Estudio del proceso de callogénesis en genotipos promisorios de cafeto (Coffea canephora P.).

A study of the callogenesis process in promising coffee genotypes (Coffea canephora P.)

on la finalidad de obtener callos embriogénicos y luego embriones somáticos de los mismos en el cultivo del café (Coffea canephora P.), se cultivaron in vitro explantes foliares de ramas ortotrópicas de plantas establecidas en campo. Los medios de cultivo contenían las sales minerales recomendadas por Murashige y Skoog (1962) y como reguladores del crecimiento se estudiaron el 2,4-D (0.5 mg/L) y la Kinetina (2.0 mg/L), así como el RIZOBAC (0.4-1.8 mg/L) para la inducción del callo embriogénico. Se observó que la dosis de 0.9 mg/L de RIZOBAC y 2.0 mg/L de Kinetina favorecieron notablemente la formación de callos embriogénicos de alta frecuencia (46.0-98.7 %). Estos callos cultivados en un medio suplementado con ANA (0.1 mg/L) y Kinetina (0.5 mg/L) originaron embriones somáticos en diferentes estadios de desarrollo. Palabras clave: Robusta; clones; callos; 2,4-D; Kinetina; RIZOBAC.

This research study was aimed at obtaining coffee crop (Coffea canephora P.) embryogenic callus and then somatic embryos. Leaf explants from orthotropic branches of plants established in the field were cultured in vitro. Culture medium contained mineral salts as recommended by Murashige and Skoog (1962). 0.5 mg/L 2,4-D and 2.0 mg/L Kinetine were studied as growth regulators as well as 0.4-1.8 mg/L RIZOBAC for inducing embryogenic calluses. 0.9 mg/L RIZOBAC and 2.0 mg/L Kinetine doses consistently enhanced embryogenic callus formation (46.0%-98.7%). When these calluses were cultivated in ANA (0.1 mg/L) and Kinetine (0.5 mg/L) supplemented médium they yielded somatic embryos in different development phases. Key words: Robusta; callus; 2,4-D; Kinetine; RIZOBAC.

	Estudio del proceso de callogénesis en genotipos promisorios de cafeto (Coffea canephora P.). A study of the callogenesis process in promising coffee genotypes (Coffea canephora P.)
	María Esther González Vega*
	RESUMEN
	Con la finalidad de obtener callos embriogénicos y luego embriones somáticos de los mismos en el cultivo del café (Coffea canephora P.), se cultivaron in vitro explantes foliares de ramas ortotrópicas de plantas establecidas en campo. Los medios de cultivo contenían las sales minerales recomendadas por Murashige y Skoog (1962) y como reguladores del crecimiento se estudiaron el 2,4-D (0.5 mg/L) y la Kinetina (2.0 mg/L), así como el RIZOBAC (0.4-1.8 mg/L) para la inducción del callo embriogénico. Se observó que la dosis de 0.9 mg/L de RIZOBAC y 2.0 mg/L de Kinetina favorecieron notablemente la formación de callos embriogénicos de alta frecuencia (46.0-98.7 %). Estos callos cultivados en un medio suplementado con ANA (0.1 mg/L) y Kinetina (0.5 mg/L) originaron embriones somáticos en diferentes estadios de desarrollo. Palabras clave: Robusta, clones, callos, 2,4-D, Kinetina, RIZOBAC. ABSTRACT This research study was aimed at obtaining coffee crop (Coffea canephora P.) embryogenic callus and then somatic embryos. Leaf explants from orthotropic branches of plants established in the field were cultured in vitro. Culture medium contained mineral salts as recommended by Murashige and Skoog (1962). 0.5 mg/L 2,4-D and 2.0 mg/L Kinetine were studied as growth regulators as well as 0.4-1.8 mg/L RIZOBAC for inducing embryogenic calluses. 0.9 mg/L RIZOBAC and 2.0 mg/L Kinetine doses consistently enhanced embryogenic callus formation (46.0%-98.7%). When these calluses were cultivated in ANA (0.1 mg/L) and Kinetine (0.5 mg/L) supplemented médium they yielded somatic embryos in different development phases.
	Key words: Robusta, callus, 2,4-D, Kinetine, RIZOBAC. INTRODUCCIÓN El café es uno de los productos agrícolas de mayor importancia a nivel internacional (Toruan-Mathius 1992; Cilas et al. 2000) y su valor eco­nómico para Cuba, por concepto de exportación del grano, es significativo. Debido a las diferencias de ploidía entre las especies de café, estas se encuentran aisladas genéticamente y por tanto los programas tradi­cionales de fitomejoramiento no son factibles de	utilizar, se necesitan hasta 24 años de cruzas con­tinuos para obtener una variedad nueva, lo ante­rior ha ocasionado que se recurra al cultivo de tejidos como alternativa (Sondahl y Lauritis 1992; Ascanio y Arcia 1994; Hamon etal. 2000; Etienne et al. 2002). Uno de los sucesos más espectaculares en la historia del cultivo de tejidos de plantas, no sólo por su valor científico, sino por el potencial de aplicación ha sido el descubrimiento de la embriogénesis somática en células cultivadas in
	M. Sc. Investigador Agregado del Departamento de Biofertilizantes y Nutrición de las Plantas, Instituto Nacional de Ciencias Agríco­las, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, La Habana, Cuba. E-mail: esther@inca.edu.cu Recibido: diciembre 17 de 2002. Aceptado: marzo 20 de 2003
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	vitro (Reinert 1958; Stewart etal. 1958). Este descu­brimiento permitió demostrar la totipotencia de las células de plantas superiores y su capacidad para formar plantas completas (Reinert etal. 1977). A partir de entonces el fenómeno de la embriogénesis somática ha sido reportado en más de 300 especies, en un amplio rango de plantas, entre las que se en­cuentra el cafeto. Dentro del protocolo de regeneración por em­briogénesis somática en Coffea spp. existen diferen­tes etapas o fases por la que pasa el proceso. Cada fase está regulada por diversos factores que se con­jugan e interactúan para que el proceso se desarro­lle. En la fase inicial o de inducción se debe formar un callo compuesto por células con alta capacidad regenerativa y por ser la fuente inicial de biomasa se debe buscar una población celular que posea alta tasa multiplicativa, sin perder las carac­terísticas fisiológicas y bioquímicas que le permiten regenerar. Para la inducción de la formación de callos de Coffea canephora a partir de explantes foliares se emplean, ge­neralmente, 2,4-D y Kinetina como re­guladores del crecimiento. Estos com­puestos son factores que controlan y regulan el proceso de formación de ca­llo con potencial embriogénico. En los últimos años se ha dedicado especial atención a nuevos compuestos biológi­cos que pueden ejercer su efecto regu­lador sobre sistemas in vitro (Cabrera etal. 1998; Montes etal. 2000; Díaz et al. 2002). El RIZOBAC forma parte de estos nuevos productos que han mostrado una actividad biológica similar a la de los reguladores del crecimiento. To­mando en consideración la necesidad de contar, ade­más, con nuevas alternativas que permitan reducir o sustituir el empleo de algunos reguladores del creci­miento en los medios de cultivo, se evaluó el efecto de este bioproducto en la inducción de callos embriogénicos. MATERIALES Y MÉTODOS En el presente estudio las hojas constituyeron la fuen­te de los explantes. Se utilizaron hojas de plantas establecidas en el campo, las que fueron tomadas de ramas ortotrópicas de la zona media y superior de la planta por ofrecer menores índices de contami-	nación y del segundo y cuarto nudo tomando como referencia los resultados obtenidos en estudios pre­cedentes al evaluar este aspecto en la var. Robusta, se evaluaron los clones M-229, K-234 y M-28. La desinfección y disección de las hojas se realizó se­gún la metodología propuesta por Santana (1993). Los explantes se colocaron en tubos de ensayo de 25 x 150 mm conteniendo el Medio de Formación de Callos (MFC). Se utilizaron 5 variantes de medio de cultivo para la inducción de la callogénesis en el cafeto (MFC1? MFC2, MFC3, MFC4 MFC-5), cuya com­posición es: Sales MS (Murashige y Skoog 1962) 10 mL; Cisteína-HCL 25 mg/L; Tiamina-HCL 4 mg/L; Mesoinositol 100 mg/L; Sacarosa 30 g/L; Gelrite 2 g/ L. Estos medios fueron suplementados con las dosis de auxina, citoquinina y RIZOBAC descritas en la Tabla 1.
		Con la finalidad de estimular la inducción de embriones somáticos se utilizó un medio de cultivo con igual composición química a las anteriores, pero suplementado con Ácido naftalenacétíco (ANA) - 0.1 mg/L y 0.5 mg/L de Kinetina. La esterilización de los medios se realizó en autoclave a 121 °C y 1.5 atmósfera por 15 minutos. El pH en todos los casos se ajustó a 5.6. Se estudiaron 15 tratamientos con 40 repeticio­nes cada uno. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado. Las variables evaluadas fueron: masa fresca del callo expresada en gramos, utilizando para ello una balanza Sartorius de 0.1 mg de precisión, la coloración del callo (de blanco cremoso a carmelita), la velocidad de crecimiento (de lenta a rápida), la
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	consistencia del callo (de friable a esponjosa), nive­les de Proteínas Totales, para esto se tomaron cinco callos por cada tratamiento (= 2.5 g) se maceró en un mortero con sílice a 0°C, luego: Se añadió 1 mL de buffer tris-125 Mm; pH 6.8; Na CI-50 Mm Se centrifugó a 3000 r.p.m. durante 30 minutos Se tomó el sobrenadante y se guardó a -20°C en tubos Eppendorf de 1.5 mL de capacidad hasta el momento del análisis. La cuantificación del contenido de proteínas to­tales se realizó por el método de Bradford (1976). Se evaluó el número de explantes con callos de alta frecuencia de formación de embriones, para el calculo del porcentaje de callos con estas caracte­rísticas se utilizó la siguiente expresión: % de callos altamente embriogénicos = núm. de callos altamente embriogénicos X 100 núm. de callos cultivados Se evaluó, además, la formación de embrio­nes por tratamiento utilizando una escala de 3 ni­veles (González 1999), la cual se describe a con­tinuación (Escala 1): + Baja frecuencia de formación de embriones somáticos (menos de 50 E.S./callo). ++ Formación media de embrionessomáticos (de 50-100 E.S./callo). +++ Alta frecuencia de formación de embriones somáticos (más de 100 E.S./callo). Los datos se procesaron estadísticamente rea­lizándose un análisis de varianza bifactorial de clasificación simple, en el caso de las variables cuantitativas, y estimándose las medias según Duncan en caso de significación al 5%, para lo cual se empleó el procesador START (INCA. Ver­sión 4.10/1998). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los niveles de masa fresca obtenidos en cada uno de los tratamientos evaluados difieren significativa­mente para las combinaciones hormonales estudia­das (Tabla 2)
		Se observó que el medio de cultivo 3 que con­tenía 2 mg.L-1 de Kinetina y 0.9 mg.L-1 de RIZOBAC fue el de mejor resultado con un valor de 1.5 g de masa fresca del callo en el clon M-229, seguido por el clon K-234 (1.48 g), el clon M-28 aunque difiere significativamente de los anteriores para esta variante, si supera notablemente al testigo, donde sólo se obtuvo 0.58 g de masa fresca. Los menores valores para la variable analizada corres­pondieron a las combinaciones del medio control y MFC-5 (0.9 mg.L-1 de RIZOBAC y libre de citoquininas) con 0.17, 0.31 y 0.45 g de masa fres­ca del callo en los clones estudiados. Estos resul­tados son similares a reportes realizados en dife­rentes especies, empleando nuevos biorregulado-res como inductores de la callogénesis en el cafe­to (García 1998; Cevallos 2000) y en otros culti­vos de interés agrícola (Montes et al. 2000 ). Re­sulta además interesante la posibilidad de contar con nuevas alternativas en la composición hormo­nal del medio de inducción de callos embriogénicos en el cafeto y especialmente tratándose de la sus­titución del 2,4-D en dicho balance, conociéndose su efecto como agente desestabilizador de la con­formidad genética del material generado en el pro­ceso de morfogénesis de numerosas especies. De forma general, se pudo observar que existió una mayor capacidad de respuesta a la formación de callo en el clon M-229, evidenciándose la rela­ción entre el efecto genotipo y el balance de los re­guladores del crecimiento en la masa fresca de los callos. Resultados similares fueron obtenidos por
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	Vázquez et a/.(1998) al reportar variaciones en el peso fresco de los callos de diferentes genotipos de Coffea arábica. Por otra parte se ha reportado en cultivares de yuca (Manihot esculenta (runtz)) diferencias notables en el peso fresco de los callos procedentes de un mis­mo tipo de explante cultivados en idénticas condicio­nes de medio y de ambiente pero pertenecientes a di­ferentes variedades de una misma especie. Similares resultados fueron reportados en pimiento (Capsicum annun) (Rey et al.1980 citados por Santana (1993)). En este estudio la dosis de 0.9 mg.L-1de RIZOBAC en ausencia de la citoquinina Kinetina no resultó ade­cuada para el inicio y desarrollo de la callogénesis en los clones evaluados lo que implica que si bien es fac­tible el empleo de este producto para inducir la callo-génesis en cafeto, este a su vez debe combinarse con una citoquinina, lo que se corrobora al analizar los re­sultados favorables alcanzados con el empleo de am­bos suplementos. Con relación a la cuantificación de las proteínas totales presentes en los callos es válido destacar que es una variable que no depende del clon estudiado y sí del medio de cultivo utilizado (Figura 1). Se obser­vó que en el clon M-229 el tratamiento con 0.9 mg.L-1 de RIZOBAC en presencia de 2 mg.L-1 de Kinetina indujo niveles proteicos en el callo que no difieren significativamente de los obtenidos con 0.5 mgL-1 de 2,4-D e igual dosis de Kinetina (2.47 y 2.42 mg/g de tejido (bmf), respectivamente) a los 40 días de culti­vados, etapa donde los contenidos proteicos aumen­taron considerablemente al encontrarse el callo en su fase de crecimiento exponencial, la cual se carac­teriza por un intensa multiplicación y división celular, y en la que según reportes, existe una síntesis cons­tante de proteínas (Cevallos 2000).
		Figura 1. Efecto de los medios de cultivo sobre los niveles proteicos de los callos en los clones evaluados. El nivel de proteínas más bajo (2.00 mg/g de te­jido) se obtuvo con el medio MFC-5, o sea el trata­miento formulado por 1.8 mg/L de RIZOBAC y libre de citoquinina. Por otro lado, la evaluación del comportamiento de las variables coloración, velocidad de crecimien­to y consistencia del callo (Tabla 3), sugiere la exis­tencia de una acentuada diferencia entre las combi­naciones hormonales más que por la procedencia del explante (genotipo), sobresaliendo los tratamien­tos con 0.5 mg.L-1 de 2,4-D y 2.0 mg.L-1 de Kinetina para los clones M-229 y K-234, así como un buen comportamiento del clon M-229 en presencia de RIZOBAC (0.9 mg.L-1) y Kinetina (2.0 mg.L-1) y del clon K-234 frente a la misma dosis Kinetina y 0.4 mg.L-1 de RIZOBAC para la coloración, consistencia y creci­miento del callo. Los callos que fueron tratados con estas combinaciones hormonales presentaron carac­terísticas superiores al resto de los tratamientos, o sea, coloración blanco cremoso, crecimiento rápido y consistencia friable.
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	No obstante, desde el punto de vista morfológico, los clones mostraron características similares al utili­zar una misma combinación hormonal siendo siempre el M-28 el de comportamiento más alejado. Aunque el empleo del RIZOBAC en la callogénesis del cultivo del café no ha sido reportado, su efecto se ha comproba­do en otras especies vegetales, fundamentalmente para la estimulación del crecimiento vegetal, con resulta­dos favorables. De manera general, se pudo observar que la incoporación de este producto en el medio de cultivo favoreció notablemente la formación de callo embriogenia) de alta frecuencia (Tabla 4); sin embar­go el comportamiento de los clones sobre los medios evaluados (MFC-2 y MFC-3) difirió significativamente, siendo el clon M-229 el que mayor capacidad de for­mación de callos embriogénicos de alta frecuencia expresó en ambos medios superando, como se puede observar, al resto de los clones. El clon M-28 resultó el más recalcitrante al proceso de inducción, con porcen­tajes de 46.0 y 20.5 % en los respectivos medios.	De los resultados obtenidos puede inferirse el efecto marcado del genotipo en la formación del ca­llo embriogénico sobre un mismo medio de cultivo, aspecto que ha sido demostrado por otros autores (Berthouly y Michaux-Ferriere 1996) al estudiar la in­cidencia de este factor en la respuesta de diferentes materiales de la especie C. canephora. Estos resul­tados confirman la existencia de controles genéticos sobre el comportamiento in vitro. El clon M-229 mostró una alta frecuencia de for­mación de embriones somáticos en callos proceden­tes del medio de cultivo MFC-3 y subcultivados pos­teriormente en el medio para inducción de embrio­nes. Los embrioides se diferenciaron en callos de color blanco-cremoso y carmelita claro, identificán­dose como puntos de color blanco brillante. Es de destacar que Pierson et al. (1983) obtuvieron resul­tados similares con relación a la diferenciación de embrioides en callos de color blanco, al trabajar con Coffea canephora. Sin embargo otros autores (Son-dahl y Sharp 1977; Peña 1983) han obtenido mejo­res resultados en callos de color carmelita al evaluar este aspecto, tanto en Coffea canephora como Co­ffea arábica.
	El clon K-234 resultó el más estable a las condi­ciones del medio de cultivo al no mostrar diferencias significativas en su respuesta en los dos medios es­tudiados. Tanto para el clon M-229 como para el K-234, los dos medios evaluados pueden constituir variantes a utilizar como alternativas de medios de cultivo a pesar de diferir significativamente para el caso del primer clon (M-229). El clon M-28 se ajustó de manera notable al ba­lance hormonal del medio MFC-3, observándose una disminución marcada en el porcentaje de formación de callos embriogénicos (de 46.00 a 20.50) en el medio MFC-2.	Durante el desarrollo de esta etapa se observa­ron embrioides en los diferentes estadios de desa­rrollo de los embriones somáticos (globular, acora­zonado y torpedo). Los clones K-234 y M-28 mostra­ron un comportamiento más estable a las variacio­nes en la composición química del medio de cultivo, resultando ser de modo general la frecuencia de for­mación de embriones para K-234 media (50-100 E.S./ callo) (Tabla 5), sin embargo para el clon M-28 este indicador fue bajo (menos de 50 E.S./callo), estos resultados coinciden con los datos obtenidos en la evaluación del porcentaje de callos embriogénicos de alta frecuencia donde el clon M-229 resultó el de mayor potencial embriogénico y el clon M-28 el más recalcitrante a la variable evaluada.
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	CONCLUSIONES Con base en los resultados obtenidos en este estu­dio sobre el proceso de callogénesis en la variedad Robusta se pudo arribar a las siguientes conclusio­nes: La adición del biopreparado RIZOBAC a razón de 0.4 - 1.8 mg.L-1 en el medio de cultivo y en pre­sencia de 2.0 mg.L-1 de Kinetina, para la inducción de la callogénesis en explantes foliares de café, cons­tituye una alternativa a considerar como sustituto de la fuente auxínica en el medio de cultivo o para indu­cir el proceso en clones recalcitrantes a los medios establecidos para este cultivo, siendo más efectiva la dosis de 0.9 mg.L-1 del biopreparado para las con­diciones evaluadas. Se constató el efecto marcado del genotipo en la respuesta de los explantes al proceso de callogé­nesis, resultando de los clones evaluados, el M-229 el de mayor capacidad de respuesta (89-98% de ca­llos con alta frecuencia de formación de embriones) y el clon M-28 el más recalcitrante a la variable eva­luada.	Cevallos, M. 2000. Establecimiento de una metodo­logía eficiente en el proceso de embriogénesis somática del cafeto. Tesis de Grado (Doctor en Ciencias Agrícolas). INCA, San José de las La­jas. 186 p. Cilas C.; C. Montagnon; B. Bertrand; C. Godin 2000. Wood elasticity of several Coffea canephora Pierre clones. A new trait to be included in selection schemes. Agronomie, 20 : 439-444. Díaz, B; E. Héctor; A. Torres; H. Vento; Miriam Isi-dron; N. Garcés; H. Izquierdo; Miriam Núñez; R. Iglesias; Ariannys Roque; E. Pinzón 2002. Sustitución de las hormonas sintéticas por bio-productos de producción nacional en la tecno­logía de propagación in vitro del plátano macho (AAB). EN: AGROTROP-2002 (abril 9-12, La Habana). Memorias CD. ROM. UNIVERSIDAD AGRARIA DE LA HABANA, FACULTAD DE AGRONOMÍA, 2002. ISBN: 959-16-0149-2. Etienne H.; F. Anthony; S. Dussert; D. Fernandez; P. Lashermes; B. Bertrand 2002. Biotechnological applications for the improvement of coffee (Cof­fea arábica L.). In vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 38 : 129-138. García, D. 1998. Actividad biológica de análogos Brasinoesteroides sobre la formación de callos embriogénicos en cafeto (Coffea canephora Pierre). Tesis de Maestría; UH. (Facultad de Biología). La Habana. 74 p. González, María E. 1999. Embriogénesis somática y respuesta a diferentes factores de cuatro clones seleccionados de la var. Robusta (Coffea canephora P.) Tesis de Maestría (Maestro en Ciencias Biológicas). Facultad de Biología. Uni­versidad de la Habana. 79 p. Hamon S.; F. Anthony; P. H .Barre; J. Berthaud; M. Boursot; N. Chabrillange; M. C. Combes; E. Couturon; J. Cros; S. Dussert; F. Engelmann; P. Lashermes; D. Le Pierres; J. Louarn; M. Noirot; C. Recalt; P. Trouslot; A. Charrier 1998. Coffee Genetic Resources and biotechnologies : their putative uses for breeding. Cahiers Agricultures, 7 : 480-487. INCA. START: Sistema automático para Análisis Esta­dístico, (Versión 4.10, 1998) INCA. Disq. 1998.
	BIBLIOGRAFÍA Ascanio E. y M. Arcia 1994. Efecto del estado de desarrollo de la antera y de un shock térmico sobre la androgénesis en Coffea arábica L. var. Garnica. Café Cacao The. 38: 75-80. Berthouly, M. and M. Michaux - Ferriere 1996. High frecuency somatic embryogenesis in Coffea canephora. Inducction conditions and histologi-cal evolution. Plant Cell Org. Cult. 44: 169-176. Braddford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantition of protein utilizing the principie of protein Dye Binding. Analitical Biochemestry 12: 248-254. Cabrera, J; R. Iglesias; A. Gutiérrez; S. González; E. Diosdado; R. Gómez; D. Agramonte; H. Izquier­do; J. González 1998. Pectimorf: un biorregula-dor cubano para la Biotecnología Vegetal. En: REDBIO'98-Third Latin American Meeting on Plant Biotechnology, Agricell Report 31(1): 3.
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	Montes, Silvia; J. P Aldaz, M Cevallos, J. C. Cabrera y Mirta López 2000. Uso del biorregulador Pectimorf en la propagación acelerada del Anthurium cubense.Cultivos Tropicales 21 (3): 29-32. Murashige, T. and F. Skoog 1962. A revised médium for rapid growth and bioassoys whith tobbaco tissue cultures. Physiol Plants 15: 473-497. Peña, M. 1993. Somatic embryo induction and plant regeneration from Coffea canephora and Coffea arábica. Simposio sobre Ferrugens do Cafeeiro, oeiras (Portugal) p. 493-512. Pierson, E. S.; A. A. M. Van Lammeren; J. H. N. Schel and G. Staritsky. 1983. In vitro development of embryoids from punched leaf discs of Coffea canephora. Protoplasma 115 (23): 208-216. Reinert, J. 1958. Morphogenese in ihrem Kontrolle and Gemebekuteren our Carothen. Notus Winsens Chapten. 45: 344-345. Santana, Nancy 1993. Embriogénesis somática en el cultivo del cafeto (Coffea sp.) Tesis de Grado (Doctor en Ciencias Agrícolas). INCA, San José de las Lajas. 124 p.	Sondahl M. R. y Lauritis J. A. 1992. Coffee. En Biotechnology of peremial fruit crop. Ed. for F.A. Hammerchlang y R.E. Litz. CAB International p. 401-420. Sondahl, M. R. and W.R. Sharp. 1977. High frecuency induction of somatic embryos in cultured leaf explants of Coffea arábica L. Zeitschriff fur Pflanzenphysiologie 81 (5): 395-408. Steward, F and K. Mears 1958. Growth organized develoment of cultured cells. Il-Organization in cultures grown from frely suspended cells. Am. I. Bot. 45: 705-708. Towan-Mathius N. 1992. Isolation on protoplast culture of Coffea arábica L. Biotrop. Spec. Publ. 49: 89-98. Vázquez R.; K. Salgar; W. Solano; A. Pescira; B. Bertand y H. Etienne 1998. En: Libro de Repor­tes REDBIO'98- Third Latin American Meeting on Plant Biotechnology. La Habana.
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