Caracterización molecular de un banco de germoplasma del género Theobroma mediante la técnica RAPD*

Molecular characterisation of a germplasm bank for Theobroma genus using the RAPD technique

Mediante la utilización de marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), se analizaron 145 materiales (128 de T. grandiflorum y 17 de T. bicolor) pertenecientes al banco de germoplasma ex situ del género Theobroma del Instituto Sinchi, localizado en San José del Guaviare. A partir de un número inicial de 20, se seleccionaron los 5 cebadores capaces de generar mayor número de polimorfismos para generar 114 bandas que lograron distinguir entre más del 99% de los materiales analizados: 57 bandas para T. grandiflorum (84,2% polimórficas), 45 bandas para T. bicolor (26,7% polimórficas) y 12 bandas compartidas entre las dos especies (58,3% polimórficas). A partir de la matriz de semejanza generada utilizando el índice de Dice, representada en un dendrograma UPGMA, y el análisis de componentes principales, se determinó un alto grado de semejanza intraespecífica en los materiales analizados, particularmente en T. bicolor. Luego de comparar este análisis con el morfoagronómico previamente realizado en algunos materiales de T. grandiflorum, se encontró que los grupos generados por dicha evaluación morfológica y agronómica son heterogéneos a nivel molecular. La información obtenida se utilizará como herramienta para la toma de decisiones en cuanto a las estrategias de mantenimiento, enriquecimiento y uso del banco. Palabras clave: Theobroma grandiflorum, Theobroma bicolor, RAPD, caracterización molecular.

RAPD markers (Random Amplified Polymorphic DNA) were used for analysing 145 individuals (128 T. grandiflorum and 17 T. bicolor) from the ex situ Theobroma genus germplasm bank at Instituto Sinchi, located at San José del Guaviare. 5 primers able to generated polymorphism were selected from an initial set of 20, generating 114 bands that enable to us to distinguish between more than 99% of individuals analysed: 57 bands for T. grandiflorum (84.2% polymorphic), 45 bands for T. bicolor (26.7% polymorphic) and 12 bands shared between the two species (58.3% polymorphic). A high degree of intra-specific similarity particularly in T. bicolor was established from the similarity matrix obtained by using the Dice index and represented in a UPGMA dendrogram and the principal components analysis (PCA). The comparison of this analysis with a previous morpho-agronomic evaluation of some T. grandiflorum individuals revealed that the groups generated on the basis of its agronomic and morphological traits were heterogeneous at molecular level. The obtained information will be used as a tool in strategies regarding maintenance, enrichment and use of the germplasm bank. Key words: Theobroma grandiflorum, Theobroma bicolour, RAPD, molecular characterisation.

	____________________REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL VI No. 2 Diciembre 2004 15-24 Caracterización molecular de un banco de germoplasma del género Theobroma mediante la técnica RAPD* Molecular characterisation of a germplasm bank for Theobroma genus using the RAPD technique
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	Yovany Moreno** , Luz Marina Melgarejo*** , María Soledad Hernández**** , Lorena Quintero*****, Guillermo Vargas*** RESUMEN Mediante la utilización de marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), se analizaron 145 materiales (128 de T. grandiflorum y 17 de T. bicolor) pertenecientes al banco de germoplasma ex situ del género Theobroma del Instituto Sinchi, localizado en San José del Guaviare. A partir de un número inicial de 20, se seleccionaron los 5 cebadores capaces de generar mayor número de polimorfismos para generar 114 bandas que lograron distinguir entre más del 99% de los materiales analizados: 57 bandas para T. grandiflorum (84,2% polimórficas), 45 bandas para T. bicolor (26,7% polimórficas) y 12 bandas compartidas entre las dos especies (58,3% polimórficas). A partir de la matriz de semejanza generada utilizando el índice de Dice, representada en un dendrograma UPGMA, y el análisis de componentes principales, se determinó un alto grado de semejanza intraespecífica en los materiales analizados, particularmente en T. bicolor. Luego de comparar este análisis con el morfoagronómico previamente realizado en algunos materiales de T. grandiflorum, se encontró que los grupos generados por dicha evaluación morfológica y agronómica son heterogéneos a nivel molecular. La información obtenida se utilizará como herramienta para la toma de decisiones en cuanto a las estrategias de mantenimiento, enriquecimiento y uso del banco. Palabras clave: Theobroma grandiflorum, Theobroma bicolor, RAPD, caracterización molecular. ABSTRACT RAPD markers (Random Amplified Polymorphic DNA) were used for analysing 145 individuals (128 T. grandiflorum and 17 T. bicolor) from the ex situ Theobroma genus germplasm bank at Instituto Sinchi, located at San José del Guaviare. 5 primers able to generated polymorphism were selected from an initial set of 20, generating 114 bands that enable to us to distinguish between more than 99% of individuals analysed: 57 bands for T. grandiflorum (84.2% polymorphic), 45 bands for T. bicolor (26.7% polymorphic) and 12 bands
	* Este artículo corresponde a la presentación en pósterque obtuvo el tercer lugar en la sala de biotecnología agrícola del segundo Congreso Colombiano de Biotecnología. ** Químico, estudiante del programa de maestría en ciencias-bioquímica de la Universidad Nacional de Colombia. Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (Sinchi), Calle 20 No. 5-44, AA.03471, Bogotá, D. C. Colombia. Correo electrónico: p_infestans@yahoo.com *** Bióloga, Dr. Sc. química. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia-Sede Bogotá. Correo electrónico: lmmelgarejom@unal.edu.co **** Bióloga, Dr. Sc. agropecuarias con énfasis en fisiología vegetal. Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (Sinchi), Calle 20 No. 5-44. AA.03471, Bogotá, D.C. Colombia. Correo electrónico: shernandez@sinchi.org.co ***** Bióloga, estudiante del programa de maestría en ciencias agropecuarias con énfasis en fitomejoramiento de la Universidad Nacional de Colombia. Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (Sinchi), Calle 20 No. 5-44. AA.03471 Bogotá, D. C. Colombia. Correo electrónico: lquintero@sinchi.org.co ****** Ingeniero agrónomo, M. Sc. fitotecnia con énfasis en fisiología de cultivo. Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (Sinchi), Estación Experimental "El Trueno", San José del Guaviare, Departamento del Guaviare, Colombia. Correo electrónico: gvargas@sinchi.org.co Recibido: octubre 26 de 2004. Aceptado: octubre 29 de 2004.
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	shared between the two species (58.3% polymorphic). A high degree of intra-specific similarity particularly in T. bicolor was established from the similarity matrix obtained by using the Dice index and represented in a UPGMA dendrogram and the principal components analysis (PCA). The comparison of this analysis with a previous morpho-agronomic evaluation of some T. grandiflorum individuals revealed that the groups generated on the basis of its agronomic and morphological traits were heterogeneous at molecular level. The obtained information will be used as a tool in strategies regarding maintenance, enrichment and use of the germplasm bank. Key words: Theobroma grandiflorum, Theobroma bicolour, RAPD, molecular characterisation.
	INTRODUCCIÓN Al igual que el cacao (Theobroma cacao), el copoazú (T grandiflorum) y el maraco (T bicolor) son árboles tropicales originarios de la región amazónica cuya im­portancia dentro de los sistemas de producción agrí­cola radica en el potencial de sus frutos para obtener pulpas de aroma y sabor agradable que pueden ser utilizados en jugos, jaleas, helados, etc., o en la pre­paración de licores similares a los del cacao de buena calidad (cupulate y bacalate) a partir del proceso de fermentación de sus semillas, particularmente en la región amazónica en donde puede ser cultivado sin alterar el bosque original (Casas, 1995; Urano de Car-valho et al., 1999; Leal et al., 2000). El banco de germoplasma ex situ del género Theobroma, custodiado por el Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (Sinchi), se encuentra localizado en San José del Guaviare (departamento del Guaviare, Colombia) y surge inicialmente como parte de una estrategia de soporte al desarrollo de sistemas productivos alternativos a los cultivos ilíci­tos, por medio de la cual se intenta generar opciones de producción sostenible ambiental y económica­mente, con recursos genéticos caracterizados por material nativo, promisorio y accesibles al cultivador (Vargas y Argüelles, 2000). Actualmente el banco contiene materiales de las especies T. bicolor (5 años de establecido) y T. grandiflorum (19 años de establecido). Debido a la antigüedad del banco de T grandiflorum, no existen los datos de pasaporte de los materiales y se presu­me su procedencia de tres regiones geográficas di­ferentes: Iquitos (Ecuador), Belém do Pará (Brasil) y San José del Guaviare (Colombia) (G. Vargas, co­municación personal). Los materiales fueron clasifi­cados en ecotipos dependiendo de sus característi­cas morfológicas y/o agronómicas: 12 grupos para T. grandiflorum (3001 al 3012) y 4 para T bicolor	(MB1 a MB4), algunos de ellos poseen característi­cas agronómicas de interés para llevar a cabo su explotación comercial (Vargas y Argüelles, 2000; Vargas et al., 2002). Debido a la relevancia y urgencia de utilizar estas especies en la región amazónica, se requiere un nivel más profundo de conocimiento sobre los materiales conservados para escoger aquellos que puedan ser de mayor interés en el enriquecimiento de los sistemas productivos, capaces de soportar la demanda para producción de licor de cacao de buena calidad. El uso de marcadores moleculares para la ca­racterización de bancos de germoplasma es una he­rramienta útil y ventajosa en las labores de evaluación de la variabilidad genética, debido a que los descripto­res morfológicos son sensibles a factores ambienta­les (Charters y Wilkinson, 2000). Se han descrito di­versos tipos de marcadores moleculares: RFLP, SSR, AFLP, RAPD, cada uno con características pro­pias, ventajas y desventajas (ver p. ej. Mueller y Wol-fenbarger, 1999). Su utilización es una alternativa via­ble si los términos de costo, tiempo, simplicidad y reproducibilidad son aceptables. Pueden generar un complemento a la información existente sobre los ma­teriales con el fin de disminuir costos en el manejo del banco y determinar la posible necesidad de realizar nuevas colectas para su enriquecimiento. La técnica RAPD (Random Amplified Poly­morphic DNA) (Williams et al., 1990; Welsh & McCle-lland, 1990) se basa en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Utiliza cebadores cortos (usual-mente 10 pb) y condiciones de reacción poco astrin­gentes para amplificar fragmentos discretos de ADN (Hansen et al., 1998). Ha sido utilizada en varios tra­bajos concernientes a la labor de curación de ban­cos de germoplasma, entre las que se encuentran los de cacao (Wilde, et al., 1992; Lerceteau, et al., 1997a; Lerceteau, et al., 1997b), posee varias de
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	las características mencionadas anteriormente (costo, simplicidad, rapidez) y permite obtener in­formación complementaria requerida, razón por la cual fue seleccionada para realizar la caracteriza­ción molecular, objeto de este trabajo. MATERIALES Y MÉTODOS Material Vegetal. Se utilizaron hojas jóvenes de 150 materiales: 145 pertenecientes al banco de germo-	plasma ex situ del género Theobroma (127 de T. grandiflorum y 17 de T. bicolor), de la estación expe­rimental "El Trueno" del Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (Sinchi) en San José del Guaviare (departamento del Guaviare, Colombia), 4 muestras colectadas de árboles ubicados en Leticia y una en Guainía, que fueron utilizados como mate­riales externos al banco por ser de origen diferente. En la tabla 1 se presenta el sumario de los materiales utilizados para esta caracterización.
	Tabla 1. Listado de los materiales utilizados para la caracterización molecular del banco de germoplasma del género Theobroma custodiado por el Instituto Sinchi. En el caso de los materiales de T. grandiflorum se muestra el número del material seguido del grupo morfoagronómico (# - 30XX) dependiendo de si el material ha sido clasificado
	Theobroma grandiflorum Banco de germoplasma Instituto Sinchi (Número de individuo - grupo morfoagronómico) 1 34 71-3003 94-3005 123 153-3009 178-3009 203 2 35 72 99 125-3001 154-3004 179 205-203 4 36 74-3003 100 126-3001 156-3001 180-3005 206 5 37-3002 75-3002 102-3012 131-3006 157-3001 181 208-3006 8 41 76-3006 103-3012 132-3002 158-3001 182 2158-300118 9-3001 43-3011 79 104 133 163-3007 184 213 13 44 80 106-3004 134-3012 161-3007 185-3007 214 15 45-3003 83 107-3007 135 164 186 217 17 46 85 109-3010 137 166-3009 192-3010 220 19 47 86-3005 111-3003 141 169 194 222 23-3004 48-3003 87-3001 112 143 170-3009 195 170-3009 24 50-3006 88 114-3009 146-3005 171 146-300517 225-3009 26-3002 51-3006 89 115 148-3012 172 197-3001 2197-3001 29 52 91-3005 116-3002 149 173 199 227 31 61 92 119-3005 151-3003 175-3004 151-3003175 228 32-3002 69-3010 93-3008 120-3003 152-3010 177 202 1093-30081 Materiales externos a la colección GG Municipio Calamar, dpto. Guainía (Col.) GOL1 Leticia, dpto. Amazonas (Co l.) GOL 2 Leticia, dpto. Amazonas (Co l.) GLS Leticia, dpto. Amazonas (Co l.) Theobroma bicolor Banco de germoplasma Instituto Sinchi (Ecotipo - número individuo) Ecotipo MB1 Ecotipo MB2 Ecotipo MB3 Ecotipo MB4 B1-1 B2-1 B3-1 B4-1 B1-2 B2-2 B3-2 B1-3 B2-3 B3-3 B1-4 B2-4 B3-4 B1-5 B2-6 B3-6 B1-6 Materiales externos a la colección BLS Leticia, < dpto. Amazonas (Col.)
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	Las hojas fueron colectadas sobre sílica gel y transportadas bajo condiciones refrigeradas hasta el laboratorio en donde fueron lavadas con agua, en­juagadas con etanol al 90%, secadas con una toalla de papel y maceradas en nitrógeno líquido hasta la obtención de un polvo fino, el cual fue almacenado a -70°C para posteriores análisis. Extracción y cuantificación de ADN. Para la ex­tracción de ADN se realizó una modificación del pro­tocolo de Doyle y Doyle (1990). Se adicionaron a 0,2 g de hojas maceradas, 0,8 ml de bufferde extracción (CTAB 3%, NaCl 1,4M, 2-mercaptoetanol 0,2%, PVP-40 1%, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,0) y se dejó incubar a 65 °C durante 60 min. Poste­riormente se realizó una extracción con 0,8 mL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). El ADN se pre­cipitó adicionando 0,6 mL de isopropanol sobre la fase acuosa recuperada por centrifugación a 1800 xg durante 10 min. El precipitado se centrifugó a 7000 xg durante 10 min. Se adicionó 1 mL de solu­ción de acetato de amonio 10 mM en etanol al 76%, y se centrifugó nuevamente a 7000 xg durante 10 min. El pellet obtenido se secó al aire y se resuspen-dió en 50 |jL de buffer TE. Se adicionó 1 |jL de RNa-sa A (10 mg/mL) y se dejó incubar a 37 °C durante 30 min. El ADN fue cuantificado por fluorometría utili­zando Hoescht dye en un fluorómetro DynaQuant 2000 (Hoefer), la calidad fue verificada por electrofo-resis en gel de agarosa al 0,8%, tinción con Bromuro de Etidio y visualización en luz UV. Amplificación de ADN y electroforesis. Después de la evaluación de las concentraciones de ión Mg2+, dNTP y ADN, las amplificaciones fueron llevadas a cabo en Tris-HCl10 mM pH 8,5, KCl 50 mM, 200 |Jv1 de cada dNTP (Invitrogen), 0,8 \iM de cebador de 10 bases (Set R, Operon Technologies Inc), 1,25 U de Taq Polimerasa (Corpogen) y 50 ng de ADN genómi-co en un volumen final de 25 |jL. Las reacciones se realizaron en un termociclador modelo PTC-100 (MJ Research) programado para un paso inicial de dena­turalización a 94 °C durante 3 min. seguido de 46 ci­clos de 1 min. a 94 °C, 1 min. a 36 °C y 2 min. a 72 °C. Un paso final de 10 min. a 72 °C y enfriamiento a 4 °C. En cada grupo de reacciones se incluyeron controles positivos y negativos (ausencia de plantilla de ADN). Los productos de reacción fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1,8% en	buffer TBE 0,5X, durante 150 min. a 5 V/cm, para su visualización con luz UV, previa tinción con bromuro de etidio. Los geles fueron digitalizados utilizando un sistema de análisis Geldoc (Biorad) a partir de los cuales se realizó la lectura de bandas Análisis de datos. Se construyó una matriz de pre­sencias (1) y ausencias (0)a partir de los perfiles de bandas obtenidas para cada cebador con el fin de realizar la comparación entre las muestras. Se tu­vieron en cuenta aquellas bandas que fueran fácil­mente identificables y reproducibles. A partir de di­cha matriz binaria se generó una matriz de semejanzas utilizando el algoritmo de Dice (1945): 2a/(2a+b+c), siendo a el número de bandas pre­sentes en dos individuos (i,j); b el número de ban­das presentes en i y ausentes en j; y c el número de bandas presentes enjy ausentes en i. La matriz de semejanzas fue representada en un dendrogra-ma generado por UPGMA (Unweighted pair-group method). A partir de la matriz de presencias y au­sencias se realizó un análisis de componentes prin­cipales. Los análisis fueron realizados utilizando el programa NTSYSpc v.2.02j. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Extracción de ADN. Se evaluaron inicialmente pro­tocolos ampliamente reportados en la extracción de ADN de múltiples especies vegetales como el de Doyle y Doyle (1990), utilizado previamente para T. grandiflorum por Alves et al. (2003) y el de Dellaporta et al. (1980) reportado por Wilde et al. (1992) en T. cacao. Para T. grandiflorum se obtuvo un rendimien­to de 4,25 |ug de ADN x g "1 y 3,00 ^g de ADN x g "1 respectivamente, los cuales no son satisfactorios para los propósitos requeridos. Posteriormente, se probaron otras modificacio­nes reportadas sobre estos protocolos clásicos (Keb- Llanes et al., 2002; Stein y Raoult, 1992; Szmidt, 2004) y protocolos desarrollados particular­mente para T. cacao (Perry et al., 1998; Couch y Fritz, 1990). En el caso del protocolo de Couch y Fritz (1990), se utilizó únicamente el procedimiento para obtención de pellets nucleares en un buffer a pH 6,0 y posteriormente se extrajo el ADN de los nú­cleos mediante el protocolo de Doyle y Doyle (1990) con el fin generar un procedimiento accesible a las condiciones de laboratorio pues involucraba pasos de purificación de ADN en gradientes de cloruro de cesio. Los resultados obtenidos con estos métodos
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	no fueron tampoco aceptables, en la mayoría de los casos por su rendimiento con valores similares o menores a los obtenidos inicialmente o por la calidad del ADN obtenido (degradación) por la modificación del protocolo de Couch y Fritz (1990). Las diferencias relacionadas con los protocolos reportados previamente para estas especies o su especie relacionada sugieren que las condiciones ambientales, incluyendo el manejo cultural de los materiales, puede ser un factor clave en el estableci­miento de protocolos de extracción de ADN. Los re­sultados obtenidos sugerían que el control de la oxi­dación fenólica no era el paso relevante a superar, como se ha planteado para el caso particular de T. cacao (Fritz y Couch, 1990) y que ha sido observado posteriormente en nuestro laboratorio con el proto­colo final obtenido; para ello se utilizó p-mercaptoe-tanol al 0,2% y PVP al 1% en los tampones de ex­tracción de manera que se evitó eficientemente dicha oxidación en los procedimientos de extracción de ADN de T. grandiflorum y T. bicolor. Posterior­mente, el paso crucial correspondía a la separación de proteínas y carbohidratos del ADN. De acuerdo con lo anterior, se elevó la concen­tración del detergente CTAB del 2 al 3% en el buffer de extracción de Doyle y Doyle (1990) tal como lo su­gieren dichos autores. Esta modificación permitió ex­traer ADN de T. grandiflorum y T. bicolor de manera eficiente, aumentándose la cantidad de ADN extraí­do por el método convencional de Doyle y Doyle (1990) de 4,25 \ig de ADN xg"1a 30,3 \ig de ADN x g-1 con esta modificación. Aumentar la cantidad de CTAB en valores mayores al 3% no mostró mejores resultados debido a que la manipulación de las	soluciones de extracción se torna más difícil por au­mento en su viscosidad, lo que genera pérdidas. El ADN obtenido fue de alta calidad, digerible y amplificable, apto para sus posteriores análisis. La utili­zación de volúmenes menores a los utilizados en el protocolo original ahorra en materiales y reactivos, y permite el procesamiento de hasta 48 muestras al día. Selección de cebadores y adecuación de las con­diciones de amplificación. Se probaron inicialmente 20 cebadores denominados OPR-01 a OPR-20 (set R, Operon Technologies Inc.) con el fin de evaluar su capacidad para generar patrones complejos de ban­das en ADN extraído de los materiales 163-3007 de T. grandiflorum y MB3-6 de T. bicolor. Con excepción de los cebadores OPR-17 y OPR-18, todos los ceba­dores evaluados generaron patrones de bandeo en­tre 200 y 2000 pb con estos materiales. Se seleccionó el primer OPR-12 para llevar a cabo el proceso de adecuación de las condiciones. Para esto se evaluaron los parámetros de concentra­ción de ión Mg2+, de dNTP, y la relación de concentra­ciones de cebador y ADN por variación en la concen­tración de este último. La concentración de ión Mg2+ fue el parámetro que mayor influencia exhibió sobre el número y la calidad de las bandas resueltas por electroforesis. Posteriormente se evaluaron en su capacidad de generar polimorfismos los 10 cebadores que ge­neraron el mayor número de bandas (OPR-01, OPR-02, OPR-03, OPR-07, OPR-08, OPR-09, OPR-10, OPR-12, OPR-15 y OPR-20) con 6 mate­riales de T. grandiflorum y 4 de T. bicolor, y de éstos se utilizaron los 5 cebadores que mostraron mayor
	Tabla 2. Sumario de los 5 cebadores utilizados y número de bandas generadas en la caracterización molecular del banco de germoplasma del género Theobroma Cebador Secuencia T. grandiflorum T. bicolor Compartidas Total Bandas totales % bandas polimórficas Bandas totales % bandas polimórficas Bandas compartidas % bandas polimórficas Bandas totales OPR-03 5'-ACACAGAGGG-3' 13 92,3 3 33,3 0 _ 16 OPR-07 5'-ACTGGCCTGA-3' 15 93,3 11 45,5 3 66,6 23 OPR-08 5'-CCCGTTGCCT-3' 16 68,8 16 0,0 5 80,0 27 OPR-09 5'-TGAGCACGAG-3' 10 70,0 14 7,1 2 0,0 22 OPR-15 5'-GGACAACGAG-3' 15 73,3 14 42,9 3 66,6 26 69 79,9 58 22,4 13 61,5 114
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	número de bandas polimórficas para la caracteriza­ción molecular de los materiales del banco (tabla 2). Caracterización molecular mediante RAPD. A par­tir de los 145 materiales analizados pertenecientes al banco de germoplasma, se evaluaron 114 bandas distribuidas así: 57 bandas para T. grandiflorum (84,2% polimórficas), 45 bandas para T. bicolor (26,7% polimórficas) y 12 bandas compartidas entre	las dos especies (58.3% polimórficas). En la tabla 2 se presenta el número de bandas analizadas para cada uno de los cebadores con los que se evaluó la colección. Los individuos externos presentaron patrones de bandeo similares a los del banco, con excepción de 2 bandas presentes exclusivamente en el mate­rial GOL1 y 1 banda exclusiva para GLS, ambos pro­cedentes de Leticia (departamento de Amazonas, Colombia). Como se observa en el dendrograma generado por UPGMA (figura 1) derivado de los valores de semejanza según Dice (1945), la totalidad de los materiales anali­zados se agrupó en un valor de semejanza de 0,23. Los materiales de la especie T. grandiflorum constituyen una primera rama agrupada con un valor de semejanza de 0,70; y los de T. bicolor la segunda rama agrupada en 0,93. Estos valores son comparables a los presentados por Wilde et al. (1992). Para esto se construyó un dendrograma me­diante UPGMA a partir de los valores de semejanza reportados por este autor, los cuales fueron calculados por el coeficiente de Dice (1945) utilizando marcadores RAPD para materiales de T. cacao. Los materiales de T. cacao utilizados se agru­paron en valores cercanos a 0,65, y éstos, con respecto a un material de T. microcar-pum, en 0,32. Si bien la totalidad de los individuos de T. grandiflorum analizados se agrupó en valores de 0,70, los materiales conser­vados en el banco lo hicieron sobre valores de semejanza cercanos a 0,75; el material denominado GG (proveniente del departa­mento de Guainía) y utilizado como exter­no al banco presentó menor semejanza con el resto de la colección. Los materiales provenientes de Leticia (departamento del Amazonas), se agruparon junto con los materiales provenientes del banco.
	Figura 1. Dendrograma UPGMA (r =0,99439) derivado de los valores de seme­janza estimada mediante el índice de Dice (1945) utilizando marcadores RAPD de los materiales del banco de germoplasma del género Theobroma.		A pesar de la alta semejanza intraes-pecífica encontrada, particularmente en T. bicolor, los resultados obtenidos por la
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	técnica RAPD permitieron la distinción del 99% de los materiales de la colección con base en los perfi­les de bandas generados. Sólo dos materiales de T. bicolor (MB3-3 y MB3-5) presentaron patrones simi­lares de bandeo. La alta semejanza encontrada entre los mate­riales T. bicolor (0,93-1,00) posiblemente refleja el hecho de que los materiales tienen la misma proce­dencia ubicada en la zona geográfica del municipio de Calamar (departamento de Guaviare); sin em­bargo, el material BLS proveniente de Leticia (de­partamento del Amazonas), utilizado como contras­te de los materiales conservados no mostró una separación evidente del conjunto de los individuos analizados. Esto muestra una segunda posibilidad: que la utilización de marcadores RAPD no es efi­ciente para detectar diferencias a nivel del genoma de esta especie debido a la baja frecuencia de los polimorfismos detectados y, por tanto, es necesaria la utilización de otro tipo de marcadores, por ejemplo AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Caso similar al de Perry et al. (1998), quien muestra que la utilización de marcadores RAPD para T. ca­cao, colectados en Malasia, fue poco satisfactoria para discriminar entre variedades de esta especie a diferencia de los marcadores AFLP.		conformación de 12 diferentes grupos (Vargas y Argüelles, 2000; Vargas et al., 2002). Sin embargo, la ausencia de agrupamientos claros a partir del cálculo de semejanza mediante el uso de marcado­res RAPD (figura 1) respecto a los resultados de la caracterización morfoagronómica, muestra la hete­rogeneidad a nivel molecular de los 12 grupos mor-foagronómicos conformados previamente a este tra­bajo. Esto puede deberse a que los caracteres morfológicos y agronómicos que fueron tenidos en cuenta para la evaluación inicial del banco son: 1) in­fluenciables por factores ambientales, o 2) no refle­jan la variabilidad presente en el banco o 3) que no fueron suficientes para una evaluación exhaustiva de éste. Con los datos obtenidos únicamente para los materiales de T. grandiflorum del banco de germo­plasma se realizó un análisis de componentes princi­pales con la finalidad de apreciar relaciones entre materiales que en el dendrograma no son evidentes y generar agrupamientos. La representación en tres dimensiones de los componentes principales (figura 2), que correspon­de al 74% de la variación total, muestra las posibles
	Estos resultados difieren, segura­mente por la selección de materiales evaluados, de los obtenidos previa­mente por Wilde et al. (1992) quien mostró que el uso de los marcadores RAPD para la caracterización de clo­nes de cacao es una alternativa viable para la labor de curación de coleccio­nes de germoplasma de esta especie, siendo utilizados posteriormente en trabajos como los de Lerceteau, et al. (1997a, 1997b). De esta manera, es de particular importancia para el caso de los materiales de T. bicolor, la realiza­ción de nuevas colectas de materiales pertenecientes a poblaciones ya sean cultivadas o silvestres, y comparar los datos obtenidos en este trabajo por marcadores RAPD con otro tipo de marcador molecular.
	Figura 2. Representación de los 3 componentes principales de variación (74%) obte- Los trabajos de caracterización nidos por el análisis de componentes principales (ACP) de marcadores RAPD en 128 morfoagronómicos en varios materia- materiales de Theobroma grandiflorum del banco de germoplasma custodiado por el les de T. grandiflorum demostraron la Instituto Sinchi.
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	relaciones obtenidas en estos materiales. Con el fin de evidenciar con mayor claridad las relaciones en­tre individuos obtenidos mediante este análisis, se generó un dendrograma UPGMA a partir del cálculo de las distancias de cada pareja de puntos en la re­presentación. Para esto se construyó previamente una matriz de distancias euclidianas a partir de los datos de los tres componentes principales re­presentados. La necesidad de utilizar este procedi­miento se derivó de la dificultad de generar los agru-pamientos en la representación tridimensional tanto	por la naturaleza e información disponible sobre los individuos analizados (p. ej. datos de pasaporte), como por el número de puntos (individuos) sobre la representación. En la figura 3 se presenta el dendrograma ge­nerado, el cual muestra en otro tipo de representa­ción gráfica los resultados obtenidos mediante el análisis de componentes principales (figura 2). Con la información presentada de esta manera se clasi­ficaron los materiales del banco dentro de 19 gru­pos, los cuales tampoco mues­tran relación con los obtenidos mediante la caracterización morfoagronómica. Se espera que el uso conjunto de los gru­pos obtenidos por metodolo­gías diferentes sea un criterio de utilidad para la toma de de­cisiones en trabajos posterio­res, bien sea en tareas relacio­nadas con el manejo del banco, o con miras a establecer un programa de mejoramiento ge­nético para esta especie. CONCLUSIONES A partir del análisis de marca­dores RAPD, se logró la carac­terización de 145 materiales del banco de germoplasma del género Theobroma custodiado por el instituto Sinchi. Para esto fue necesario adecuar previamente las condiciones para la extracción de ADN y de generación de estos marcado­res, con lo cual se asegura la aplicabilidad de la técnica en el laboratorio y su utilidad para responder al objetivo plantea­do inicialmente.
	Figura 3. Dendrograma UPGMA derivado de la matriz de distancias euclidianas calculadas entre los puntos de la proyección de los 3 componentes principales de variación, obtenido mediante el ACP de marcadores RAPD para los materiales de Theobroma grandiflorum del banco de germoplasma custodiado por el Instituto Sinchi.		Los resultados presenta­dos muestran que la técnica em­pleada fue útil en cuanto a la dis­criminación de los materiales conservados, particularmente en el caso de T. grandiflorum. Sin embargo, es conveniente com­parar los resultados obtenidos
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	para T. bicolor con los generados mediante otro tipo de marcador molecular con el fin de evaluar la eficiencia del uso de RAPD para detectar diferencias a nivel del genoma de esta especie. Si bien no se encontró una relación directa en­tre el análisis molecular con el obtenido por medio de la caracterización morfológica y agronómica, y no se encontraron indicios de diferenciación con las proce­dencias de los materiales, la implementación de la generación de marcadores RAPD, como comple­mento a la información que se tiene del banco, es una herramienta muy útil en la generación de crite­rios para su manejo, enriquecimiento y uso en tareas relacionadas con el manejo de estas especies. AGRADECIMIENTOS Los autores desean expresar sus agradecimientos a la doctora Esperanza Torres Rojas, subdirectora científica y tecnológica del Instituto Sinchi por su apoyo durante la realización de este trabajo. Igual­mente al doctor Dairon Cárdenas y al grupo de tra­bajo del Herbario Amazónico por la consecución de los materiales utilizados como contrastes. Este tra­bajo se realizó en el marco del proyecto titulado "Oferta y potencialidades de un banco de germo-plasma del género Theobroma en el enriquecimien­to de los sistemas productivos de la región amazó­nica" financiado con apoyo de Colciencias, contrato No. 582. BIBLIOGRAFÍA Alves, R. M.; Artero, A. S.; Sebbenn, A.; Figueira, A. 2003. Ma-ting system in a natural population of Theobroma gran-diflorum (Wild. ex Spreng.) Schum., by microsatellite markers. Genet. Mol. Biol. 3: 373-379. Casas, A. 1995. Análisis de crecimiento del fruto y determina­ción del momento óptimo de cosecha del maraco (Theobroma bicolor H.B.K.). Tesis ingeniero agrónomo. Bogotá, Colombia: Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Agronomía. 105 p. Charters, Y. M. y Wilkinson, M. J. 2000. The use of self-pollinated progenies as "in-groups" for the genetic characterization of cocoa germplasm. Theor. Appl. Ge­net. 100: 160-166.	Couch, J. A.; Fritz, P. J. (1990). Isolation of DNA from plant high in polyphenolics. Plant. Mol. Biol. Rep. 8: 8-12. Dellaporta, S. L.;Wood, J.; Hicks, J. B. 1983. A plant DNA mi-nipreparation: Version II. Plant. Mol. Biol. Rep. 1:19-21. Dice, L. R. 1945. Measures of theamountof ecologicassocia-tion between species. Ecology. 26:297-302. Doyle, J. J. y Doyle, J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12: 13-15. Hansen, M.; Halldén, C.; Torbjörn, S. (1998). Error rates and polymorphism frequencies for three RAPD protocols. Plant. Mol. Biol. Rep. 16:139-146. Keb-Llanes, M.; González, G.; Chi-Manzanero, B.; Infante, D. (2002). A rapid and simple meted for small-scale DNA extraction in Agavaceae and other tropical plants. Plant. Mol. Biol. Rep. 20: 299a-299e. Leal, F.; Serra, A.; Valderrama, E. 2000. El copoazú (Theobro­ma grandiflorum) Sterculiaceae, pariente del cacao. En: Memorias I congreso Venezolano del cacao y su indus­tria. CONICIT. p. 268-274. Lerceteau, E.; Quiroz, J.; Soria, J. Sophie, F. Pétiard, V.; Crou-zillat, D. 1997a. Genetic differentiation among Ecuado-rian Theobroma cacao L. accessions using DNA and morphological analyses. Euphytica. 95: 77-87. Lerceteau, E.; Robert, T.; Pétiard, V.; Crouzillat, D. 1997b. Evaluation of the extent of genetic variability among Theobroma cacao accessions using RAPD and RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 95: 10-19. Mueller, U.G.; Wolfenbarger, L. L. 1999.AFLPgenotypingand fingerprinting. Trends. Ecol. Evol.10: 389-394. Perry, M. D.; Davey, M. R.; Power, J. B.; Lowe, K. C.; Bligh, H. F. J.; Roach, P. S.; Jones, C. 1998. DNA isolation and AFLP™ genetic fingerprint of Theobroma cacao (L.). Plant. Mol. Biol. Rep. 16: 49-59. Szmidt, A. 2004. MPGL-DNA extraction from recalcitrant plant. Última actualización: 06/04/2004. En: http://genetics.biology.kyushu-u.ac.jp/pgen/method /dnaextraction.htm Stein, A. y Raoult, D. 1992. A simple method for amplification of DNA from paraffin-embedded tissues. Nucl. Acids. Res. 20: 5237-5238. Urano de Carvalho, J. E.; Müller, C. H.; Benchimol, R. L.; Kuozo, A.; Alves, R. M. 1999. Copoasu [Theobroma grandiflorum (Willd. Ex Spreng.) Shum.]: cultivo y utilización. Belém, Brasil: Tratado de cooperación amazónica. 152 p. Vargas Ávila, G.; Argüelles Cárdenas, J. 2000. Clasificación y caracterización morfoagronómica del germoplasma de cinco especies frutales amazónicas. Instituto Amazóni­co de Investigaciones Científicas (Sinchi), San Jose del Guaviare, Colombia. 28 p.
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