La investigación se ejecutó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Meristemas de la Universidad Nacional Ucayali, ubicado dentro en el kilómetro 6.200 de la Carretera Federico Basadre, Ucayali, Perú.

Fueron utilizadas semillas biológicas sanas de plantaciones de G. crinita establecidas por el Centro Internacional de Investigación Agroforestal (ICRAF) dentro de su programa de domesticación participativa de árboles desarrollado en la región Ucayali en la década del 90 y del 2000.

Para la desinfección de las semillas biológicas fue replicado el protocolo desarrollado por Gonzales-Alvarado et al. (2022), el cual se detalla a continuación: 30 minutos de desinfección superficial con 30 g L-1 de Benlate®, 2 % de hipoclorito de sodio (NaClO) durante 10 minutos, 1 minuto en alcohol comercial de 70 % y 5 enjuagadas con agua destilada esterilizada.

Como medios de cultivo se utilizaron las formulaciones de Murashige y Skoog (1962), y Lloyd y McCown (1980) (Murashige y Skoog [MS] y Woody Plant Medium [WPM], respectivamente) a diferentes concentraciones. Se aplicaron 5 tratamientos (tabla 1) que son los siguientes: 100 % MS (T2), 50 % MS (T3), 100 % WPM (T4), 50 % WPM (T5) y el testigo (T1) sin ningún medio de cultivo. En todos los medios de cultivo se agregó 7 g L-1 de agar (PhytoTech) y 30 g L-1 de sacarosa. Así mismo, para cada tratamiento, se ajustó el pH a 5.8.

Tabla 1

Para cada unidad experimental 25 mL de medio de cultivo fueron vertidos en frascos de 80 mm x 63 mm. Todos los fueron autoclavados a 121 °C; 1.1 atm durante 20 minutos. Luego fueron retirados y enfriados. En cada frasco se inocularon 4 semillas y luego fueron situados en un ambiente de 23 °C ± 2 °C con 75 % de humedad y fotoperiodo de 16 horas. Cada tratamiento estuvo compuesto por 35 repeticiones; la unidad experimental fue un frasco con 4 semillas.

Las variables analizadas fueron porcentaje de germinación (%G), altura aérea de la plántula (HP) (cm/planta), número de nudos (NN), número de hojas (NH), y masa fresca y masa seca (MF/MS) (mg/planta). Para el cálculo de %G, las semillas se consideraron germinadas únicamente cuando la radícula sobresalía 0.1 cm. Las variables HP, NN y NH se evaluaron 120 días después de la inoculación, mientras que el %G fue evaluado 2 veces por semana, durante 30 días.

Para la determinación de masa fresca (mg/ planta), 10 plántulas fueron retiradas de los frascos y limpiadas, después fueron pesadas en una balanza analítica digital con precisión de 0.1 mg. Para la masa seca (mg/planta), estas mismas plántulas fueron secadas en una estufa a 70 °C por 72 h, y fueron pesadas nuevamente en una balanza analítica de precisión (Gonzales-Alvarado y Cardoso, 2024).

El experimento fue conducido con un diseño completamente al azar (DCA). Los resultados fueron sometidos a análisis de varianza (ANVA) y cuando los resultados dieron diferencias significativas, fueron sometidos a pruebas de comparación de medias con Tukey al 5 % de significancia ( = 0.05). Los datos recopilados de las evaluaciones de las variables y el análisis estadístico fueron procesados en Open Office. Por su parte, el análisis estadístico se realizó en el programa computacional Sistema para Análisis de Variancia (SISVAR 5.6) (Ferreira, 2019). Para determinar las correlaciones, se realizó el análisis de correlación utilizando el coeficiente de correlación de Spearman, con un nivel de significancia del 5 % a partir de las medias, mientras para el PCA se utilizaron todos los datos; para ambos se utilizó el software R Studio.

Durante 30 días de evaluación, el porcentaje de germinación (%G) de semillas de G. crinita fue mayor en el tratamiento T1, con 46.09 %, 55.47 %, 59.38 %, 60.94 %, 61.72 %, 61.72 %, 63.28 %, 63.28 % para las 8 evaluaciones. Por otro lado, el tratamiento T4 mostró un comportamiento similar al T1 en la quinta evaluación (15 días), en la que ambos fueron estadísticamente semejantes (60.94ª; 61.72ª), aunque difirieron con el transcurso del tiempo en las evaluaciones posteriores, como se detalla en la tabla 2.

Tabla 2

*Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos según la prueba Tukey (p < 0.05). T: Tratamientos. E: números de evaluaciones.

Todos los tratamientos presentaron una tasa de germinación superior a 50 % (> 50), y el T1 se destacó con un 63.28 % sin la presencia de un medio de cultivo y el T4 (61.7 2%) que tenía WPM al 100 %. Además, se observó estabilidad numérica de la germinación en la penúltima y en la última evaluación (figura 1).

Figura 1

El efecto del medio de cultivo en la altura parte aérea (HP) mostró diferentes respuestas para cada tratamiento. El tratamiento T4 (WPM 100 %) obtuvo el mayor crecimiento (17.59 cm/planta), mientras que el tratamiento T1 mostró el menor crecimiento (5.07 cm/planta) (figura 2A). En cuanto al número de nodos (NN) (figura 2B), los tratamientos T4 y T5 presentaron los valores más altos (5.25 y 4.20 nudos/plantas, respectivamente), mientras T1 obtuvo los valores más bajos (1.93 nudos/plantas). En relación con el número de hojas (NH) (figura 2C), T4 obtuvo mayor número de hojas (6.18 hojas/ plantas), mientras T1 obtuvo los valores más bajos (1.26 hojas/plantas). Por otro lado, los tratamientos T2, T3 y T5 mostraron valores intermedios para todas las variables estudiadas sin diferencias estadísticas entre ellas, excepto para la variable NN, cuyos valores intermedios fueron obtenidos en T2 y T3.

Figura 2

Los resultados de producción de masa fresca y seca (MF y MS) indicaron diferencias entre los tratamientos. El tratamiento T4 mostró mayor valor numérico en MF y MS (192.8 y 24.1 mg/planta, respectivamente), lo cual no difirió estadísticamente con los otros tratamientos. Por otro lado, el tratamiento T1 registró los valores numéricos más bajos de MF y MS para ambas variables (55.6 y 6.9 mg/planta, respectivamente). Mientras tanto, el tratamiento T5 obtuvo valores intermedios (114.8 y 14.4 mg/planta, respectivamente), como se muestra en la figura 3a y b.

Figura 3

Los resultados de producción de masa fresca y seca (MF y MS) indicaron diferencias entre los tratamientos (figura 3a y b). El tratamiento T4 mostró los mayores valores numéricos en MF y MS, con 192.8 mg/planta y 24.1 mg/planta, respectivamente. Por otro lado, el tratamiento T1 registró los valores numéricos más bajos de MF y MS para ambas variables (55.6 y 6.9 mg/planta, respectivamente). Mientras tanto, el tratamiento T5 obtuvo valores intermedios (114.8 y 14.4 mg/planta, respectivamente), como se muestra en la figura 3a y b.

El análisis de correlación identificó 10 correlaciones, todas positivas. 9 correlaciones mostraron valores iguales o superiores a 0.90. Específicamente, las variables HP y MF; HP y MS; MF y MS presentaron valor absoluto de correlación de 1 ***, lo que indica una correlación perfecta entre ellas (figura 4). Por su parte, el análisis del PCA reveló distintos agrupamientos para cada uno de los tratamientos, con 94.4 % de la variación explicada por la primera dimensión (figura 5).

Figura 4

Figura 5

El desarrollo fisiológico está influenciado por la composición de los medios de cultivo (Lantos et al., 2023). En G. crinita, se determinó que la utilización de Woody Plant Medium (WPM) resultó en una mayor altura de planta (HP) (17.59 cm), número de nudos (NN) (5.25 nudos/planta) y número de hojas (NH) (6.18 hojas/plantas). Resultados similares fueron reportados por Rafael (2023) en Bertholletia excelsa, quien obtuvo una altura de 22.5 cm, 2.68 nudos/ planta y 2.1 hojas/plantas con la utilización de WPM. Se considera que WPM es esencial para el cultivo de plantas leñosas (Cassells y Curry, 2021; Nowakowska et al., 2019), ya que se ha observado un potencial regenerativo en diferentes especies (Tar et al., 2018) contrarrestando la sensibilidad a las sales de algunas especies leñosas (Lloyd y McCow, 1980; Hechavarría- Pérez et al., 2023); por esta razón se observó un mayor desarrollo de G. crinita con el uso de WPM al 100 %.

El mejor crecimiento en altura aérea de la planta, número de nudos y hojas obtenidos en el cultivo in vitro de semillas de G. crinita en el medio WPM puede relacionarse con el menor contenido de sales, incluido el nitrógeno, en comparación con el medio de cultivo MS (Nowakowska et al., 2019). Según Parada y Villegas (2009), el medio WPM presenta un 25 % de las cantidades de iones nitrato y amonio comparado con el medio MS. Es importante recordar que el WPM fue originalmente formulado para el cultivo de plantas leñosas (Harry y Thorpe, 1994).

Sin embargo, también se debe considerar que para algunas especies leñosas se obtienen mejores resultados con el medio MS. Según Daffalla et al. (2022), Sir El-Khatim et al. (2022) y Stephen et al. (2023) se obtuvieron mayores valores en la parte aérea (13.51 cm; 9.29 cm; 7.12 cm) con la utilización de MS en Acacia sieberiana, Acacia nubica y Cannabis sativa, respectivamente.

Por otra parte, el hecho de que se obtuvieron mejores resultados con el medio WPM al 100 % que con el medio WPM al 50 %, podría indicar que la concentración de sales y otros compuestos nutritivos presentes en esa concentración son los más adecuados para el desarrollo de las plantas a partir de semillas de G. crinita. El tratamiento basado en agar (T1) demostró menor desarrollo, con una altura aérea de 5.07 cm/ planta. 1.93 nudos/planta y 1.26 hojas/planta. Esta pequeña dimensión conlleva la disminución de las reservas nutricionales con el tiempo, lo que genera estrés en las plantas y, eventualmente, puede llevar su muerte (Gonzales-Alvarado et al., 2022).

La producción de masa fresca y seca es fundamental porque demuestra la capacidad que tienen los explantes para formar tejido. En esta investigación se encontró que la mayor cantidad de masa fresca y masa seca se produjo con la utilización WPM en un periodo de 120 días, con lo cual se obtuvieron 192.8 mg/planta y 24.1 mg/planta de MF y MS, respectivamente.

Resultados semejantes fueron reportados por Gonzales-Alvarado y Cardoso (2024) en Melaleuca alternifolia, quienes obtuvieron los mayores valores de MF (180 mg/planta) y MS (15 mg/planta) en condiciones ambientales similares a las de esta investigación. Por el contrario, el tratamiento T1 obtuvo los valores más bajos (56 mg/planta; 7 mg/planta) de MF y MS, respectivamente. Este resultado se debe a que este tratamiento no recibió ningún medio de cultivo, el cual actúa como fuente nutricional para el desarrollo vegetal.

Los resultados obtenidos respaldaron nuestra hipótesis, demostrando que el uso de medios de cultivo resultó superior en comparación con el testigo compuesto únicamente por agar. En particular, el medio de cultivo WPM destacó al proporcionar las mejores respuestas fisiológicas. Por otro lado, las plantas germinadas exclusivamente en agar dependieron de las reservas nutricionales de la semilla para su desarrollo. Sin embargo, la falta de nutrientes esenciales en el medio afectó significativamente su crecimiento, lo que se reflejó en una menor MF y MS (55.6 mg/planta y 6.9 mg/planta, respectivamente). Estos resultados coinciden con los reportados por Gonzales-Alvarado et al. (2022).

El análisis de correlación entre las variables identificó correlaciones positivas absolutas (1 ***) entre HP y MF, HP y MS y MF y MS (figura 4). Resultados similares fueron reportados por Gonzales-Alvarado y Cardoso (2024); Sarropoulou et al. (2023)); Bello-Bello et al. (2016) en especies de Melaleuca alternifolia, Cereza y Vanilla planifolia, respectivamente, quienes observaron altas correlaciones positivas entre las variables analizadas. Estos hallazgos subrayan la importancia de la correlación entre la altura de la planta y la masa fresca y la masa seca, la cual refleja el crecimiento y desarrollo saludables de las plantas en medios de cultivos apropiados para esta especie, como es el WPM.