmen-te expresados fueron detectados usando el programa de análisis SAM (Significance Analysis of Microarrays) (Tusher et ál., 2001). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis funcional de las secuencias aisladas por la sustracción Provenientes de la librería sustractiva fueron obtenidas 110 secuencias œnicas, 63 para MBRA 685 y 47 para SG 107-35. En ambas variedades fueron encontrados 14 genes que hacen parte de las respuestas de defensa de la planta al ataque del patógeno, entre ellos genes que participan en vías completas de señalización, desarrollo de estrés oxidativo, que muy probablemente activa la HR y SAR, modificación de la pared celular y degradación proteica (tabla 1). Flujo de calcio Numerosas vías de señalización en las respuestas de defensa son activadas por el flujo de calcio (Ca2+) (Kim et ál., 2002). Se ha demostrado que el calcio es esencial para la activación de la síntesis de fitoalexinas, inducción de genes PR y HR (Zimmermann et ál., 1997). Puesto que gran parte de las señales de Ca2+ son mediadas por proteínas de unión a calcio como calmodulinas (CaM), se ha propuesto la importancia de estas proteínas como moduladores de las señales de transducción mediadas por calcio en las respuestas de defensa (Kim et al., 2002). La producción de ROS, compuestos que generan el estrés oxidativo, depende en gran medida de la activación del flujo de calcio y su modulación por calmodulinas (Grant and Loake, 2000). Estas proteínas de unión a calcio generalmente presentan el dominio "EF hand", al cual se une el Ca2+ para luego ser cargado a una vía
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Tabla 1. Secuencias aisladas en la librería sustractiva para ambas variedades que están asociadas en procesos de defensa a patógenos en plantas. Se muestran los valores de probabilidad E que resultan de las bœsquedas de similitud en la base de datos del NCBI usando el algoritmo BLASTx, como puede verse todas las secuencias tienen un nivel de similitud alto.
Clon	Similitud	Valor E
SUS01       Calmodulina                                                                                    4E-44 SUS02      Catalasa CAT1 [Manihot esculenta]                                                  3E-43 SUS03      Nucleosido Difosfato Quinasa (ndpk3) [Arabidopsis thaliana]            1E-38 SUS04      Glutaredoxina [Ricinus communis]                                                   4E-38 SUS05      Proteína de la familia Bet v I                                                             2E-14 SUS06      Proteína de Transferencia de Lípidos (LTP)                                      2E-14 SUS07      Proteína Ankirina [Arabidopsis thaliana]                                            5E-16 SUS08      Xiloglucan Endotransglicosilasa [Arabidopsis thaliana]                     9E-47 SUS09      Factor de transcripción MYB [Arabidopsis thaliana]                          2E-08 SUS10      Proteína Dedo de Cinc (ZFP) [Arabidopsis thaliana]                         9E-57 SUS11       Poliubiquitina (UBQ10) [Arabidopsis thaliana]                                   5E-36 SUS12      \Jb\qu\bn {\JBQ12) [Arabidopsis thaliana]                                          1E-31 SUS13      Metaloproteinasa [Arabidopsis thaliana]                                           5E-13 SUS14      Proteína DnaJ [Hevea brasiliensis]                                                   7E-24
NADPH quinasa dependiente y terminar en la producción de ROS (Grant and Loake, 2000). En ambas variedades de yuca fue aislada una secuencia que codifica para la enzima calmodulina (SUS01) y presenta un dominio "EF hand". Para confirmar su posible papel en las respuestas de defensa fue alineada con siete secuencias CaM encontradas por Kim et al. (2002) y que están asociadas con respuestas de defensa a hongos en arroz. Se encontró una similitud del 98% con estas secuencias. El resultado sugiere que la calmodulina aislada en la sustracción podría pertenecer a este grupo de genes con secuencias altamente conservadas. Estrés oxidativo. Todos los organismos usan el O2 como aceptor final en la cadena de transporte de electrones de la respiración; en este proceso el O2 puede ser reducido para formar ROS, tales como el radical superóxido (O2). Los principales componentes celulares son susceptibles al daño por radicales libres, ya que estos tienen gran efecto sobre proteínas,		lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos (Blokhina et al., 2003). Con el fin de prevenir daños ocasionados por ROS, los organismos aeróbicos poseen enzimas que rápidamente los degradan, una de ellas es la catalasa, esta enzima protege la célula del H202y de otros ROS por conversión del H2O2en agua y oxígeno molecular durante una reacción catalítica (Blokhina et ál., 2003). Está bien documentado que la catalasa cumple un importante papel en las respuestas de defensa en plantas en contra de un amplio rango de patógenos (Yi et ál., 1999). Una de las más rápidas respuestas de defensa seguidas al reconocimiento del patógeno la constituye la producción de ROS, se ha sugerido que el aumento de ROS representa una vía de señalización para el inicio de la HR y SAR (Grant et al., 2000). Para que los compuestos con oxígeno reactivo se acumulen en la célula es necesaria la inhibición de la enzima calatasa. El ácido salicílico es el encargado de inhibir tanto la transcripción como la actividad enzimática de la catalasa (Yi et al., 1999). Algunos experimentos han sido ejecutados con el fin de dilucidar el papel de la catalasa y ROS en la activación
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	de respuestas de defensa. Plantas transgénicas de tabaco expresando genes con orientación antisentido de dos familias de catalasa que se unen a ácido salicílico (CAT1 y CAT2) mostraron el desarrollo de HR, inducción de genes PR de la familia PR-1 y el aumento de la resistencia al virus del mosaico del tabaco (Chamnongpol et al., 1998). Durante la sustracción realizada en las dos variedades resistentes MBRA 685 y SG 107-35 fueron encontrados genes que codifican enzimas catalasas (SUS02) pertenecientes a la familia CAT1 que es inhibida por ácido salicílico, este resultado sugiere un papel importante de CAT1 en la interacción yuca-Xam. Las secuencias que codifican para catalasa CAT1 tienen una similitud del 89% (valor E = 4e-18) con el gen Ngcat1 aislado por Yi et ál. (1999) durante un estudio realizado para evaluar el papel de la catalasa en respuestas de defensa en tabaco. En la sustracción fueron aisladas otras dos secuencias que cumplen importantes papeles en el estrés oxidativo de la planta durante las respuestas de defensa. La primera de ellas es la Nucleósido Difosfato Quinasa (SUS03), capaz de inhibir la generación de ROS (Moon et ál., 2003). La segunda es la Glutarredoxina (SUS04), una pequeña óxido-reductasa que participa, entre otros, en el plegamiento y regulación de proteínas y en la reparación de proteínas que han sido afectadas por el estrés oxidativo (para una revisión, verGrant, 2001). Expresión de genes PR En la librería sustractiva fue aislada, para la variedad SG 107-35, una secuencia perteneciente a la familia PR-10 que se caracteriza por presentar el dominio Betv1 (SUS05) (81% de similitud) (Van Loon et al., 1994). Se ha demostrado que el dominio Betv1 tiene actividad ribonucleasa (ARNasa) (Bufe et al., 1996). Recientemente fue aislado el gen PPRG2 durante la infección por la planta parasítica Cuscuta trifolii en alfafa; este gen contiene el dominio Betv1 y se expresa en grandes cantidades durante la infección por Xanthomonas (Borsics and Lados, 2002). Otra secuencia relacionada con patogenicidad fue aislada durante la sustracción en la variedad	MBRA 685, pertenece a la familia PR-14 y codifica una proteína de transferencia de lípidos (LPT)(SUS06) que contribuye en la transferencia de lípidos, particularmente fosfolípidos, a través de membranas (Borsics and Lados, 2002); su relación con la respuesta al ataque de patógenos ya ha sido estudiada. Molina et al. (1993) mostraron que cuatro LPTs de cebada y maíz eran potentes inhibidores de los patógenos Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pseudomonas solanacearum y Fusarium solani. Ese mismo año, Molina et al. (1993) estudiaron el comportamiento de tres de estas LPTs durante la infección por una cepa avirulenta y otra virulenta de Erysiphe graminis en cebada; en ambos casos se observó comportamiento bifásico en la acumulación de LPTs con un alto incremento en las primeras horas de infección y una fuerte reducción en las siguientes. La secuencia aislada en la sustracción presenta una similitud del 58% con Cw20, una de las tres LPT aisladas en cebada. Al parecer la expresión de genes PR está altamente controlada y es dependiente de SAR. Uno de los genes candidatos para controlar la expresión de algunos genes PR es el NPR1 en Arabidopsis. Mutantes con NPR1 defectuosos no activan SAR, disminuyen la expresión de genes PR y se hacen susceptibles (Cao et al., 1997). El gen NPR1 codifica una proteína que contiene repeticiones de ankirina, los mutantes NPR1 presentan una interrupción en estas repeticiones, lo que sugiere que son importantes en la función de NPR1. Cuando se introduce el NPR1 silvestre dentro de mutantes NPR1 se restablece la inducción de SAR, la expresión de genes PR y la resistencia a Pseudomonas syhngae (Cao et al., 1997). Una proteína con repeticiones de ankirina fue encontrada en la respuesta de defensa del arroz contra el ataque del hongo patógeno Pyricularía grísea y en respuesta al tratamiento con Benzotiadiazol un homólogo funcional del ácido salicílico (Xiong et ál., 2001). En la sustracción fue aislada en la variedad SG 107-35 una secuencia (SUS07) que muestra una similitud del 98% con una ankirina de Oryza sativa (número de accesión AAN64471) y del 90% con una de Arabidopsis (número de accesión NP_187842); probablemente la ankirina esté involucrada en procesos de interacción proteína-
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proteína durante la inducción de SAR en las respuesta de defensa de yuca contra Xam, de la misma manera como ha sido demostrado para otros pato-sistemas (Cao et al., 1997; Kuhlmann et al., 2003). Modificaciones de la pared celular Una de las estrategias para combatir el ataque de patógenos radica en la modificación de la pared celular y sus componentes (Baker et al., 1997). En la sustracción fue aislada para la variedad SG 107-35 una secuencia que codifica la proteína Xiloglucan endotransglicosilasa (XET) (SUS08). En la década pasada se realizaron muchos estudios sobre esta enzima por su papel determinante en los procesos de expansión de la pared celular durante el crecimiento y desarrollo de la planta Cosgrove (2000). Hacia 1994 fue reportado el BRU1, un gen regulado por Brasinosteroides (BRs) y que codifica la proteína XET (Zurek and Clouse, 1994). Los Brasinosteroides son compuestos polihidroxilados derivados del esterol que están presentes en todas las plantas y se encuentran ampliamente involucrados en la regulación de numerosos genes que controlan los procesos de crecimiento y desarrollo (Clouse and Sasse, 1998) y en procesos más específicos de morfogénesis y expansión de la pared celular. También están involucrados en la respuesta a estrés biótico y abiótico, incluyendo estrés por salinidad, temperaturas extremas y ataque de patógenos (Clouse and Sasse, 1998). Recientemente se ha demostrado con evidencia experimental el importante papel de los BRs en el desarrollo de resistencia a enfermedades en plantas (Nakashita et ál., 2003). Plantas silvestres de tabaco fueron tratadas con un Brasinólido (un tipo de BRs) y mostraron alta resistencia a TMV, al patógeno bacteriano Pseudomonas syringae pv. tabaci y al hongo Oidium sp., también demostraron que el desarrollo de la resistencia por BRs no requiere biosíntesis de ácido salicílico y es independiente del SAR y de la resistencia inducida por heridas. También comprobaron la resistencia inducida por BRs contra Magnaporthe grísea y Xanthomonas Oryzae pv. oryzae en arroz. La secuencia que codifica para XET aislada en la variedad SG 107-35 presenta una similitud del 82% con el gen regulado por BRs (BRU1) re-	portado por Zurek et ál. (1994) (nœmero de accesión P35694). Ha sido reportada la expresión de BRU1 en tejidos vasculares y su posible papel en la formación de pared celular. También se ha confirmado su expresión en células parenquimáticas alrededor del tejido vascular en tallos de soya (Oh et ál., 1998). Los anteriores resultados sugieren que los BRs pueden regular la expresión de XET e inducir lignificación del tejido vascular durante la interacción yuca-Xam. Resultados que concuerdan con previos estudios bioquímicos e histológicos que confirman el refuerzo de las paredes celulares en los tejidos vasculares de la yuca con el fin de impedir la dispersión del patógeno durante la infección por Xam (Kpémoua et ál., 1996). Factores de transcripción El papel de los factores de transcripción en las respuestas a estrés biótico y abiótico ha sido estudiado desde hace pocos años pero con resultados productivos respecto a su identificación en las respuestas de defensa (para una revisión ver Singh et al. 2002). La inducción de la expresión génica en respuesta a un estrés ocurre inicialmente a nivel de la transcripción, regular los patrones de expresión temporal y espacial de aquellos genes es una de las principales tareas de la planta en la respuesta a un tipo determinado de estrés. El genoma de Arabidopsis codifica por lo menos 1500 factores de transcripción (Riechmann et ál., 2000); sin embargo, para la gran mayoría no se conocen detalles de su función. Una de las familias de factores de transcripción identificadas en las respuestas de defensa a estrés son los genes MYB (Jin et al., 1999). Estas proteínas participan en las vías de producción de metabolitos secundarios, proliferación y forma celular, entre otros. Algunos de ellos son expresados en respuesta al tratamiento con hormonas y al ataque de patógenos (Kranz et ál., 1998). En la sustracción fue aislado un factor de transcripción MYB (SUS09) en la variedad MBRA 685, aunque no hubo ninguna similitud con MYB1, ATR1 y otros genes MYB reportados en la literatura como expresados en las respuestas de defensa, su presencia en la librería sustractiva sugiere una posible participación en la interacción yuca-Xam..
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Otro factor de transcripción cuya expresión es inducida en respuesta a estrés biótico y abiótico es la proteína Dedo de Cinc (ZFP, del inglés "Zinc Finger Protein") (Xiong 2001); ha sido demostrada su participación en la respuesta de defensa de Oriza sativa al ataque por Pyrícularía grísea (Xiong, et al., 2001). Recientemente se ha realizado un estudio de la expresión diferencial de factores de transcripción a gran escala, 402 factores de transcripción ubicados en un microarreglo fueron evaluados utilizando como sonda ARNm de diferentes tipos de estrés y estados de desarrollo en Arabidopsis (Chen et al., 2002). La expresión diferencial tanto de genes MYB como ZFP es evidente, ambos tipos de factores de transcripción se expresan en respuesta tanto a estrés biótico (ataque de bacterias, hongos y virus) como abiótico (frío, salinidad, tratamiento con ácido jasmónico), algunos de estos genes se expresan simultáneamente durante estrés biótico o abiótico sugiriendo un cruzamiento en las vías de señalización que responden a ambos tipos de estrés. En la librería sustractiva fue aislada una secuencia en la variedad SG 107-35 que codifica un ZFP (SUS10), el resultado sugiere una regulación transcripcional en las respuestas de defensa a Xam en esta variedad resistente. Degradación de proteínas. La degradación selectiva de proteínas es un mecanismo empleado para activar una variedad de señales de transducción en plantas superiores (Callis et ál., 2000). Esta degradación de proteínas intracelulares se realiza a través del complejo de ubiquitinas presentes en los eucariotas. Las ubiquitinas se unen covalente y específicamente a las proteínas que van a ser destinadas a la degradación a través de una vía dependiente de ATP. Fuertes evidencias sugieren que muchas respuestas a estrés abiótico y resistencia a patógenos son activadas y mediadas por degradación proteica (Ellis et ál., 2002). En la sustracción fueron aisladas dos secuencias que codifican para la poliubiquitina 10 (UBQ10) (SUS11) en ambas variedades y la poliubiquitina 12 (UBQ12)(SUS12) en la variedad SG 107-35. El resultado sugiere que el sistema ubiquitina podría estar involucrado en la activación de vías de señalización mediadas por lisis proteica para responder al ataque por Xam.	Literatura reciente ha mostrado el papel de las proteinasas como un activo mecanismo de defensa en contra del ataque por hongos, virus y bacterias, y la inducción de su expresión en respuesta a estrés abiótico (Liu et ál., 2001). Los mecanismos utilizados por las proteinasas para impedir el ataque del patógeno son muy diversos; por ejemplo, la activación de algunas señales de transducción para responder a la infección es trabajo de las ubiquitinas. Sin embargo, la planta puede expresar proteinasas como compuestos antimicrobianos que atacan de manera directa al patógeno, a este grupo pertenecen las proteinasas defensinas como tioninas e inhibidores de proteinasas que causan lisis a la membrana plasmática de hongos invasores impidiendo su crecimiento (Toma et al., 2002). Además de las defensinas otras proteínas proteolíticas participan en las respuestas de defensa, entre ellas están las metaloproteinasas (Liu et al., 2001). Se ha clonado la secuencia completa de ADNc de una metaloproteinasa (Cs1-MMP) en pepino (Cucumis sativus), los resultados sugirieron que Cs1-MMP estaba involucrada en el desarrollo de senescencia y muerte celular programada y que podría participar en la degradación de la matriz extracelular (Delorme et al., 2000). En el estudio realizado por Liu et al. (2001) proponen que la metaloproteinasa GmMMP2 aislada en soya está involucrada en un nuevo mecanismo de defensa de la planta en contra de la infección por patógenos. Los niveles de transcripción de GmMMP2 incrementan rápidamente durante la interacción compatible (desarrollo de la enfermedad) o incompatible (producción de resistencia) con el hongo Phytophhtora sojae y la bacteria Pseudomonas syríngae; sin embargo, GmMMP2 también se acumula durante el estrés por deshidratación y herida, además su expresión es independiente de la presencia de los ácidos salicílico y jasmónico y no está correlacionada con la inducción de HR. Varias funciones fueron sugeridas para GmMMP2: (1) regular indirectamente la biosíntesis de fitoalexinas; (2) liberar una serie de sustancias antimicrobianas que retardan el crecimiento del patógeno y (3) regular vías de señalización diferentes a las reguladas por ácido salicílico y jasmónico. Recientemente han sido encontradas las metaloproteinasas en la respuesta del tomate a una toxina del hongo patógeno Fussicocum amygdali (Frick et al., 2002), en este estudio fue construido
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un microarreglo con 235 secuencias de ADNc e interrogado con ARN proveniente de plantas tratadas con la toxina, una rápida y transitoria inducción de la expresión fue vista en la metaloproteinasa MMP1. En la librería sustractiva fue encontrada para la variedad SG 107-35 la secuencia que codifica para la enzima metaloproteinasa (SUS13). Esta secuencia presenta una similitud del 48% (Valor E = 1 x 109) con Cs1 - MM P, la secuencia relacionada con muerte celular aislada en pepino, y una similitud del 46% con MMP1, la metaloproteinasa aislada en tomate. Eficiencia en el tráfico de proteínas Durante las respuestas de defensa a patógenos en plantas, grandes cantidades de proteínas son sintetizadas en el Retículo Endoplasmático Rugoso (RER) y dirigidas vía tráfico vesicular a compartimentos específicos intra celulares o a la matriz extracelular (Jelitto-Van Dooren et al., 1999). Está demostrado que cuando la planta es sometida a estrés o atacada por un patógeno se acumulan una serie de proteínas residentes en RER con el fin de asistir el plegamiento, ensamblaje y formación de puentes disulfuro en las proteínas recién sintetizadas (Cunnea et ál., 2003; Jelitto-Van Dooren et al., 1999). Entre estas proteínas se encuentran las chaperonas y las proteínas residentes en RER de la familia DnaJ (Cunnea et ál., 2003), estas proteínas están relacionadas con el apropiado plegamiento proteico y su transporte a través de RER. En la sustracción fue aislada, para la variedad SG 107-35, una proteína de la familia DnaJ (SUS14), su presencia sugiere una posible participación durante la síntesis de proteínas que responden al ataque de Xam con el fin de hacer más eficiente la respuesta de defensa de la yuca en contra del patógeno. Es importante notar que las secuencias con las que se hizo el análisis funcional pertenecen a un porcentaje inferior al 30% de las secuencias aisladas para ambas variedades, el 64% de las secuencias aisladas tanto en MBRA 685 como SG 107-35 no presentan función conocida o no tienen secuencias similares en la base de datos del Gen-Bank. Este resultado sugiere que existe un gran	potencial de nuevas secuencias, probablemente específicas de yuca que se expresan en respuesta al ataque de Xam. El análisis funcional permite elaborar un flujo hipotético (figura 1) de la respuesta de defensa de la yuca a la infección por Xam. Una vez el patógeno ha sido reconocido se desencadenan una serie de respuestas locales para impedir su dispersión, la primera de ellas es la síntesis de ROS que está altamente controlada durante el proceso de infección por proteínas como CAT1 y NDPKs. En algún momento de la infección, tal vez en sus etapas tempranas, la célula aumenta su metabolismo, por ejemplo el tráfico vesicular, y protege sus enzimas del estrés oxidativo induciendo la expresión de glutarredoxinas. Cuando el ataque del patógeno es más fuerte, la célula activa el proceso contrario y entonces muchas vías de señalización son activadas, entre ellas las mediadas por calcio, que resultan en la expresión de genes PR como el Betv1 y los LPTs y la inducción (conjuntamente con ROS) de la HR. Todos estos procesos de activación de genes y control son muy probablemente regulados en gran parte por la expresión de factores de trascripción como los genes MYB y ZFP. Con el fin de inducir rápidamente la HR, complejos de ubiquitina activan vías de señalización mediadas por degradación proteica y las metaloproteinasas podrían atacar directamente al patógeno. Es importante aclarar que el flujo hipotético no pretende mostrar cómo se suceden los eventos de respuesta al patógeno en el tiempo, además, por ser hipotético, cada una de las vías que se muestran deben ser confirmadas con otros experimentos. Sin embargo, es el primer modelo hipotético de respuesta de defensa de la yuca al ataque por Xam, y ahí radica su valor. Identificación de genes expresados diferencialmente usando microarreglos Con el fin de confirmar la expresión diferencial de los genes aislados en la librería sustractiva, fue construido un microarreglo de ADNc y evaluado con plantas sanas vs. plantas infectadas y colectadas después de 24 y 48 h. El análisis de datos reveló que 9 genes (5 genes después de 24h y 4 genes después de 48h) se encuentran diferencialmente expresados durante la respuesta de defensa de la yuca contra la infección por Xam,
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Figura 1. El modelo hipotético basado en secuencias aisladas en la sustracción muestra la posible ubicación de las secuencias aisladas en la librería sustractiva (en verde) en las vías de respuesta de defensa al ataque por Xam. Una vez se ha hecho el reconocimiento entre los genes avrdel patógeno y R de la planta se inicia una serie de respuestas de defensa. Posiblemente en los estados iniciales de infección la célula aumenta su metabolismo y tráfico vesicular (expresión de SUS14) al tiempo que protege sus proteínas del estrés oxidativo (expresión de SUS04). A medida que la infección avanza se activan señales de transducción (como las mediadas por calcio, SUS01) que refuerzan la síntesis de ROS y la inducción de HR. Los factores de transcripción como MYB (SUS09) y ZFP (SUS10) inducen la expresión de genes PR (SUS05, SUS06), se activan las vías de ubiquitinación (SUS11, SUS12) y degradación proteica (SUS13), así como la modificación de la pared celular (SUS08). En tiempos específicos durante la enfermedad, la síntesis de ROS es controlada por catalasas (SUS02) y NDPKs (SUS03). Las flechas punteadas indican relación entre dos procesos que podría no ser necesariamente directa.
entre ellos la glutarredoxina (SUS04), el gen PR (SUS06), el factor de transcripción Dedo de Cinc (SUS10), la ubiquitina (SUS11), genes de Arabidopsis con función no conocida (A.th) y algunos genes que no presentan similitud en las bases de datos (NH) (tabla 2). En el futuro podría ser interesente evaluar otros tiempos de infección usando microarreglos, de forma que pueda ser caracterizada en detalle la expresión de genes en las respuestas de defensa para este importante cultivo. En orden a seleccionar fuertes genes candidatos que puedan ser utilizados en posteriores estudios de transformación genética o silenciamiento de genes, recientemente se han validado estos y otros genes diferencialmente expresados encontrados en otros experimentos, usando la tecnología de PCR en Tiempo Real (RT-PCR). La correspondencia encontrada entre los resultados de microarreglos y RT-PCR fue del 100% (López etál., 2005).	Tabla 2. Resumen de estadísticos para el programa SAM y nœmero de genes diferencialmente expresados a 24 y 48h durante la infección por Xam
	Expresión 24h 48h Delta 1.23 1.41 Tasa sobreexpresión 2 2 No. Falsos 0 0 Significativos Genes activado 5 4 Genes reprimidos 0 0
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CONCLUSIONES Con este estudio se ha logrado el primer acercamiento al conocimiento de los patrones de expresión génica que están asociados con las respuestas de defensa de la yuca a la bacteriosis vascular. Muchas vías de señalización dirigen respuestas como estrés oxidativo, inducción de genes PR y factores de transcripción, modificaciones de la pared celular y regulación del tráfico de proteínas. Se ha demostrado que la genómica funcional y sus tecnologías de alto alcance pueden ser de gran utilidad para avanzar hacia la solución de problemas en cultivos de alto interés económico en Colombia. REFERENCIAS Baker, B.; Zambryski, R; Staskawicz, B.; Dineshkumar S.P. 1997. Signaling in Plant-Microbe Interaction. Science. 276: 726-733. Blokhina, O.; Virolainen, E.; Fagerstedt, K.V. 2003. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Annals of Botany. 91: 179-94. Boher, B.; Nicole, M.; Potin, M.; Geiger, J.P. 1997. Extracellular Polysaccharides from Xanthomonas axonopodis pv. manihotis Interact with Cassava Cell Walls During Pathogenesis. Molecular Plant Microbe Interaction. 10: 803-811. Borsics, T.; Lados, M. 2002. Dodder infection induces the expression of a pathogenesis-related gene of the family PR-10 in alfalfa. Journal of Experimental Botany. 53(375): 1831-1832. Bufe, A.; Spangfort, M.D.; Kahlert, H.; Schlaak, M.; Becker, W.M. 1996. The major birch pollen al-lergen, Bet v 1, shows ribonuclease activity. Planta. 199(3): 413-5. Callis, J.; Vierstra, R.D. 2000. Protein degradation in signaling. Current Opinión in Plant Biology. 3(5): 381-386. Cao, H.; Glazebrook, J.; Clarke J.D.; Volko, S.; Dong, X. 1997. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cell. 88(1): 57-63. Clouse, S.D.; Sasse, J.M. 1998. BRASSINOSTEROIDS: Essential Regulators of Plant Growth and Development. Annual Review in Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 49: 427-451.	Cosgrove, D.J. 2000. Expansive growth of plant cell walls. Plant Physiology and Biochemistry. 38(1): 109-24. Cunnea, P.M.; Miranda-Vizuete, A.; Bertoli, G.; Simmen, T.; Damdimopoulos, A.E.; Hermann, S.; Leinonen, S.; Huikko, M.P.; Gustafsson, J.A.; Sitia, R.; Spyrou, G. 2003. ERdj5 an endoplasmic reticulum (ER)-resident protein containing DnaJ and thioredoxin domains, is expressed in secretory cells or following ER stress. Journal in Biological Chemistry. 278(2): 1059-1066. Chamnongpol, S.; Willekens, H.; Moeder, W.; Langebartels, C.; Sandermann, H.; Van Montagu, M.; Inze, D.; Van Camp, W. 1998. Defense activation and enhanced pathogen tolerance induced by H2O2 in transgenic tobáceo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 95(10): 5818-23. Chen, W.; Provart, N.J.; Glazebrook, J.; Katagiri, F.; Chang, H.S.; Eulgem, T.; Mauch, F.; Luan, S.; Zou, G; Whitham, S.A. 2002. Expression profile matrix of Arabidopsis transcription factor genes suggests their putative functions in response to environmental stresses. The Plant Cell. 14: 559-574. Delorme, V.G.; McCabe, P.F.; Kim, D.J.; Leaver, C.J.; 2000. A matrix metalloproteinase gene is expressed at the boundary of senescence and programmed cell death in cucumber. Plant Physiology. 123(3): 917-927. Ellis, C.; Turner, J.G.; Devoto, A. 2002. Protein complexes mediate signalling in plant responses to hormones, light, sucrose and pathogens. Plant Molecular Biology. 50(6): 971-980. Grant, C.M. 2001. Grant and Loake Role of the glutathione/glutaredoxin and thioredoxin systems in yeast growth and response to stress conditions. Molecular Microbiology. 39(3): 533-541. Grant, J.J.; Loake, G.J. 2000. Role of Reactive Oxygen Intermediates and Cognate Redox Sinaling in Disease Resistance. Plant Physiology. 124: 21-29. Hall, T.C.; Buchbinder, B.U.; Pyne, J.W.; Sun, S.M.; Bliss, F.A. 1978. Messenger RNA for GI protein of french bean seeds: cell free translation and product characterization. Proceedings of the National Academy of Science USA. 75: 3196-3200. Hammond-Kosack, K.E.; Jones, J.D. 1996. Resistance Genedepent Plant Defensa Response. Plant Cell. 8: 1773-1791. Harrington, C.A.; Rosenow, C.; Retief, J. 2000. Monitoring genes expression using DNA microarrays. Current Opinión in Microbiology. 3: 285-291.
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