Acta Biológica Colombiana

INTRODUCCIÓN

El cáncer de cuello uterino (CCU) es el cuarto cáncer más frecuente en mujeres en el mundo, con una incidencia de 528.000 casos nuevos en el 2012 y una mortalidad de alrededor del 50 %, en especial en países en desarrollo donde ocurre aproximadamente el 85 % de las muertes (Forman et al., 2012; Ferlay et al., 2015; Ginsburg et al., 2016).

Las lesiones premalignas en cuello uterino denominadas lesiones intraepiteliales escamosas de bajo y alto grado (LIEBG y LIEAG) son frecuentes en mujeres jóvenes, con una mayor incidencia entre los 25 y 40 años (Castle et al., 2005; Franceschi et al., 2006; Kalof et al., 2007). La tamización de lesiones precancerosas basada en la citología cervical ha permitido una reducción en la incidencia y mortalidad por cáncer de cuello uterino en países desarrollados, sin embargo en países en desarrollo esta neoplasia permanece como causa importante de mortalidad en las mujeres, debido a programas de tamización inexistentes o poco eficientes (Parkin et al., 2006; Choconta-Piraquive et al., 2010).

Los virus del papiloma humano de alto riesgo (VPH-AR) han sido identificados como agentes causales de cáncer de cuello uterino (Bosch et al., 1995; Walboomers et al., 1999; Zur Hausen, 2002; Schiffman etal., 2016), la detección de VPH-AR aunque es más sensible que la citología para detectar lesiones pre malignas tiene un valor predictivo bajo dado que la mayoría de infecciones son transitorias y solo una fracción pequeña de las mujeres positivas para ADN de virus oncogénicos desarrolla cáncer de cuello uterino (Liaw et al., 2001; Arbyn et al., 2006; Cuzick et al., 2006; Bansal et al., 2008; Choi et al., 2016). Se requiere un test que permita distinguir objetivamente las infecciones transitorias que no van más allá de causar una lesión de bajo grado de las asociadas a transformación oncogénica y mayor riesgo de desarrollar lesiones de alto grado y cáncer cervical. La medición carga viral de los VPH-AR ha sido propuesta como un marcador de riesgo de LIEAG y de CCU (Swan et al., 1999; Andersson et al., 2005; Moberg et al., 2005; Gravitt et al., 2007). De otro lado, dado que la integración del genoma de los VPH de alto riesgo al genoma de la célula infectada es un evento importante en la progresión neoplásica del cérvix (Jeon y Lambert, 1995; Melsheimer et al., 2004; Yu et al., 2005), la medición de la integración también se ha propuesto como marcador de riesgo. El genoma viral integrado, del cual son transcritos los genes tempranos E6 y E7, ha sido detectado en aproximadamente 90 % de los cánceres cervicales (Klaes et al., 1999). En varios estudios se ha demostrado que mediante PCR en tiempo real dirigida a los genes E2 y E6 es posible evaluar el estado físico del ADN de VPH 16 de manera confiable (Peitsaro et al., 2002; Andersson et al., 2005; Fujii et al., 2005; Briolat et al., 2007; Saunier et al., 2008). Estos estudios en general muestran que a mayor grado de lesión hay una mayor proporción de lesiones con el genoma del VPH 16 integrado.

La integración causa la pérdida o ruptura del gen E2 mientras se retiene un fragmento variable del genoma viral que incluye los genes E6 y E7 y la región corriente arriba, esto conlleva a una mayor expresión de los oncogenes virales E6 y E7 por lo que estas células adquieren una ventaja de crecimiento sobre aquellas que sólo tienen ADN viral en estado episomal, y tienen una mayor inestabilidad genómica (Jeon et al., 1995a; Jeon et al., 1995b).

En líneas celulares de queratinocitos cervicales establecidas a partir de lesiones precursoras de bajo grado se ha observado que los genomas de VPH se mantienen en aproximadamente 100 copias en la capa basal, en esas células probablemente ocurre la integración (Stanley et al., 1989; Alazawi et al., 2002; Pett et al., 2007). En la línea celular W12 derivada de una lesión de bajo grado que en pases tempranos tiene 100 copias de episomas y que en pases tardíos presenta el genoma de VPH integrado, se ha demostrado que bajos niveles de E2 expresados desde el promotor homólogo de los episomas de VPH16 pueden inhibir parcialmente la expresión desde el ADN integrado, lo que indica que la pérdida de episomas no sólo está asociada a la selección de células con ADN viral integrado sino que es un evento pre requisito para que esta ocurra (Pett et al., 2006). En este modelo también se ha demostrado que pueden existir, por periodos prolongados, células con ADN de VPH16 integrado seleccionables sin ejercer una ventaja selectiva de crecimiento dentro de una población policlonal hasta que se inicia la pérdida episomal (Pett et al., 2007). Se ha propuesto que la identificación de formas integradas de VPH podría ser un marcador útil de enfermedad progresiva, sin embargo si los genomas integrados son silenciosos a nivel transcripcional su detección sería poco útil (Woodman et al., 2007). La detección de transcritos derivados del integrante puede proveer información de pronóstico relevante, puesto que se ha propuesto que los queratinocitos que contienen formas integradas sólo emergerán una vez se reduzca el número de episomas que expresan E2 (Pett et al., 2006; Saunier et al., 2008). En este contexto el propósito de este trabajo fue evaluar si los niveles de expresión de ARN mensajero (ARNm) de E2 del VPH16 en mujeres con lesión intraepitelial escamosa positiva para VPH16 y con evidencia de integración viral se asocian con el grado de la lesión. Se evaluó también la asociación entre carga viral e integración con el grado de la lesión.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

En este estudio se analizaron 109 mujeres positivas para VPH16: 19 mujeres sin lesiones intraepiteliales cervicales, 45 mujeres con LIEBG y 45 mujeres con LIEAG. Las características demográficas de los sujetos de estudio se presentan en la tabla 1. Las mujeres sin lesión eran mayores (edad promedio 41 años), y de nivel socioeconómico bajo en comparación con los grupos de LIEBG y LIEAG. Las mujeres con LIEAG y LIEBG tuvieron promedios de edad similares, 34 y 37 años respectivamente. Las diferencias en escolaridad y estrato socioeconómico no fueron estadísticamente significativas.

Distribución de la carga viral según el grado de la lesión

El número de copias de genoma viral de VPH 16 (carga viral) por 50 ng de ADN genómico de cepillados cervicales positivos para VPH16 se evaluó en las 109 mujeres. La carga viral se calculó a partir de una curva estándar construida con diferentes concentraciones del plásmido pBRHPV16 luego de amplificación de una región de E6 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. En la figura 1A se presenta la distribución de la carga viral de VPH 16 en las 109 muestras analizadas agrupadas de acuerdo al diagnóstico histopatológico. Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre las medianas de los tres grupos (8,78 Ln copias E6/50 ng ADN en mujeres con lesiones de alto grado, 5,47 Ln copias E6/50 ng ADN en mujeres con lesiones de bajo gado y 2,75 Ln copias E6/50 ng ADN en mujeres sin lesión) (prueba de Kruskall-Wallis, p =0,049); el rechazo de la hipótesis nula se dio a expensas del grupo LIEAG que resultó diferente de las otras categorías (test de Dunn, LIEAG vs. no lesión: p=0,0004; LIEAG vs. LIEBG: p =0,0072).

Figura 1: Distribución de la carga viral de VPH 16 (A), la proporción E2/E6 (B) y la expresión de ARN mensajero de E2 de VPH 16 (C) en las 109 muestras analizadas agrupadas de acuerdo al diagnóstico histopatológico. La línea vertical en cada grupo representa el rango inter cuartil, la línea horizontal superior representa el percentil 75, la línea horizontal inferior el percentil 25 y la línea horizontal intermedia el valor de la mediana.

Proporción E2/E6

El estado físico del ADN se calculó como la proporción entre el número de copias del gen E2 y el número de copias del gen E6. En la figura 1B se presenta la distribución de la proporción E2/E6 en las 109 muestras analizadas agrupadas de acuerdo al diagnóstico histopatológico. Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre las medianas de los tres grupos (0,11 en mujeres con lesiones de alto grado, 0,16 en mujeres con lesiones de bajo gado y 0,68 en mujeres sin lesión) (prueba de Kruskall-Wallis, p =0,049); el rechazo de la hipótesis nula se dio a expensas de la pareja HSIL vs No lesión (test de Dunn, p =0,02). La mediana en lesiones de bajo grado también fue más baja que en mujeres sin lesión, sin embargo la diferencia no fue estadísticamente significativa.

Estado físico del ADN de VPH 16 según el grado de la lesión

Con base en la proporción E2/E6 se consideró como estado episomal puro valores mayores a 0,8, como formas mixtas episomales e integradas un valor mayor a 0 y menor a 0,8 y como ADN viral integrado un valor de 0 (Saunier et al., 2008). En la tabla 2 se presenta la distribución del estado físico del ADN de VPH 16 en los diferentes grupos histológicos. Si bien las formas episomales puras se observaron con mayor frecuencia en mujeres con lesión y disminuyeron a medida que avanzaba la lesión, en los tres grupos analizados predominó una mezcla de ADN viral integrado y episomal, la frecuencia de formas mixtas fue mayor en lesiones de alto grado. Los integrantes puros fueron poco frecuentes y sólo se observaron en mujeres con LEIBG y LEIAG (11,1 y 2,2 % respectivamente).

Niveles de expresión de ARN mensajero de E6 de VPH 16

Los resultados de este análisis se presentan en la figura 1C. De 109 pacientes en los que se cuantificó el ARNm de E2 se obtuvo un resultado positivo en 33 (30 %). En las pacientes sin lesión se encontró la menor prevalencia de expresión de E2 3/19 (15,8 %), en LIEBG y LIEAG las prevalencias fueron similares, 15/45 (33,3 %). Los niveles promedio de ARN mensajero de E2 fueron menores en las mujeres sin lesión y similares en LIEBG y LIEAG.

En la mayoría de casos en los que el ADN viral estaba en estado integrado puro no se detectó ARNm de E2, sólo un caso fue positivo. La media de expresión de ARNm de E2 en los casos en los que ADN viral estaba en estado episomal puro fue mayor que la observada en los casos mixtos (episomal e integrado) (11,04 y 8,4 respectivamente) sin embargo esta diferencia no fue estadísticamente significativa. En relación con la carga viral, en los casos en los que los niveles de ARNm de E2 fueron detectables se observó una media más alta del ln del número de copias copias de ADN de E6 (carga viral) en comparación con la observada en los casos negativos (8,6 vs. 6,82), esta diferencia no fue estadísticamente significativa.

Características operativas de los parámetros virales evaluados

Se evaluó la utilidad de la carga viral, la proporción E2/E6 y los niveles de RNAm de E2 para discriminar entre LIEAG y LIEBG o ausencia de lesión. Para la carga viral el punto de corte óptimo fue 7,11 Ln copias E6/50 ng ADN, este umbral de carga viral permitió identificar a las mujeres con LIEAG con una sensibilidad de 78 %, especificidad de 63 %, valor predictivo positivo de 59,3 % y valor predictivo negativo de 80 %. Para la proporción E2/E6 el punto de corte óptimo fue 0,175, con sensibilidad de 0 %, especificidad de 44 %, valor predictivo positivo de 33,3 % y valor predictivo negativo de 51 %. Para el número de copias de ARN de E2 el punto de corte fue de -1,955 con una sensibilidad de 42 %, especificidad de 65 %, valor predictivo positivo de 51,4 % y valor predictivo negativo de 50 %. Este análisis mostró una baja precisión diagnóstica para los tres parámetros virales evaluados. Ni la carga viral, ni la proporción E2/E6 o los niveles de ARNm de E2 permitieron discriminar adecuadamente entre LIEAG y LIEBG o ausencia de lesión.

DISCUSIÓN

El estado físico del ADN y la carga viral son considerados importantes determinantes de la transformación oncogénica del epitelio cervical infectado, sin embargo la gran variabilidad en resultados de estos parámetros ha dificultado su uso clínico para detectar aquellas lesiones cervicales con mayor riesgo de progresar hacia cáncer cervical (Shukla et al., 2014). El propósito de este trabajo fue evaluar los niveles de expresión del gen E2 en células cervicales exfoliadas provenientes de lesiones intraepiteliales escamocelulares, entendiendo su ausencia o diminución como un posible biomarcador de progresión de la enfermedad en mujeres con lesiones positivas para VPH16. Se evaluó en 109 muestras cervicales el estado físico del ADN viral, la carga viral y los niveles de expresión de ARN mensajero del gen E2 de VPH16.

El análisis de la carga viral se realizó mediante PCR cuantitativa, se observó un amplio rango de valores en LIEBG y LIEAG, inclusive en el grupo sin lesión se observaron valores altos en ocho casos, estos valores altos en mujeres sin lesión son probablemente el reflejo de una infección productiva con mayor riesgo de progresar a LEIBG, dada la asociación observada en este y otros estudios (Carcopino et al., 2006; Flores et al., 2006; Cricca et al., 2007; Saunier et al., 2008; Shukla et al., 2014) entre mayor valor de carga viral y progresión de la enfermedad. Al comparar las medias de carga viral en cada grupo histológico se observó una diferencia estadísticamente significativa, con un incremento a mayor severidad de la enfermedad. Los estudios en los que se ha empleado la PCR cuantitativa para evaluar la carga viral han mostrado de manera consistente que a mayor grado de la lesión es significativamente mayor la carga viral (Carcopino et al., 2006; Flores et al., 2006; Cricca et al., 2007; Saunier et al., 2008; Shukla et al., 2014), aunque en algunos estudios no se ha encontrado esta diferencia (Andersson et al., 2005; Briolat et al., 2007; Boulet et al., 2009). Cabe señalar que una comparación directa entre nuestros resultados y los obtenidos previamente por otros grupos es difícil dadas las diferencias en las técnicas de tiempo real empleadas (Taqman, SYBR Green), y las múltiples formas de presentación de los resultados (copias/ célula, copias/ng de ADN, copias/muestra).

El extremo 3' terminal de E2, que comprende la región de la bisagra y el dominio de unión al ADN, es la zona que más frecuentemente se pierde o se interrumpe luego de la integración del genoma de VPH 16 en el genoma de la célula infectada (Kalantari et al., 2001; Pett et al., 2007). Se empleó PCR en tiempo real para establecer el número absoluto de copias de E2 y de E6, calcular la proporción E2/E6 y determinar el estado físico del ADN viral. Los iniciadores y la sonda empleados para cuantificar E2 se ubicaron en la zona de la bisagra (Peitsaro et al., 2002). Observamos que la mediana de E2/E6 disminuyó a medida que aumentó el grado de la lesión. Esto indica que la proporción de episomas disminuye a medida que aumenta el número de formas integradas en las lesiones de alto grado, aunque dada la metodología empleada no es posible saber si coexisten en una misma célula formas episomales e integradas o si estas están en células independientes.

En este estudio observamos que, independiente de la lesión, la mayoría de muestras presentó un cociente E2/ E6 mayor a 0 y menor a 0,8, es decir que la mayoría de las muestras portaba una mezcla de episomas y formas integradas de genomas de VPH 16. Al igual que otros investigadores (Kulmala et al., 2006; Saunier et al., 2008; Boulet et al., 2009;) encontramos que la integración es un evento que aparece tempranamente pues un número significativo de muestras provenientes de mujeres sin lesión presentó integración, aunque siempre en presencia de episomas. En algunos estudios, por lo general realizados con otras metodologías no se han encontrado altos niveles de integración en citología normal o en lesiones de bajo grado (Tonon et al., 2001; Hudelist et al., 2004), esto en parte se explica por las diferencias técnicas empleadas para detectar VPH integrado. En general las metodologías diseñadas para detectar transcritos de la fusión virus-hospedero sólo identifican integrantes transcripcionalmente activos, mientras que los métodos que detectan ADN, como la PCR en tiempo real empleada en este estudio, detectan todos los genomas virales integrados independientemente de su actividad transcripcional (Groves et al., 2015).

La ruptura del gen E2, como consecuencia de la integración viral en el genoma de la célula hospedera, es considerada como un evento clave en la transformación maligna del epitelio cervical puesto que interrumpe la regulación negativa sobre la expresión de los oncogenes virales E6 y E7 (Schwarz et al., 1985; Jeon et al., 1995a). En varios estudios incluyendo el presente se reporta la presencia del gen E2 intacto en un alto porcentaje de lesiones de alto grado y cáncer (Andersson et al., 2005; Saunier et al., 2008; Vinokurova et al., 2008; Gray et al., 2010), aunque en su mayoría en presencia de formas integradas. En nuestro estudio, en lesiones de alto grado observamos un 15 % de formas episomales puras y un 82 % de formas mixtas, en estudios con el modelo celular W12 se ha descrito que la integración generalmente se acompaña de una proporción residual de episomas que deben ser eliminados para remover E2 que reprime la transcripción de los oncogenes E6 y E7 desde los integrantes (Pett et al., 2007). La presencia del gen E2 en la mayoría de lesiones de alto grado sugiere que deben existir mecanismos adicionales de pérdida de la represión mediada por E2 que permitan la expresión sostenida de E6 y E7 aun cuando el gen E2 esté intacto. En este estudio medimos los niveles de ARNm de E2 con el fin de evaluar si la ausencia de expresión de E2, se asocia con mayor riesgo de progresión, sólo detectamos niveles de ARNm de E2 en un 33,3 % de los casos analizados. En ausencia de lesión sólo se detectó ARNm de E2 en tres casos, esta baja detección de transcritos de E2 en mujeres infectadas pero sin lesión histológica pudo deberse a una baja carga viral. En todos los casos de LEIBG y LEIAG en los que se detectó expresión de ARNm de E2 el estado físico del ADN viral fue mezcla de integrado y episomal, dada la expresión detectable de ARNm de E2 desde los episomas, en estos casos aún no habría ocurrido la selección de los integrantes y estas lesiones estarían en menor riesgo de progresión. El análisis ROC mostró una baja capacidad de los tres parámetros virales analizados para distinguir entre HSIL y LSIL o ausencia de lesión esto debido en gran medida a las superposición de los datos observada en lesiones de bajo y alto grado que impide definir puntos de corte adecuados para predecir el riesgo y limita su utilidad clínica.

CONCLUSIONES

Si bien las lesiones con presencia de ADN viral mixto e integrado y expresión de E2 podrían estar en menor riesgo de progresión, y la carga viral y la integración se relacionaron con mayor severidad de la lesión, su valor clínico como biomarcadores de lesiones cervicales de alto grado es limitado dadas sus características operativas.