Los tratamientos fueron dispuestos en un diseño experimental de bloques al azar y consistieron en concentraciones de Cr (50, 100, 200, 300 mg/kg) más un testigo sin Cr, con seis repeticiones de las soluciones contaminantes. Estas soluciones fueron distribuidas en cajas Petri de 10 cm de diámetro, en las que se colocaron papel filtro de 90 mm de diámetro con nivel de poro equivalente al papel Whatman® No. 3, algodón y semillas comerciales de Z. aethiopica (cuatro por cada caja Petri) con características visibles de homogeneidad. El período de germinación fue de 168 h a una temperatura de 23 ± 2 °C controlada en estufa de precisión a baja temperatura con circulación por aire forzado y en ausencia de luz. Las semillas germinadas en cajas de Petri con 2 ml en agua desionizada sin Cr fueron consideradas como testigo. Para calcular el índice de germinación relativo como porcentaje de semillas (GRS) (Ecuación 1) y la elongación relativa de la radícula (ERR) (Ecuación 2) (Walter et al., 2006)pelletization, and composted sludge se aplicaron las ecuaciones siguientes:

Ecuación 1

Ecuación 2

El Índice de Germinación se calculó con la Ecuación 3:

Ecuación 3

donde, n _GC corresponde al número de semillas germinadas en el agua problema y n_GP es el número de semillas germinadas en agua control, ERR es la elongación relativa de radícula, l _rp es la longitud de la raíz en el agua problema y l_rc es la longitud de la raíz en agua control.

La toxicidad fue evaluada mediante el índice de germinación residual de semillas normalizado (GRSN) (Ecuación 4) y de elongación radicular residual normalizado (ERRN) (Ecuación 5) de acuerdo con Bagur-González et al. (2011), con valores de toxicidad entre -1 y 0 y las categorías: 0 -0.25 =baja toxicidad, -0.25 -0.5 = toxicidad moderada, -0.5 -0.75 = muy tóxica y -0.75 a 1.0 = muy alta, de la forma siguiente:

Ecuación 4

donde, Germ _x es el porcentaje promedio de semillas germinadas en el agua de cada caja petri y Germ _testigo es el porcentaje de semillas germinadas en el testigo;

Ecuación 5

donde, Elong _x es la longitud promedio de la radícula de las semillas germinadas en cada sitio de estudio y cada dilución, y Elong _testigo es la longitud promedio de la radícula de las semillas germinadas en el testigo.

Para esta medición se aplicaron los tratamientos con dos repeticiones cada uno. La siembra se hizo en macetas que contenían 7 kg de suelo fértil irrigado con soluciones de dicromato de potasio (K₂Cr₂O₇) a distintas concentraciones mezclado y estabilizado durante 20 días para lograr la distribución del Cr+⁶ en todas las fracciones del suelo. En cada unidad experimental (UE) de cada tratamiento se sembraron tres semillas de Z. aethiopica sobre suelo con 33% de humedad constante y riegos cada 3 días. El monitoreo se hizo durante 20 semanas de crecimiento de las plantas con registros de crecimiento de plántulas y toxicidad por Cr+⁶ en las semanas 3, 6, 9, 12, 15 y 20.

Para estas mediciones se hicieron análisis de las concentraciones de cromo⁺⁶ en las partes de la planta (raíz, tallo, hojas y flores) y en el suelo. En el caso de la planta, las muestras biológicas fueron trituradas, pulverizadas, homogenizadas y tamizadas antes de ser lavadas con agua destilada y secadas a 50 °C por 12 h en estufa. El proceso posterior de digestión se hizo en matraces Erlenmeyer con ácido nítrico (HNO₃) concentrado en un “hot plate’ a 85 °C durante 2 h.

El suelo contenido en las macetas fue mezclado para extraer una muestra de 200 g que fue secada al ambiente, triturado pulverizado y sometido a digestión con ácido nítrico (HNO₃) y ácido clorhídrico (HCl) concentrado durante 2 h a 85 °C en un “hot plate’. Finalmente, las concentraciones del metal fueron determinadas utilizando un equipo de espectrofotometría de absorción atómica de llama con lámpara de cátodo hueco.

La bioconcentración (FBA) se obtuvo dividiendo la concentración del metal presente en plantas Z. aethiopica entre la concentración en el suelo contaminado con Cr+⁶ (Wei, Zhou, y Saha, 2008) y la traslocación (FT) relacionando las concentraciones en la parte aérea de la planta y en la raíz (Olivares y Pena, 2009). La concentración letal se obtuvo mediante la correlación bivariada entre las concentraciones del contaminante (dicromato de potasio) a 50, 100, 200 y 300 mg/ kg y los efectos observados en la germinación de las semillas de Z. aethiopica L.

El Análisis de datos se realizó mediante una estadística descriptiva para la visualización del índice de germinación residual de semillas normalizado (GRSN) y la elongación radical residual normalizado (ERRN) y una estadística inferencial mediante el análisis de varianza (ANOVA) para determinar las diferencias significativas entre los tratamientos. Para calcular la concentración letal (CL₅₀) se hizo un análisis bivariado de regresión probit-log que relaciona la concentración de contaminante con los efectos observados en semillas de Z. aethiopica. Los datos fueron sistematizados y evaluados en el programa estadístico IBM SPSS Versión 20.

Las mediciones del índice de germinación (IG) se hicieron 168 h después del comienzo del proceso de incubación, utilizando el GRS y el ERR. En la Figura 1 se observa que los valores de los tres índices presentan diferencias significativas (P < 0.05) entre las concentraciones de 50 y 300 ppm. Tanto el %GRS como el %ERR mantienen heterogeneidad en sus varianzas y alta dispersión entre cada uno de los tratamientos. En concentraciones mayores que 200 mg/kg de dicromato de potasio (K₂Cr₂O₇) y con base en los criterios de Emino y Warman (2004) se presentaron porcentajes inferiores que 50% en las características de la semilla evaluadas, lo que indica el incremento de fitotoxicidad a concentraciones de Cr+⁶ > 50%.

Figura 1

Los resultados anteriores se contrastaron con los criterios del índice de germinación residual de semillas normalizado (GRSN) y de elongación radical residual normalizado (ERRN), lo que permitió clasificar la toxicidad en cada una de las unidades experimentales donde fueron germinadas las semillas. En las Tablas 1 y 2 se observa que la toxicidad de los tratamientos en la etapa de germinación de las semillas y en el desarrollo radicular de las plántulas, fue similar cuando se aplicaron concentraciones de 200 y 300 mg/kg, siendo éstas diferentes (P < 0.05) con relación a los resultados encontrados con la dosis de 100 mg/kg de Cr+⁶.

Tabla 1

*Promedios en una misma columna, seguidos de letras iguales no difieren en forma Significativa (P > 0.05). Categorías de toxicidad: 0 -0.25 =baja toxicidad, -0.25 -0.5 = toxicidad moderada, -0.5 -0.75 = muy tóxica y -0.75 .1.0 = muy alta.

Tabla 2

*Promedios en una misma columna, seguidos de letras iguales no difie ren en forma significativa (P > 0.05). Categorías de toxicidad: 0 -0.25 =baja toxicidad, -0.25 -0.5 = toxicidad moderada, -0.5 -0.75 = muy tóxica y -0.75 .1.0 = muy alta toxicidad.

El índice de elongación radical residual normalizado (Tabla 2) muestra valores de toxicidad entre moderados a muy altos a partir de 50 mg/kg de cromo y similares comportamientos con la germinación residual de semillas normalizada a partir de los 200 mg/kg.

El crecimiento de las plantas se midió durante 20 semanas. Se observó que a partir de la novena semana en concentraciones de 200 mg/kg de Cr+⁶ las plantas suspendieron su crecimiento con ausencia de floración, resultados que coinciden con las investigaciones de (Boffe et al., 2017). Este mismo comportamiento se observó a partir de la semana 12 en plantas cultivadas en suelos con concentraciones de 50 y 100 mg/kg (Figura 2).

Figura 2

La capacidad fitorremediadora de Z. aethiopica aparece en el Tabla 3 donde se observa que el mayor valor de FBA (50.88 ± 3.11) se presentó en las hojas de la planta y en aquellas que recibieron la dosis de 50 mg/kg.

Tabla 3

FBC: Factor de Bioconcentración, FT: Factor de Traslocación , LD: Límite de detección (<0.02), N/A: No se midió.

El máximo promedio del factor de traslocación fue de 5.17 ± 0.04, calculado como la relación existente entre el cromo acumulado en la parte aérea de la planta y el acumulado en la raíz, lo que indica la movilización del contaminante desarrollado por la planta (Mendez y Maier, 2008).

Por otra parte, la determinación de la concentración letal (CL₅₀), medida como la correlación logística entre las concentraciones y la población con efectos observables, exceptuando la germinación, mostró con 95% de confiabilidad que la concentración de 118.96 mg/kg de Cr+⁶ afecta el 50% de las semillas en la etapa de germinación (Figura 3).

Figura 3

La presencia de altas concentraciones de cromo ocasiona daños morfológicos observables en las plantas, entre ellos, reducción en la producción de biomasa relacionada con la baja elongación de tallos y pérdida de hojas (Jara-Peña et al., 2014).

La concentración letal CL₅₀ para la especie estudiada fue de 118.96 mg/kg de Cr+⁶, superior a la encontrada para Panagrellus redivivus de 44 mg/kg por Murillo y Díaz (Murillo Nahyr y María Consuelo Diaz, 1997), para larvas de Artemia salina de 12.5 mg/kg (Pérez y Gilling, 2001) y de 18.36 mg/kg para Lactuca sativa (Pérez y Gilling, 2001). Concentracciones de Cr+⁶ > 100 mg/kg en la etapa de germinación de semillas de Z. aethiopica inhibieron la madurez fisiológica de las raíces, lo que coincide con los hallazgos de Arias-Trinidad et al. (2017).

Con el criterio de clasificación de toxicidad de Bagur-González et al. (2011) las pruebas de germinación residual de semillas normalizado presentaron contrastante frente a la elongación radical residual normalizado, lo que muestra un efecto promotor la germinación en el crecimiento radicular. En concentraciones de 200 y 300 mg/kg las respuestas fueron similares cuando se consideran los %GRS y %ERR que mantienen una correlación positiva perfecta, indicando su dependencia total con los índices normalizados. Como es conocido, en algunas semillas se produce un efecto de hormesis donde el contaminante estimula la germinación y el crecimiento radicular (García y Abad, 2015).