Publicado

2006-07-01

Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae

Inducing defence enzymes in two rice (Oryza sativa) varieties by G. mosseae arbuscular mycorrhizal fungus

Palabras clave:

peroxidasa, polifenoloxidasa, quitinasa, (3-1,3 glucanasa y fenilalanina amonio liasa, peroxidase, polyphenoloxidase, chitinase, (3-1,3 glucanase and phenylalanine ammonium lyase (es)

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Autores/as

  • Yakelín Rodríguez Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas
  • Arais Fernández Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
  • Belkis Peteira Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
  • Félix Fernández Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
  • Ernestina Solórzano Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
Entre los beneficios que los hongos micorrízicos arbusculares proporcionan a las plantas se encuentra la protección contra patógenos, fundamentalmente radicales. Por lo que fue objetivo de este trabajo comparar el efecto de uno de estos hongos, Glomus mosseae, en la inducción de respuestas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa), LP-7 y J-104. Para lo cual se determinaron, tanto en tejido radical como foliar, las activida­des enzimáticas de peroxidasa, polifenoloxidasa, quitinasa, (3-1,3 glucanasa y fenilalanina amonio liasa; así como la expresión isoenzimática de peroxidasas y polifenoloxidasas. También se evaluaron los porcentajes de colonización micorrízica y densidad visual. Los resultados revelaron que el hongo G. mosseae provocó varia­ciones en las actividades enzimáticas evaluadas, donde se observaron diferencias en el comportamiento entre las variedades según el tiempo de evaluación y el área de la planta estudiada. Las diferencias detectadas en los patrones electroforéticos de peroxidasas y polifenoloxidasas se deben a las variedades y no al efecto de la micorrización. En general, la variedad de arroz LP-7 mostró una respuesta satisfactoria a la inoculación con el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae, manifestando una mayor inducción de mecanismos defensivos, por lo que pudieran alcanzarse los mejores resultados aplicando esta combinación en cuanto a protección del cultivo. Palabras clave: peroxidasa, polifenoloxidasa, quitinasa, (3-1,3 glucanasa y fenilalanina amonio liasa.
Protecting plants against fundamentally radical pathogens is one of arbuscular mycorrhizal fungi's benefits. This work was aimed at comparing the effect of one such fungus (Glomus mosseae) on inducing a defensive response in two rice (Oryza sativa) varieties (LP-7 and J-104). Peroxidise, polyphenoloxidase, chitinase, (3-1,3 glucanase and phenylalanine ammonium lyase enzymatic activity and peroxidase and polyphenoloxidase isoenzymatic expression were determined in both radical and foliar tissues. Mycorrhizal colonisation and visual density percentage were also evaluated. The results revealed that the G. mosseae fungus caused variations in enzymatic activity. Differences were observed in the two varieties behaviour patterns according to evaluation time and plant área studied. The differences detected in peroxidase and polyphenoloxidase electrophoretic patterns were due to the varieties and not to mycorrhisation effect. Rice variety LP-7 generally presented a successful response to inoculation with the G. mosseae arbuscular mycorrhizal fungus, manifesting higher defence mechanism induction. The best results for protecting crops could thus be obtained by using this combination. Key words: peroxidase, polyphenoloxidase, chitinase, (3-1,3 glucanase and phenylalanine ammonium lyase.
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INDUCCIÓN DE ENZIMAS DE DEFENSA EN DOS VARIEDADES DE ARROZ (ORYZA SATIVA)
Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular
G. mosseae
Inducing defence enzymes in two rice (Oryza sativa) varieties by G. mosseae arbuscular mycorrhizal fungus
Yakelín Rodríguez*, Aráis Fernández**, Ernestina Solórzano**, Belkis Peteira**,
Félix Fernández*
RESUMEN
Entre los beneficios que los hongos micorrízicos arbusculares proporcionan a las plantas se encuentra la protección contra patógenos, fundamentalmente radicales. Por lo que fue objetivo de este trabajo comparar el efecto de uno de estos hongos, Glomus mosseae, en la inducción de respuestas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa), LP-7 y J-104. Para lo cual se determinaron, tanto en tejido radical como foliar, las activida­des enzimáticas de peroxidasa, polifenoloxidasa, quitinasa, (3-1,3 glucanasa y fenilalanina amonio liasa; así como la expresión isoenzimática de peroxidasas y polifenoloxidasas. También se evaluaron los porcentajes de colonización micorrízica y densidad visual. Los resultados revelaron que el hongo G. mosseae provocó varia­ciones en las actividades enzimÆticas evaluadas, donde se observaron diferencias en el comportamiento entre las variedades según el tiempo de evaluación y el área de la planta estudiada. Las diferencias detectadas en los patrones electroforØticos de peroxidasas y polifenoloxidasas se deben a las variedades y no al efecto de la micorrización. En general, la variedad de arroz LP-7 mostró una respuesta satisfactoria a la inoculación con el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae, manifestando una mayor inducción de mecanismos defensivos, por lo que pudieran alcanzarse los mejores resultados aplicando esta combinación en cuanto a protección del cultivo. Palabras clave: peroxidasa, polifenoloxidasa, quitinasa, (3-1,3 glucanasa y fenilalanina amonio liasa.
ABSTRACT
Protecting plants against fundamentally radical pathogens is one of arbuscular mycorrhizal fungi's benefits. This work was aimed at comparing the effect of one such fungus (Glomus mosseae) on inducing a defensive response in two rice (Oryza sativa) varieties (LP-7 and J-104). Peroxidise, polyphenoloxidase, chitinase, (3-1,3 glucanase and phenylalanine ammonium lyase enzymatic activity and peroxidase and polyphenoloxidase isoenzymatic expression were determined in both radical and foliar tissues. Mycorrhizal colonisation and visual density percentage were also evaluated. The results revealed that the G. mosseae fungus caused variations in enzymatic activity. Differences were observed in the two varieties behaviour patterns according to evaluation time and plant área studied. The differences detected in peroxidase and polyphenoloxidase electrophoretic patterns were due to the varieties and not to mycorrhisation effect. Rice variety LP-7 generally presented a successful response to inoculation with the G. mosseae arbuscular mycorrhizal fungus, manifesting higher defence mechanism induction. The best results for protecting crops could thus be obtained by using this combination.
Key words: peroxidase, polyphenoloxidase, chitinase, (3-1,3 glucanase and phenylalanine ammonium lyase. Recibido: julio 27 de 2006 Aceptado: septiembre 04 de 2006
* Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas. Carretera de Tapaste, km 3 1/4, San José de Las Lajas, La Habana, Cuba. Correo electrónico: yakelin@inca.edu.cu yakelinry@yahoo.com
** Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria. Carretera de Jamaica, San JosØ de Las Lajas, La Habana, Cuba.
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INTRODUCCIÓN
El amplio uso de los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) como biofertilizantes en la ac­tualidad estÆ encaminado a promover la sostenibilidad de los sistemas agrícolas desde el punto de vista productivo, ecológico, económico y social, premisas de la agricultura orgÆnica; princi­palmente si tenemos en cuenta los precios tan elevados de los productos químicos, la ineficacia en algunos casos de éstos y la contaminación am­biental que afecta al hombre, animales y plantas. Estos microorganismos rizosfØricos proporcionan numerosos beneficios a las plantas que colonizan, entre ellos estimula el crecimiento en suelos con bajo contenido de nutrientes por lo que aumentan los rendimientos del cultivo, confiere cierta protec­ción contra patógenos radicales y favorece la absorción de nutrientes minerales y del agua (Linderman, 1994; Pozo, etál., 1999; García-Garri­do and Ocampo, 2002).
Por otra parte, entre los factores que afectan la producción arrocera en Cuba se encuentra el ata­que de plagas y enfermedades, ademÆs de los daæos ocasionados por las condiciones ambienta­les adversas. Para tratar de dar solución a este problema se ha trabajado en la obtención de nue­vas variedades más resistentes, fue así como surgió la variedad LP-7, obtenida por el Departamento de Mejoramiento GenØtico del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). Esta variedad se desta­ca por su buen rendimiento en diferentes Æreas afectadas por la salinidad donde ha sido evaluada, superando a la J-104 que tiene su mismo ciclo y es la más extendida en el país, mostrando además, adecuado comportamiento ante el ataque de Sterneotarsonemus spinki Smiley y resistencia in­termedia a Pyhcularía grísea Sacc (GonzÆlez, et Æl., 2002).
En este contexto, la inoculación con los HMA podría ser una alternativa que potencie el uso de estas nuevas variedades, así como el de las varie­dades comerciales en explotación, entre las cuales se destaca la J-104 que es susceptible a un gran número de patógenos. El exitoso establecimiento y funcionamiento de esta simbiosis pudiera revertirse en un incremento de los rendimientos agrícolas e influir positivamente en la respuesta de las plantas al ataque de patógenos.
Estos hongos al interactuar con las plantas provocan cambios citológicos y metabólicos en las cØlulas hospederas, estando asociadas algunas de las modificaciones bioquímicas con alteraciones en los niveles de ciertos compuestos secundarios y enzimas involucradas en la defensa; aunque la res­puesta es de menor magnitud en comparación con la patogØnica, ademÆs de ser transiente (Salzer and Boller, 2000). Entre estas enzimas se destacan las peroxidasas, polifenoloxidasas, quitinasas, (3-1,3 glucanasas y fenilalanina amonio liasas (PAL), cu­yas actividades y expresión en algunos casos se ha detectado que sufren variaciones en raíces mi-corrizadas de tomate, alfalfa, fríjol y ajo (Blee and Anderson, 1996; Harrison and Dixon, 1993; Pozo, et Æl., 1998; Spanu and Bonfante-Fasolo, 1988; Spanu, et Æl., 1989).
Por lo que fue objetivo del presente trabajo estudiar la inducción de mecanismos de defensa en dos variedades de arroz (J104 y LP7) al ser ino­culadas con el HMA Glomus mosseae, a travØs del comportamiento de cinco sistemas enzimÆticos (peroxidasas, polifenoloxidasas, quitinasas, (3-1,3 glucanasas y PAL) y la expresión isoenzimática de peroxidasas y polifenoloxidasas, en la etapa donde más frecuentemente ocurre la invasión de patógenos en este cultivo.
MATERIALES Y MÉTODOS Material fœngico y vegetal
Para la realización del experimento se utiliza­ron plÆntulas de arroz de las variedades J-104 y LP-7, cuyas semillas fueron suministradas por la Estación Experimental de Arroz "Los Palacios", Pi­nar del Río, y por el Departamento de Mejoramiento GenØtico del INCA, La Habana, respectivamente. El HMA inoculado fue Glomus mosseae (Nicol. & Gerd emendado por Gerdeman & Trappe), proce­dente del cepario del INCA (INCAM 2). AdemÆs, se estudió un tratamiento control sin inocular de cada variedad de arroz.
La siembra se efectuó en cajuelas metálicas (75 cm x 50 cm x 10 cm) que contenían una mezcla de suelo ferralítico rojo (Hernández, et ál., 1999) y cachaza en la proporción 1:1 (v:v), estériles ambos, empleando la tØcnica de recubrimiento de las semi­llas con un 10% de inoculo respecto al peso seco de las mismas. El inoculo poseía 250 esporas g1.
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Condiciones de crecimiento y muestreo
Las plÆntulas crecieron en condiciones semicontroladas de casa de cristal a temperatura de 23 °C +/- 2 °C, humedad relativa entre 80-85% e iluminación natural, siendo fertilizadas con nitróge­no (urea) a los 15 y 28 días de germinadas, a razón de 10 g por cajuela.
La toma de muestras se realizó a los 30 y 35 días de germinadas las semillas que es el período más susceptible de sufrir ataques de patógenos fœngicos. Tanto en la zona aØrea como radical se determinaron las actividades enzimÆticas de peroxidasas, polifenoloxidasas, quitinasas, p 1-3 glucanasas y PAL; así como los patrones isoenzimÆticos de peroxidasas y polifenoloxidasa.
Evaluaciones fœngicas
Aproximadamente 200 mg de raicillas fueron cuidadosamente lavadas, secadas a 70 °C y teni­das segœn Phillips and Hayman, (1970) para analizar los porcentajes de colonización micorrízica y den­sidad visual mediante el procedimiento descrito por Herrera, (1995).
La determinación de la densidad visual se basa en la evaluación de la intensidad de la colonización en seis niveles (0-5), para cada intercepto y se cal­culó según la ecuación:
%DV= -§f-
M pH 5.2 conteniendo polivinilpirrolidona 5% y (3-mercaptoetanol 0.05%), en proporción 1:1 (p:v). El homogenato se agitó en zaranda durante 45 min. en baño de hielo. Posteriormente se filtró a través de cuatro capas de gasa y se centrifugó a 14 000 gra­vedades a 4 °C durante 25 min. en centrífuga refrigerada (Beckman, modelo J2-21). El sobrenadante obtenido se usó para determinar las actividades enzimÆticas y para el anÆlisis de isoenzimas. La concentración de proteínas se de­terminó por el método de Bradford (Bradford, 1976) en un espectrofotómetro (Ultrospec 2100 pro).
Actividad peroxidasa
La cuantificación de esta actividad se realizó segœn mØtodo continuo descrito por Frick (1976), donde se utilizaron como sustratos el guayacol y el peróxido de hidrógeno. Para ello se determinó la velocidad de la reacción de oxidación del guayacol por la enzima, en presencia de peróxido de hidró­geno, midiendo la absorbancia a 470 nm (zona del espectro donde absorbe el guayacol oxidado de coloración carmelita). Se tomó la variación de den­sidad óptica en el tiempo (AD.O.)/(At), durante un minuto a intervalos de 5 segundos.
El cÆlculo de la actividad enzimÆtica para este método continuo se realizó según la expresión:
Actividad enzimÆtica =
AD.O . 1 . Vens . dil. At k Venz
donde: Z es el nœmero de interceptos contados en cada nivel
A es el porcentaje de intensidad de la colonización
Donde: k es el coeficiente de extinción molar del guayacol que es 5570 x 10~6 u.mol. mL~1
Vens- el volumen del ensayo, Venz- el volumen de enzima dil- la dilución de la muestra.
A0 = Z0* 0%, A1 = Z1*1 %,          A2 = Z2* 2.5%,
A3 = Z3* 15.5%, A4 = Z4 * 35.5%, A5 = Z5 * 47.5%
Extracción y cuantificación de proteínas
La obtención del extracto enzimático foliar y radical se realizó según el protocolo descrito por Solórzano (1997), procesándose tres réplicas en cada caso. El material vegetal se maceró en nitró­geno líquido y se homogenizó con solución amortiguadora de extracción (acetato de sodio 0.1
La actividad enzimática se expresó como u.moles de producto formado/ min/ mL enz.
Polifenoloxidasa
Para la determinación de esta actividad enzi­mática se procedió según el método continuo descrito por Alexander (1964), donde el sustrato empleado fue el pirogallol. La velocidad de la reac­ción de oxidación del pirogallol por la enzima, se registró a 420 nm (donde absorbe el pirogallol oxi-
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dado de coloración amarilla). Al igual que en la acti­vidad peroxidasa, la variación de densidad óptica en el tiempo (AD.O.)/(At) se determinó durante un mi­nuto a intervalos de 5 segundos, la actividad enzimática se calculó de la misma forma y se ex­presó como AD.O. / ¿sil min / mL enz, al no contar con el coeficiente de extinción molar del pirogallol.
Quitinasa
La actividad quitinasa se determinó según el mØtodo colorimØtrico, discontinuo, descrito por Boller, et ál. (1983), donde se utilizó como sustrato la quitina coloidal obtenida a partir de quitina (reactivo Fluka). La misma fue medida a 585 nm. Para realizar la curva patrón se utilizó una solución de n-acetil glucosamina (1 mg. mL1), a partir de la cual se prepararon las diluciones, a las que se les realizó el mismo procedimiento. Posteriormente, la actividad se calculó según la expresión:
D.O. Cot . Vens . dil.
(1971), que utiliza como sustrato la fenilalanina. En este caso la velocidad de la reacción se calculó a partir de las lecturas de absorbancia a 275 nm, don­de se mide el Æcido cinÆmico formado. Este mismo reactivo fue utilizado para hacer la curva patrón.
El cálculo y la expresión de esta actividad fue­ron igual que para la quitinasa.
La actividad específica en todos los casos se determinó de la siguiente forma:
Act. Específica = Actividad enzimática/ con­centración de proteína
Y se expresó como UAE. mg proteina1. Análisis estadístico
Los datos del porcentaje de colonización micorrízica fueron transformados por la función 2arcsenVx. Los mismos, ademÆs de los de densi­dad visual y actividades específicas fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) de clasificación simple siguiendo un diseæo completamente aleatorizado. Las medias con diferencias significati­vas se compararon segœn el test de Rangos Mœltiples de Duncan 005. Para el procesamiento estadístico se utilizó el software SPSS, versión 7.5.
Estudio de los patrones isoenzimÆticos
Se analizó la expresión de las isoenzimas peroxidasas y polifenoloxidasas. Las electroforesis en geles de poliacrilamida (reactivo Fluka) en con­diciones no desnaturalizantes fueron realizadas en equipo de electroforesis vertical minigel (BIORAD), según metodología desarrollada por Maribona, et Æl. (1983) con las siguientes modificaciones: gel concentrador 4% y gel separador 7,5%. Se emplea­ron separadores de 0.75 mm.
En cada pocillo se depositó 10 u.g de proteína por muestra, las cuales contenían en su solución amortiguadora glicerol al 0.05% y una pizca de bromofenol azul, este œltimo empleado para mar­car el frente de corrida.
Las electroforesis se corrieron a 25 mA, duran­te 60 - 90 minutos a 4 °C. Se utilizó como solución
Actividad enzimÆtica =
t.incub.           Venz
Donde t incub. es el tiempo de incubación del ensayo
Cot es la cotangente de la curva patrón.
Se expresó como u.moles de producto forma­do/ min/ mL enz.
p-1,3 glucanasa
Para la determinación de esta actividad se mezcló 50 u.L de laminarin ((3-1,3 glucano) ( 2 mg. mL1) y 50 u.L del extracto enzimÆtico, incubÆndose durante 30 min. en baño a 37 °C. Posteriormente se cuantificaron los azœcares reductores formados a 660 nm segœn el mØtodo propuesto por Somogyi (1952). La curva patrón se realizó con el uso de glucosa (1 mg. mL1) como estÆndar, a partir de la cual se prepararon soluciones con distintas concen­traciones.
El cálculo y la expresión de esta actividad fue­ron igual que para la quitinasa, determinando primero la diferencia entre los azœcares reductores forma­dos y presentes en cada extracto.
Fenilalanina amonio liasa (PAL)
La actividad PAL fue cuantificada segœn el mØtodo discontinuo propuesto por Paynet, et Æl.
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amortiguadora de corrida Tris - Glicina 19 mM pH 8.3. Posteriormente se realizaron las determinaciones para las diferentes isoenzimas y las electroforesis fueron repetidas tres veces para cada una.
Los geles se fotografiaron con una cÆmara Nikon F90X y se utilizó una película Konica (100 asa), posteriormente las fotos fueron escaneadas (Acer Slim6).
Peroxidasas
Para la tinción se procedió según lo reportado por Barreto and Simón, (1979). El gel se sumergió en 50 mL de una solución que contenía 5 mL de Æcido acØtico glacial, 0.125 g de benzidina dihidroclórica y 0.5 mL de peróxido de hidrógeno, hasta la aparición de bandas azules entre los 5 - 10 minutos.
Polifenoloxidasas
En la tinción se utilizaron 0.05 g de L-Prolina y 0.1 g de dihidroxifenilalanina (DOPA) disueltos en 50 mL de solución amortiguadora fosfato de sodio 0.1 M pH 6.5 segœn Standford and Galston, (1970). Para la aparición de las bandas carmelitas se incu­bó en la oscuridad durante 2 - 3 horas.
Para detener ambas reacciones se utilizó áci­do acØtico al 10% y los geles se lavaron con agua destilada.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Colonización fúngica
En la tabla 1 se muestran los porcentajes de colonización micorrízica y de densidad visual de los tratamientos evaluados en el presente estudio, don­de no se observó presencia fúngica en las plantas controles puesto que las mismas no fueron inocu­ladas con el hongo, el sustrato utilizado se esterilizó previamente y las semillas fueron desinfectadas superficialmente antes de la siembra.
Los tratamientos inoculados no mostraron di­ferencias significativas en el porcentaje de colonización micorrízica con valores de 24 y 26%, sin embargo en la densidad visual se observaron diferencias significativas alcanzando el valor supe­rior la variedad LP-7 inoculada, con un 0.45%. Estos resultados demuestran que las plantas de arroz se micorrizaron en los tratamientos donde se inoculó el hongo, mostrando las raíces de la variedad LP-7 una mayor ocupación fúngica, posiblemente propi­ciado por las propias condiciones en que se desarrolló el estudio.
Actividades enzimÆticas en el tejido radicular Peroxidasas y polifenoloxidasas
La actividad peroxidasa (PX) (figura 1) en las raíces inoculadas con el HMA, a los 30 días au­mentó para ambas variedades destacándose la
Tabla 1. Porcentajes de colonización micorrízica y densidad visual en raíces de arroz controles e inoculadas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 días después de la germinación.
Tratamientos
% Colonización micorrízica
% Densidad visual
Control LP-7
0b
0c
LP-7 + MA
26±0.014a
0.45±0.006a
Control J-104
0b
0c
J-104 + MA
24±0.009a
0.33±0.008b
Sig.
*
*
Medias seguidas por letras comunes no presentan diferencias significativas segœn la prueba de Duncan 005.
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J-104; mientras que a los 35 días en la variedad LP-7 disminuyó y en la J-104 aumentó triplicando el valor de las plantas controles.
observaron diferencias significativas entre los valo­res de las raíces inoculadas y sin inocular de la variedad J-104. A los 35 días el comportamiento fue similar al de la actividad peroxidasa, mostrando las raíces micorrizadas una disminución en la va­riedad LP-7 y un incremento en la J-104.
Las enzimas PXs (EC 1.11.1.7) y PPOs (EC 1.10.3.1 y EC 1.10.3.2) forman parte del sistema antioxidante de las plantas, estando involucradas en el proceso de reconocimiento y en la defensa frente a cualquier situación estresante para las mismas. La participación de ambos sistemas ha sido descrita tanto en interacciones patogénicas (García-Garrido and Ocampo, 2002; Kazan, et ál, 1998; Solórzano, et Æl., 2004), como en las mutualistas, tal es el caso de la simbiosis Rft/zo¿>/i/m-leguminosa (Salzzwedel and Dazzo, 1993) así como la formación de ectomicorri-zas (Albretch, et Æl., 1994).
En cuanto a las asociaciones micorrízicas arbusculares la mayoría de los trabajos realizados muestran incrementos de estas enzimas, de carÆc­ter transitorio y localizado en raíz, en etapas iniciales de la colonización de diferentes cultivos (Fries, et Æl., 1996; Ikram, et Æl., 1998; Spanu and Bonfante-Fasolo, 1988). Sin embargo, algunos autores han encontrado aumentos en las actividades PX y PPO radical en estadios avanzados de la simbiosis, fun­damentalmente en tomate (Mathur and Vyas, 1995; Pérez, etál, 2004a; Rodríguez, etál, 2001).
En este trabajo las evaluaciones se realizaron en un período avanzado, donde el hongo debe en­contrarse ya establecido en el sistema radical, aunque el proceso de colonización puede acortar­se o extenderse en dependencia de la cepa fœngica, del cultivo y la variedad estudiados.
Los incrementos observados, fundamental­mente en la actividad PX, en las plantas micorrizadas, parecen ser producto de la respues­ta típica de la planta ante la llegada de un agente, en principio, "extraño". Dicha respuesta involucra la síntesis de especies reactivas de oxígeno como radicales superóxido (O2~) y peróxido de hidrógeno (H2O2), que constituyen en bajas concentraciones molØculas seæales pero en mayores concentracio­nes resultan altamente tóxicos para la célula (Doke, et ál, 1996), específicamente las PXs actúan eli­minando estos compuestos. Los incrementos
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Figura 1. Actividad específica peroxidasa en raíces de dos variedades de arroz (LP-7 y J-104) controles e inoculadas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 y 35 días después de la germinación.
Barras con letras comunes no presentan diferencias significati­vas segœn la prueba de Duncan 0.05.
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Figura 2. Actividad específica polifenoloxidasa en raíces de dos variedades de arroz (LP-7 y J-104) controles e ino­culadas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 y 35 días después de la germinación.
Barras con letras comunes no presentan diferencias significati­vas segœn la prueba de Duncan 0.05.
En cambio la actividad específica polifenoloxi­dasa (PPO) (figura 2), a los 30 días, disminuyó en las raíces micorrizadas de la variedad LP-7 y no se
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superiores detectados en las plantas de la varie­dad J-104 sugieren que la colonización de su sistema radical por parte del hongo estudiado su­pone una mayor condición estresante, lo cual apunta hacia una menor compatibilidad de esta variedad con la cepa G. mosseae.
Por otra parte, es necesario destacar los dis­tintos procesos fisiológicos en los que parecen estar implicadas ambas enzimas, como son el reforzamiento de la pared celular por la deposición de lignina y suberina, la acumulación de polifenoles, la formación de estructuras papilares y el entrecru-zamiento de proteínas de pared (Pozo, 1999; Quiroga, et Æl., 2000).
Segœn lo anterior, el hecho que las actividades PX y PPO disminuyan, en general, para la variedad LP-7, resulta conveniente para garantizar el Øxito de la simbiosis y sugiere una mayor compatibili­dad de esta variedad con la cepa fœngica inoculada.
Quitinasas y p-1,3 glucanasas
En la actividad quitinasa (figura 3) a los 30 días, las raíces micorrizadas y sin micorrizar de ambas variedades no presentaron diferencias significativas. Sin embargo, a los 35 días se encontró un aumento de la actividad en las dos variedades, provocado por el hongo, el cual fue mayor en la variedad J-104.
La actividad (3-1,3 glucanasa en raíz (figura 4) se comportó de forma muy similar a la quitinasa en ambos períodos evaluados, coincidiendo, además, que los valores en las plantas de la variedad LP-7 fueron inferiores a los de la J-104 para las dos activi­dades a los 30 días. La única diferencia detectada fue que el incremento de esta actividad a los 35 días en las raíces micorrizadas fue mayor para la varie­dad LP-7.
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Figura 4. Actividad específica [3-1,3 glucanasa en raíces de dos variedades de arroz (LP-7 y J-104) controles e inoculadas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 y 35 días después de la germinación.
Barras con letras comunes no presentan diferencias significati­vas segœn la prueba de Duncan 0.05.
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Las enzimas quitinasas (EC 3.2.1.14) y p 1,3-glucanasas (EC 3.2.1.39) pertenecen a la familia de las hidrolasas, catalizando la hidrólisis de la quitina y los p-1,3-glucanos, respectivamente. Estos polisacÆridos constituyen componentes fundamen­tales de la estructura de la pared celular de los hongos, de ahí que se le atribuya a ambas enzimas un carÆcter antifœngico (Graham L.S. and Sticklen M.B. 1994).
Como se puede apreciar en los grÆficos de estas dos actividades (figuras 3 y 4), estas enzimas presentan cierta actividad constitutiva, lo que no se contradice con la importante función protectora que realizan en las plantas ante los ataques de fitopatógenos, puesto que algunos autores han en­contrado resultados similares en diversos tejidos vegetales (Collinge, et Æl., 1993; Robertus and Hart,
Figura 3. Actividad específica quitinasa en raíces de dos va­riedades de arroz (LP-7 y J-104) controles e inoculadas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 y 35 días después de la germinación.
Barras con letras comunes no presentan diferencias signifi­cativas segœn la prueba de Duncan 0.05.
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1995), por lo que se deduce su participación en pro­cesos de morfogØnesis y en el desarrollo y crecimiento de plantas sanas (SuÆrez, et Æl., 1998).
La inoculación con el hongo micorrízico arbus­cular G. mosseae causó la inducción de las actividades quitinasa y p 1,3-glucanasa en las raí­ces de ambas variedades de arroz, que a pesar de manifestarse sólo en el segundo período evaluativo (35 días), es favorable para estas plantas ya que supone una predisposición de las mismas para en­frentar alguna invasión de patógenos fúngicos que pudiera producirse en la raíz. El comportamiento similar que exhiben ambos sistemas enzimÆticos no es sorprendente debido a la estrecha relación funcional que poseen.
Autores como PØrez, et Æl. (2004b) y Rodríguez, et ál. (2004) realizaron dinámicas de es­tas actividades enzimÆticas, en tomate, y detectaron un comportamiento cíclico de inducción/represión, esto concuerda con los resultados del presente es­tudio, pudiendo constituir la respuesta encontrada uno de estos ciclos. Dichos autores relacionaron este comportamiento con cada ciclo reinfectivo del hongo, donde cada uno involucraría estimulación de estas actividades seguido de represión.
Es necesario añadir que, en raíces micorriza-das, los incrementos en estas dos enzimas han sido asociados con otras funciones como el control del desarrollo del hongo dentro de la raíz, con la morfogØnesis de las distintas estructuras fœngicas durante el establecimiento de la colonización y con la degradación de estructuras fúngicas colapsadas tales como los arbúsculos (Bonfante- Fasolo, 1988; Lambáis and Mehdy, 1993). De igual forma podrían participar en la degradación parcial de la pared ve­getal, facilitando la penetración; así como en la degradación de compuestos que normalmente se acumulan en las interacciones patogØnicas, en caso de formarse (Lambais, 2000).
Fenilalanina amonio liasa (PAL)
En cuanto a la actividad PAL (figura 5) en raíz a los 30 días, se observó que para la variedad LP-7 decreció en el tratamiento micorrizado y en la J-104 no mostró diferencias significativas. A los 35 días esta actividad manifestó la misma tendencia que en
los dos sistemas expuestos anteriormente, mostrÆn­dose incrementos en las dos variedades por efecto delamicorrización.
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Figura 5. Actividad específica fenilalanina amonio Nasa en raí­ces de dos variedades de arroz (LP-7 y J-104) controles e inoculadas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 y 35 días después de la germinación.
Barras con letras comunes no presentan diferencias signifi­cativas segœn la prueba de Duncan 0.05.
La PAL (EC 4.3.1.5) pertenece a la clase de las Nasas y cataliza la primera reacción de la biosíntesis de los fenilpropanoides en plantas su­periores (Lister, et Æl., 1996). Entre estos compuestos se encuentran la lignina, suberina, fitoalexinas, flavonoides y compuestos fenólicos en general, cuya síntesis y acumulación es parte de la estrategia desarrollada por las plantas para evi­tar la invasión de patógenos; siendo, por tanto, la inducción de esta enzima relevante en los meca­nismos de defensa (Espinosa - Victoria, 2000).
Autores como Volpin, et Æl. (1994) encontraron inducción de esta actividad en raíces micorrizadas de alfalfa y lo asociaron con la penetración del hon­go en la raíz, al parecer como respuesta de la planta ante la llegada de este microorganismo, en princi­pio, "extraño". De hecho, Blee and Anderson, 1996 observaron acumulación de transcritos de ARNm de esta enzima sólo en las células que contenían arbœsculos. Estos resultados concuerdan con los incrementos detectados en este estudio.
Sin embargo, los niveles de actividad y transcritos de PAL en raíces micorrizadas son infe-
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riores a los obtenidos en plantas inoculadas con patógenos, al punto que no interfieren en el éxito de la colonización; siendo favorable para las plantas de arroz mantener una cierta activación de ésta y otras enzimas defensivas, pues así se encuentran mejor preparadas para contrarrestar algœn ataque de patógenos que pudiera producirse o responder favo­rablemente ante cualquier situación estresante, condición que propicia la micorrización.
Actividades enzimÆticas en el tejido foliar
La actividad PX en hojas (figura 6) de la varie­dad de arroz LP-7, a los 30 días, no presentó diferencias significativas, pero a los 35 días decre­ció en las plantas micorrizadas. En la variedad J-104 sucedió lo contrario, en el primer período evaluativo disminuyó considerablemente y en el segundo no se manifestaron diferencias entre el tratamiento ino­culado y sin inocular.
y sin inocular, sugieren que no hubo prÆcticamente efecto de la micorrización sobre el sistema antioxidante en hojas; lo cual indica que el estable­cimiento de la colonización micorrízica no provocó un aumento de los procesos oxidativos en las hojas de arroz de las dos variedades estudiadas y, por tanto, no deben producirse los daæos celulares que cualquier situación estresante puede ocasionar.
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Figura 7. Actividad específica polifenoloxidasa en hojas de dos variedades de arroz (LP-7 y J-104) controles e inocu­ladas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 y 35 días después de la germinación.
Barras con letras comunes no presentan diferencias significati­vas segœn la prueba de Duncan 0.05.
AdemÆs, los cambios detectados consistieron fundamentalmente en disminuciones marcadas de la actividad PX (fgura 6) y un ligero incremento de la actividad PPO (figura 7), resultados que reafir­man la idea anterior.
La actividad quitinasa (figura 8) en las plantas inoculadas de ambas variedades se incrementó li­geramente en el primer período de evaluación, pero en el segundo fue notable el aumento observado en la variedad LP-7 mientras que la J-104 no mos­tró diferencias significativas.
El comportamiento de la actividad (3-1,3 glucanasa (figura 9) fue similar al de la quitinasa incrementÆndose en las plantas micorrizadas de ambas variedades a los 30 días, aunque fue más acentuado en la LP-7. A los 35 días sólo hubo au-
Figura 6. Actividad específica peroxidasa en hojas de dos variedades de arroz (LP-7 y J-104) controles e inoculadas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 y 35 días después de la germinación.
Barras con letras comunes no presentan diferencias significati­vas segœn la prueba de Duncan 0.05.
En cuanto a la PPO (figura 7) a los 30 días no se observaron diferencias significativas entre las plantas micorrizadas y las controles, sin embargo a los 35 días se produjo un incremento en la varie­dad J-104.
Las escasas variaciones observadas en es­tas dos actividades, entre los tratamientos inoculados
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En el caso de la actividad PAL (figura 10) a los 30 días se produjo un incremento en las plantas micorrizadas de la variedad LP-7 y un decremento en la J-104, en el segundo periodo evaluativo au­mentó en ambas variedades siendo superiores los valores en la J-104.
Los incrementos observados por efecto de la micorrización, en las tres actividades expuestas anteriormente, superiores en la variedad LP-7 en general, sugieren que estas plantas estÆn mejor preparadas fisiológicamente para enfrentar una in­vasión patogénica que pudiera producirse por la parte aØrea, de forma similar a lo que ocurre en raíz. Esto se debe al importante y conocido papel que juegan estas enzimas en la defensa y que el hongo micorrízico inoculado fue capaz de inducir tanto en raíz como en hojas.
Figura 8. Actividad específica quitinasa en hojas de dos variedades de arroz (LP-7 y J-104) controles e inoculadas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 y 35 días después de la germinación.
Barras con letras comunes no presentan diferencias significati­vas segœn la prueba de Duncan 0.05.
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mento de esta actividad en las plantas de la varie­dad LP-7, la J-104 no presentó diferencias significativas.
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Figura 10. Actividad específica fenilalanina amonio Nasa en hojas de dos variedades de arroz (LP-7 y J-104) contro­les e inoculadas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 y 35 días después de la germinación.
Barras con letras comunes no presentan diferencias significati­vas segœn la prueba de Duncan 0.05.
Las diferencias de las actividades enzimÆticas analizadas en el tejido foliar, entre los controles y los tratamientos inoculados, indican que se mani­festó una respuesta sistémica, puesto que estos cambios se produjeron en sitios alejados de la zona colonizada, la raíz. Además, es importante resaltar que la respuesta de la planta estÆ en dependencia de su compatibilidad con la cepa fœngica implicada, o sea, cada variedad puede mostrar diferente gra-
Figura 9. Actividad específica [3-1,3 glucanasa en hojas de dos variedades de arroz (LP-7 y J-104) controles e inocu­ladas con el HMA Glomus mosseae, a los 30 y 35 días después de la germinación.
Barras con letras comunes no presentan diferencias signifi­cativas segœn la prueba de Duncan 0.05.
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do de aceptación, pudiéramos decir, con el hongo en cuestión.
Existen algunas evidencias que apuntan hacia la inducción de estas enzimas defensivas en toma­te, detectÆndose variaciones en sus actividades en hojas (Solórzano, et ál., 2001; Rodríguez, et ál., 2004).
Los resultados de este trabajo evidencian que las respuestas inducidas en las plantas micorriza-das exhiben patrones paralelos a la causada por bacterias y hongos no patógenos (Cordier, et ál., 1996; St-Arnaud, etál, 1997). Así, de forma análo­ga, las fitohormonas pudieran participar como señales en la simbiosis micorrízica arbscular, ya que son consideradas posibles mediadores en los efec­tos sistØmicos dada su capacidad de ser transportadas a travØs del sistema vascular.
De hecho se han observado alteraciones en los niveles hormonales en plantas micorrizadas, ejemplo de ello lo constituyen el etileno, las citoquininas y algunas auxinas como los Æcidos indolacético, indolbutíricoyabscícico(Besner, and Koide, 1999; Danneberg, etál., 1992; Ludwig -Müller, 2000), pudiendo estar involucradas en el pro­ceso de señalización que conlleva a la respuesta defensiva.
Lo expuesto anteriormente indica la existen­cia de mœltiples mecanismos de intercambio de señales entre la planta y el hongo, que son especí­ficas de este tipo de simbiosis y presentan particularidades en dependencia de la interacción planta-cepa de HMA involucradas. Esto se refleja en los valores diferenciales en las actividades enzimÆticas locales y/o sistØmicas encontradas en este estudio.
G. mosseae, siendo las diferencias detectadas de­bidas a las variedades de arroz y no al efecto de la micorrización.
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Figura11. Patrón isoenzimático de peroxidasas en hojas de dos variedades de arroz (J-104 y LP-7), controles (C) e inocu­ladas con el HMA Glomus mosseae (+MA), a los 30 y 35 días después de la germinación.
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Expresión de isoenzimas Peroxidasas y polifenoloxidasas
Se observaron 9 isoenzimas de peroxidasas en hojas (figura 11) y 7 en raíz (figura 12), mientras que en polifenoloxidasas se detectararon 2 isoenzimas en hojas (figura 13) y 4 en raíz (figura 14). No se encontró inducción de una nueva isoforma por efecto de la inoculación con el HMA
Figura 12. Patrón isoenzimático de peroxidasas en raíces de dos variedades de arroz (J-104 y LP-7), controles (C) e inoculadas con el HMA Glomus mosseae (+MA), a los 30 y 35 días después de la germinación.
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Se indujo respuesta sistémica por parte del hon­go micorrízico arbuscular inoculado en ambas variedades.
No se detectaron isoformas específicas de la simbiosis con actividad peroxidasa o polifeno-loxidasa.
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Figura 13. Patrón isoenzimático de polifenoloxidasas en hojas de dos variedades de arroz (J-104 y LP-7), controles (C) e inoculadas con el HMA Glomus mosseae (+MA), a los 30 y 35 días después de la germinación.
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Figura 14. Patrón isoenzimático de polifenoloxidasas en raíces de dos variedades de arroz (J-104 y LP-7), contro­les (C) e inoculadas con el HMA Glomus mosseae (+MA), a los 30 y 35 días después de la germinación.
CONCLUSIONES
La inoculación del hongo micorrízico arbuscu­lar Glomus mosseae induce activación de enzimas relacionadas con la defensa en plan­tas de arroz, siendo mÆs acentuada en la variedad LP-7, sugiriendo su mejor preparación para contrarrestar un ataque patogØnico.
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Cómo citar

APA

Rodríguez, Y., Fernández, A., Peteira, B., Fernández, F. y Solórzano, E. (2006). Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae. Revista Colombiana de Biotecnología, 8(2), 35–49. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/514

ACM

[1]
Rodríguez, Y., Fernández, A., Peteira, B., Fernández, F. y Solórzano, E. 2006. Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae. Revista Colombiana de Biotecnología. 8, 2 (jul. 2006), 35–49.

ACS

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Rodríguez, Y.; Fernández, A.; Peteira, B.; Fernández, F.; Solórzano, E. Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae. Rev. colomb. biotecnol. 2006, 8, 35-49.

ABNT

RODRÍGUEZ, Y.; FERNÁNDEZ, A.; PETEIRA, B.; FERNÁNDEZ, F.; SOLÓRZANO, E. Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae. Revista Colombiana de Biotecnología, [S. l.], v. 8, n. 2, p. 35–49, 2006. Disponível em: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/514. Acesso em: 28 mar. 2024.

Chicago

Rodríguez, Yakelín, Arais Fernández, Belkis Peteira, Félix Fernández, y Ernestina Solórzano. 2006. «Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae». Revista Colombiana De Biotecnología 8 (2):35-49. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/514.

Harvard

Rodríguez, Y., Fernández, A., Peteira, B., Fernández, F. y Solórzano, E. (2006) «Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae», Revista Colombiana de Biotecnología, 8(2), pp. 35–49. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/514 (Accedido: 28 marzo 2024).

IEEE

[1]
Y. Rodríguez, A. Fernández, B. Peteira, F. Fernández, y E. Solórzano, «Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae», Rev. colomb. biotecnol., vol. 8, n.º 2, pp. 35–49, jul. 2006.

MLA

Rodríguez, Y., A. Fernández, B. Peteira, F. Fernández, y E. Solórzano. «Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae». Revista Colombiana de Biotecnología, vol. 8, n.º 2, julio de 2006, pp. 35-49, https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/514.

Turabian

Rodríguez, Yakelín, Arais Fernández, Belkis Peteira, Félix Fernández, y Ernestina Solórzano. «Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae». Revista Colombiana de Biotecnología 8, no. 2 (julio 1, 2006): 35–49. Accedido marzo 28, 2024. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/514.

Vancouver

1.
Rodríguez Y, Fernández A, Peteira B, Fernández F, Solórzano E. Inducción de enzimas de defensa en dos variedades de arroz (Oryza sativa) por el hongo micorrízico arbuscular G. mosseae. Rev. colomb. biotecnol. [Internet]. 1 de julio de 2006 [citado 28 de marzo de 2024];8(2):35-49. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/514

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