ÿþ<html> <head> <title></title> </head> <body> <font face="verdana" size="2"> <p align=right><font face="verdana" size="2"><b>ART&Iacute;CULO CORTO</b></font></p> <p><font size="4"><b>Detecci&oacute;n del <i>virus de la tristeza</i> de los c&iacute;tricos por serolog&iacute;a, microscop&iacute;a e hibridaci&oacute;n <i>in situ</i></b></font></p> <p><font size="3"><i>In situ</i> serological, microscopy and hybridization detection of CVT</font></p> <p><i> Patricia Rodr&iacute;guez<sup>1</sup> , Gloria Romero de P&eacute;rez<sup>2</sup> , M&oacute;nica Guzm&aacute;n<sup>1</sup></i></p> <p> <sup>1</sup> Bi&oacute;loga, M. Sc., Universidad Nacional, Instituto de Biotecnolog&iacute;a, Bogot&aacute;, Colombia. <a href="mailto:parodriguezb@unal.edu.co">parodriguezb@unal.edu.co</a><br> <sup>2</sup> Bi&oacute;loga, M.Sc., Laboratorio de Microscop&iacute;a Electr&oacute;nica, Universidad Nacional, Bogot&aacute;, Colombia. <a href="mailto:hgsperez@andinet.com">hgsperez@andinet.com</a> <br> <sup>3</sup> Bi&oacute;loga, Ph. D., coordinadora Laboratorio de Virus Vegetales, Instituto de Biotecnolog&iacute;a, Universidad Nacional, Bogot&aacute;. Colombia. <a href="mailto:mmguzmanb@unal.edu.co">mmguzmanb@unal.edu.co</a><br> </p> <p>Recibido: octubre 1 de 2008 Aprobado: junio 18 de 2009</p> <hr> <p><b>Resumen</b></p> <P> El virus de la tristeza de los c&iacute;tricos (CTV), es perjudicial para la citricultura y causa la enfermedad llamada tristeza de los c&iacute;tricos. Infecta las especies del g&eacute;nero <i>citrus</i> ocasionando la muerte de millones de &aacute;rboles. Los s&iacute;ntomas son decaimiento r&aacute;pido (QD) y acanalamiento de tallo (SP). En el trabajo se diagnostic&oacute; molecular y serol&oacute;gicamente al CTV en aislados provenientes de <i>Citrus aurantifolia</i> o Lima Tahit&iacute; (LT) y <i>citrus madurensis</i> (Lour) o Calamondino (Ca), y se realizaron estudios preliminares de detecci&oacute;n viral por medio de microscop&iacute;a &oacute;ptica e hibridaci&oacute;n <i>in situ</i>. Se utiliz&oacute; IC-RT-PCR e inmunoimpresi&oacute;n de tejido (IMI) expuestos a los anticuerpos monoclonales 3DF1+3CA5, y con el anticuerpo discriminante MCA 13 con t&eacute;cnica de Enzyme Linked Inmunossorbent Assay Doble S&aacute;ndwich (<i><i>Elisa</i></i>-DAS). La detecci&oacute;n por microscopia microscop&iacute;a se realiz&oacute; sobre secciones de pec&iacute;olo de LT y C que se ti&ntilde;eron con Azure A, y con acetato de uranilo y citrato de plomo. Para la hibridaci&oacute;n <i>in situ</i> se emple&oacute; una sonda marcada con digoxigenina dirigida hacia el gen de la prote&iacute;na mayor de la c&aacute;pside. Los resultados de IC-RT-PCR, IMI y <i><i>Elisa</i></i> fueron positivos para LT y C, indicando la presencia de variantes virales de tipo severo. Con microscop&iacute;a de luz se detectaron inclusiones citoplasm&aacute;ticas en las c&eacute;lulas acompa&ntilde;antes y del floema, confirmado con IMI y por hibridaci&oacute;n <i>in situ</i>. Se visualizaron inclusiones de part&iacute;culas virales en el tejido vegetal con microscop&iacute;a electr&oacute;nica con cambios en la ultraestructura celular como presencia de grandes vacuolas propias de la infecci&oacute;n viral. Este trabajo integra distintas t&eacute;cnicas diagn&oacute;sticas sobre dos especies c&iacute;tricas ex&oacute;ticas. </p> <p><b>Palabras clave</b>: inmunoimpresi&oacute;n, <i><i>Elisa</i></i>, hibridaci&oacute;n, microscop&iacute;a, CTV, IC-RT-PCR.</p> <p><b>Abstract</b></p> <p> Citrus tristeza virus (CTV), is deleterious for citriculture and cause citrus tristeza disease. CTV infects all Citrus species causing the death of millions of trees. Main symptoms are quick decline (QD) and stem pitting (SP). In this work serological, molecular and microscopical CTV diagnose was done in <i>Citrus aurantifolia</i> or Tahit&iacute; Lime (<i>Citrus latifolia Tanaka</i>) (LT) and <i>citrus madurensis</i> (Lour) or Calamondino (Ca) isolates. Petioles were tissue printing (IMI) and exposed to 3DF1+3CA5 monoclonal antibodies; they were then <i><i>Elisa</i></i> buffer extracted and exposed to MCA 13 monoclonal discriminant antibody in a <i>double</i>-antibody <i>sandwich</i> indirected <i>enzyme-linked Inmunossorbent Assay</i> (DASI-<i>Elisa</i>). <i>Immunocapture-reverse transcriptase</i> amplification (IC-RT-PCR) with specific mayor coat protein gene (CPG) primers were used on the <i>Elisa</i> buffer extracts as template. Optic and electron microscopy detection was carried out on transversal sections of petiole and were stained with Azure A or uranile acetate and plumb citrate, respectively. Digoxigenine marked mayor CPG CTV probes were used for <i>in situ</i> hybridization of petioles printing. All IC-RT-PCR, IMI and <i>Elisa</i> results were positive for LT and C too indicating the presence of severe viral variants. Light microscopy cytoplasm inclusions were detected in the phloem and accompanying cells, confirmed with IMI and <i>in situ</i> hybridization. Electronic microscopy analysis showed cellular abnormalities with changes in ultraestructure with big vacuoles presence that are characteristic of cytoplasmic viral infection. This is the first work that integrate all different diagnostic techniques in this two exotics citrus species.</p> <p><b>Key words</b>: inmunoimpression, <i>Elisa</i>, hibrization, microscopy, CTV, IC-RT-PCR.</p> <hr> <p><b>Introducci&oacute;n</b></p> <p> El virus de la tristeza de los c&iacute;tricos (CTV) (<i>Closteroviridae-Closterovirus</i>) es causa de una de las enfermedades m&aacute;s destructivas para los c&iacute;tricos, y est&aacute; presente en todos los pa&iacute;ses citr&iacute;colas, con distintos niveles de incidencia. Es end&eacute;mico en Asia, Sud&aacute;frica, Australia, Sudam&eacute;rica, M&eacute;xico y Estados Unidos, y se ha detectado con incidencias menores en los pa&iacute;ses del Mediterr&aacute;neo. Los hu&eacute;spedes est&aacute;n restringidos a la familia <i>Rutaceae</i> (Bar-Joseph et &aacute;l., 1989; Cambra y Moreno, 2000), y el g&eacute;nero <i>Poncirus</i> tiene genes de resistencia (Rai, 2006). El primer brote masivo de la enfermedad de la tristeza sobre patr&oacute;n de naranjo agrio, se observ&oacute; en Argentina en 1930, y luego en Brasil en 1937 (Naranjo, 1997). La infecci&oacute;n viral ocasiona un bloqueo de los vasos conductores impidiendo la nutrici&oacute;n y afectando fisiol&oacute;gicamente a sus hu&eacute;spedes, implicando la p&eacute;rdida de millones de &aacute;rboles (Schneider, 1957; Cambra y Moreno, 2000). En general se reconocen tres tipos principales de s&iacute;ntomas: el declinamiento r&aacute;pido (QD) de &aacute;rboles que se encuentran injertados sobre patr&oacute;n de naranjo amargo; el acanalamiento de tallo (SP) que no tiene restricciones en cuanto al patr&oacute;n, y el amarillamiento de pl&aacute;ntulas (SY), que causa p&eacute;rdidas en los semilleros de c&iacute;tricos e invernaderos, e involucra clorosis en hojas y crecimiento atrofiado en plantas de naranjo dulce, toronja y lim&oacute;n. La gama de s&iacute;ntomas y la intensidad de los mismos, depende de la combinaci&oacute;n patr&oacute;n-copa y cepa viral (Bar-Joseph et &aacute;l., 1989).</p> <p>El virus es transmitido por diferentes &aacute;fidos, entre ellos, <i>Toxoptera citricidus</i>, (Kirkaldy) que es el m&aacute;s eficiente para la transmisi&oacute;n de cepas severas (Roistacher y Moreno, 1991; Brlansky et &aacute;l., 2004; Broadbent et &aacute;l., 1996). La part&iacute;cula viral es filamentosa y flexuosa con 2000 x 11 nm, y posee dos prote&iacute;nas de c&aacute;pside: p25 o prote&iacute;na mayor, y p27 o prote&iacute;na divergente de c&aacute;pside. Ambas prote&iacute;nas son inmunog&eacute;nicas y se relacionan con la virulencia o transporte viral (Pappu et &aacute;l., 1993; Febres et &aacute;l., 1996, ; Karasev, 1995). Varios anticuerpos anti CTV se han obtenido, entre policlonales y monoclonales (Vela et &aacute;l., 1986; Zemzami et &aacute;l., 1993), sin embargo, pocos son &uacute;tiles para discriminar entre aislados severos y suaves, como MCA 13 de USA, 109/110 de USA, 4G12 y 110E 3 de Taiwan (Permar et al&aacute;l.,1990; Tsai y Hsu, 1991; Nikolaeva et &aacute;l., 1997). Diferencias de detecci&oacute;n serol&oacute;gica dependiendo del anticuerpo de cubrimiento utilizado, han sido informadas por diferentes autores (Cambra et &aacute;l., 1991; Nikolaeva et &aacute;l., 1998; Mart&iacute;nez et &aacute;l., 2005; Mart&iacute;nez y Guzm&aacute;n, 2007; Lbida et &aacute;l., 2005).</p> <p> El CTV se acumula en el citoplasma como inclusiones citoplasm&aacute;ticas (IC), que incluyen agregados virales y prote&iacute;na p20 (Gowda et &aacute;l., 2000). Adem&aacute;s, la infecci&oacute;n viral puede conllevar la formaci&oacute;n de vacuolas de gran tama&ntilde;o, anormales para el funcionamiento celular adecuado. Las IC se localizan en las c&eacute;lulas asociadas al floema, tienen utilidad diagn&oacute;stica, y se pueden observar con microscopio de luz, en cortes de tejido coloreados con Azure A o por inmunodetecci&oacute;n (Christie y Edwardson, 1977; Brlansky, 1987; Brlansky y Lee, 1990). La IC es uno de los 49 criterios para la clasificaci&oacute;n grupal de los virus de plantas (Brlansky, 1991); adem&aacute;s, se han informado diferencias en cuanto al n&uacute;mero de inclusiones dependiendo de la cepa, suave o severa, para algunos hu&eacute;spedes (Ecale Zhou et &aacute;l., 2002). Por microscop&iacute;a electr&oacute;nica, se ha estudiado la morfolog&iacute;a de la part&iacute;cula viral a partir de purificados (Kitajima et &aacute;l., 1964; Ecale Zhou, et &aacute;l., 2002). Tambi&eacute;n, la microscop&iacute;a electr&oacute;nica serol&oacute;gicamente espec&iacute;fica (SSEM) ha sido utilizada para detectar viriones con anticuerpos espec&iacute;ficos (Roberts y Harrison, 1979; Derrick y Timmer, 2000).</p> <p> En Colombia, el CTV se ha detectado desde el a&ntilde;o 1985 (Aubert, et al&aacute;l., 1992; Acosta et al&aacute;l., 1994) en diferentes departamentos citr&iacute;colas, especialmente en cultivos de naranja dulce, utilizando tanto pruebas serol&oacute;gicas como moleculares. Los trabajos indican alta incidencia del CTV con porcentajes que var&iacute;an entre el 80 y 100%. Los estudios serol&oacute;gicos y moleculares han determinado la presencia de algunos aislamientos suaves y otros severos (Guzm&aacute;n et &aacute;l., 1993-1994; Pe&ntilde;aranda et &aacute;l., 1996; Oliveros et &aacute;l., 2001., Delgado et &aacute;l., 2004) incluyendo aislados con variantes virales tipo SP (Mart&iacute;nez, et &aacute;l., 2005), que representan una fuerte amenaza para la citricultura nacional. Algunas Limas Tahit&iacute; (<i>Citrus aurantifolia</i>), especie reconocida como moderadamente susceptible a este virus, han sido evaluadas recientemente encontrando alta incidencia del CTV y mezcla de variantes (Guzm&aacute;n et &aacute;l., 2006; Guzm&aacute;n y Rodr&iacute;guez, 2007).</p> <p> El objetivo del presente trabajo fue ampliar las herramientas de diagn&oacute;stico y de discriminaci&oacute;n de aislados de CTV provenientes de Lima Tahit&iacute; y de Calamondino (Ca) que son especies c&iacute;tricas poco estudiadas en nuestro pa&iacute;s e interesantes para la exportaci&oacute;n (LT), utilizando diferentes aproximaciones serol&oacute;gicas, moleculares-hibridaci&oacute;n, evaluando tambi&eacute;n la disposici&oacute;n celular del CTV y el efecto del mismo en la estructura celular, por medio de microscop&iacute;a de luz y electr&oacute;nica.</p> <p><b>Metodolog&iacute;a</b></p> <p><b><i> Material vegetal</i></b></p> <p> Se utilizaron aislados de 8 &aacute;rboles de Lima Tahit&iacute; de 8 a&ntilde;os de edad injertados en patr&oacute;n de mandarina Cleopatra, y recolectados en la Corporaci&oacute;n Colombiana para la Investigaci&oacute;n Agropecuaria, y dos plantas ornamentales de Calamondino, mantenidas en macetas. Los &aacute;rboles (LT) y las plantas (Ca) presentaban s&iacute;ntomas de acanalamiento de tallo (SP) (<a href="#f1">figura 1</a>). Se colectaron ramas del contorno y hojas j&oacute;venes. Como controles se emplearon muestras de plantas c&iacute;tricas obtenidas en invernadero a partir de semilla control negativo C-: Mandarina (<i>Citrus reticulata</i>) libre de CTV y como controles positivos se utilizaron aislados colombianos de CTV: B128 (severo), B272 y B274 (suaves) mantenidos y donados por la colecci&oacute;n de Bestville Maryland USA. Se debe aclarar que en estudios previos, los aislados LT y los 2 Ca se reportaron como positivos para variantes SP utilizando la sonda espec&iacute;fica marcadas con digoxigenina (B3A) que detecta variantes severas de CTV tipo Madeira que ocasionan SP en naranjos y toronjas (Guzm&aacute;n y Rodr&iacute;guez, 2007). </p> <p align="center"><a name="f1"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f1.JPG"></a></p> <p><b><i>Pruebas serol&oacute;gicas</i></b></p> <p> Se utiliz&oacute; modificaci&oacute;n de la t&eacute;cnica de inmunoimpresi&oacute;n (IMI) reportada por Garnsey et &aacute;l, (1993) y Guzm&aacute;n et &aacute;l. (2001), a partir de impresiones de pec&iacute;olos, sobre membranas de nitrocelulosa de 0.,45 &Mu;m. En resumen, se utiliz&oacute; una soluci&oacute;n de BSA al 5% en PBS-Tween para bloquear los sitios inespec&iacute;ficos, durante toda la noche a 4 &deg;C. Para la detecci&oacute;n viral se utilizaron los anticuerpos monoclonales 3CA5 + 3DF1 (1:1000) (donados por Pedro Moreno) disueltos en buffer ECI (Agdia) por 3 horas. El anticuerpo conjugado a la fosfatasa alcalina (Goat anti Rabbit AP Sigma&reg;) se utiliz&oacute; en diluci&oacute;n 1:10000 en buffer ECI, durante 1 hora. Los lavados se realizaron con PBS-Tween por 3 min. El revelado se realiz&oacute; con Nitro Blue Tetrazodium/Bromo Cloro Indol Fosfato (NBT/BCIP). La localizaci&oacute;n del virus se determin&oacute; bajo estereoscopio (40X) (Konus &reg;), por la coloraci&oacute;n violeta resultante de la reacci&oacute;n fosfatasa alcalina-sustrato.</p> <p> La t&eacute;cnica <i>Elisa</i>-DAS se realiz&oacute; siguiendo protocolos de Cambra et al&aacute;l., (1989), y Guzm&aacute;n, et al&aacute;l. (2002). B&aacute;sicamente, las muestras se maceraron en buffer de extracci&oacute;n (Agdia) en relaci&oacute;n 1:10 (p/v). El sobrenadante se emple&oacute; como ant&iacute;geno y el anticuerpo policlonal SP6 (donado por G. Nolasco) en diluci&oacute;n 1:1000 en buffer de cubrimiento (ECI Agdia) como anticuerpo primario. Como anticuerpo secundario se utiliz&oacute; el MCA13 en relaci&oacute;n 1:1000 en buffer (ECI Agdia) durante 3 horas a temperatura ambiente. Se emple&oacute; GAM (Goat anti Mouse AP Sigma &reg;) en diluci&oacute;n 1:10000 como anticuerpo conjugado a la enzima fosfatasa alcalina, y el substrato para-nitro-fenil-fosfato (1mg/ml) (Sigma&reg;). Las densidades &oacute;pticas (D.O) de las muestras por duplicado, de la reacci&oacute;n enzim&aacute;tica se midieron a 405 nm a los 90 minutos y 16 horas en lector de <i>Elisa</i> Biorad &reg;.</p> <p> La t&eacute;cnica <i>Elisa</i>-DAS se realiz&oacute; siguiendo protocolos de Cambra et al&aacute;l., (1989), y Guzm&aacute;n, et al&aacute;l. (2002). B&aacute;sicamente, las muestras se maceraron en buffer de extracci&oacute;n (Agdia) en relaci&oacute;n 1:10 (p/v). El sobrenadante se emple&oacute; como ant&iacute;geno y el anticuerpo policlonal SP6 (donado por G. Nolasco) en diluci&oacute;n 1:1000 en buffer de cubrimiento (ECI Agdia) como anticuerpo primario. Como anticuerpo secundario se utiliz&oacute; el MCA13 en relaci&oacute;n 1:1000 en buffer (ECI Agdia) durante 3 horas a temperatura ambiente. Se emple&oacute; GAM (Goat anti Mouse AP Sigma &reg;) en diluci&oacute;n 1:10000 como anticuerpo conjugado a la enzima fosfatasa alcalina, y el substrato para-nitro-fenil-fosfato (1mg/ml) (Sigma&reg;). Las densidades &oacute;pticas (D.O) de las muestras por duplicado, de la reacci&oacute;n enzim&aacute;tica se midieron a 405 nm a los 90 minutos y 16 horas en lector de <i>Elisa</i> Biorad &reg;. </p> <p><b><i>Microscop&iacute;a de luz y electr&oacute;nica</i></b></p> <p> Se realizaron cortes transversales semifinos (4 &micro;m de grosor aproximadamente, a mano alzada) de las mismas secciones de pec&iacute;olos empleadas en IMI; estos cortes se ti&ntilde;eron con Azure A seg&uacute;n Christie y Edwardson (1977), y se revisaron en microscopio de luz (Nikon Labophot-2). Para microscop&iacute;a electr&oacute;nica se obtuvieron cortes ultrafinos (60 nm de grosor) de pec&iacute;olos embebidos en resina Ep&oacute;n-araldita, los cuales se montaron en rejillas de cobre y se ti&ntilde;eron con acetato de uranilo 1% y citrato de plomo Reynolds, se revisaron en microcopio electr&oacute;nico (Jeol EM-BGM-1).</p> <p><b>IC-RT-PCR y RT-PCR</b></p> <p> Se realiz&oacute; una IC-RT-PCR en un solo tubo seg&uacute;n lo reportado en Nolasco et al., (1993) y Guzm&aacute;n et &aacute;l., (2001-2002), empleando el anticuerpo SP6. Brevemente, se utilizaron extractos de las plantas LT y Ca en buffer de extracci&oacute;n, se incubaron por 12 horas, se lavaron con PBS-Tween y se aplic&oacute; el mix de RT-PCR, utilizando 10 pmol de cebadores forward (CTV1) y reverse (CTV10) espec&iacute;ficos para la amplificaci&oacute;n del gen de la prote&iacute;na mayor de la c&aacute;pside (CPG-p25) de CTV reportados en Nolasco et &aacute;l., (2002), con enzimas MMLV (200 U Fermentas&reg;) y Taq (2.5 U Fermentas&reg;), MgCl2 (2.5 mM), DTT (100 mM), dNTPs (10 mM), Buffer PCR 10X, a un volumen final de 25 &micro;l con 35 ciclos de amplificaci&oacute;n.</p> <p> Para el RT-PCR se utiliz&oacute; extracci&oacute;n de dsRNA con fenol cloroformo y purificaci&oacute;n con columna de Sephadex (Guzm&aacute;n et &aacute;l., 1994), tomando 10% (v:v) del extracto de dsRNA viral para realizar la amplificaci&oacute;n en un solo tubo, con los mismos cebadores y mezcla para amplificaci&oacute;n por RT-PCR ya indicada para la reacci&oacute;n de IC-RT-PCR. En estudios previos se utiliz&oacute; la sonda (B3A) espec&iacute;fica para SP de CTV tipo Madeira sobre productos de PCR del CPG-p25 marcado con dUTP digoxigenina. (Guzm&aacute;n y Rodr&iacute;guez, 2007) basados en los informes Cevik et &aacute;l., (1996) de PCR bidireccional y PCR asim&eacute;trica de Nolasco et &aacute;l., (2002) para detectar variantes suaves y severas del virus, y mezclas en los aislados.</p> <p><b>Hibridaci&oacute;n <i>in situ</i></b></p> <p> Se obtuvieron cortes transversales de pec&iacute;olo de LT, Ca y C-, y se realizaron impresiones en membrana de nitrocelulosa, las cuales fueron tratadas seg&uacute;n Kanemitsu y Koji (2000); brevemente, fijaci&oacute;n en paraformaldeh&iacute;do 4% y HCl 0.,2 M, formamida 40% en 4xSSC, e hibridaci&oacute;n con una sonda marcada con digoxigenina, especifica para el reconocimiento del gen de la prote&iacute;na de c&aacute;pside mayor (p25) de CTV, obtenida mediante PCR utilizando los cebadores CTV42 y CTV43 informados en Nolasco et &aacute;l., (2002). La hibridaci&oacute;n se realiz&oacute; durante toda la noche a 50 &deg;C y la membrana se lav&oacute; 3 veces con formamida al 50 % en 2XSSC para limpiar residuos inespec&iacute;ficos. El bloqueo se realiz&oacute; con suero bovino fetal (BSA, Sigma) al 5% en PBS, durante una hora. Luego se expuso la membrana al anticuerpo anti digoxigenina conjugado a fosfatasa alcalina (1: 1000 Roche &reg;) en buffer ECI (Agdia). El revelado se realiz&oacute; con el sustrato NBT/BCIP.</p> <p><b>Resultados discusi&oacute;n</b></p> <p> Las LT se detectaron como positivas para la infecci&oacute;n con CTV por la sencilla y r&aacute;pida t&eacute;cnica IMI con grados variables de intensidad, es decir, que algunos cortes de pec&iacute;olo de hojas del entono del &aacute;rbol presentaban m&aacute;s ac&uacute;mulos virales y otras menos (<a href="#f2">figura 2</a>).</p> <p align="center"><a name="f2"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f2.JPG"></a></p> <p> Con el anticuerpo monoclonal MCA13 (t&eacute;cnica <i>Elisa</i>-DAS) el cual es discriminante de aislados severos de suaves con un 95% de confiabilidad, se determin&oacute; positividad, con un rango de DO entre 0,600 y 1,5, densidades que fueron 2 veces superiores a la DO presentada por el control negativo (DO = 0,150) (<a href="#t1">tabla 1</a>). Los aislados controles positivos para CTV B272 y B274 fueron negativos para este anticuerpo (DO = 0,200) confirmando la condici&oacute;n de aislados suaves, como bien se conoce por su expresi&oacute;n de s&iacute;ntomas en plantas indicadoras, mientras que el aislado severo B128 , que produce SP en Toronja, tuvo una OD = 1.,2 positiva para el anticuerpo MCA13. Es decir, que los aislados de las LT y de los Ca est&aacute;n conformados por variantes de CTV de tipo severo, que pueden expresar en campo diferentes s&iacute;ntomas severos dependiendo de las condiciones ambientales y del hu&eacute;sped. Es de anotar que las LT utilizadas presentaban en campo una sintomatolog&iacute;a de SP, que es considerada como severa en la medida en que reduce el vigor de la planta, el tama&ntilde;o del fruto y la producci&oacute;n. De igual manera, en la corteza de los Ca se observ&oacute; SP , como se muestra en la <a href="#f1">figura 1</a>.</p> <p align="center"><a name="t1"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10t1.JPG"></a></p> <p> Los cortes observados en microscop&iacute;a de luz con la tinci&oacute;n Azure A permitieron detectar la presencia de inclusiones citoplasm&aacute;ticas de coloraci&oacute;n azul, en todo el tejido conductor, conformadas por acumulaciones de prote&iacute;nas virales o part&iacute;culas virales. Mediante la IMI se comprob&oacute; que las regiones reconocidas por el colorante Azure A corresponden a regiones positivas al CTV a trav&eacute;s de la detecci&oacute;n con los anticuerpos monoclonales 3CA5 + 3DF1, teniendo en cuenta que el corte de tejido analizado por Azure A fue el mismo que se imprimi&oacute; en la membrana de nitrocelulosa (<a href="#f3">figura 3</a>).</p> <p align="center"><a name="f3"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f3.JPG"></a></p> <p> En el presente trabajo se encontraron algunas inclusiones, aumento de vacuolas y c&eacute;lulas colapsadas en los campos analizados en el microscopio electr&oacute;nico que no se observaron en el control negativo (<a href="#f4">figura 4</a>).</p> <p align="center"><a name="f4"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f4.JPG"></a></p> <p> La amplificaci&oacute;n positiva por IC-RT- PCR del gen de la prote&iacute;na mayor de la c&aacute;pside de CTV con un fragmento de 679 pb aproximadamente se muestra en la <a href="#f5">figura 5</a>. Por medio de RT-PCR se obtuvieron resultados similares sobre las mismas muestras (la imagen no se incluye), demostrando reproductibilidad de la amplificaci&oacute;n del GPC de LT y Ca, en las dos metodolog&iacute;as. Existiendo cebadores espec&iacute;ficos para la detecci&oacute;n de variantes de CTV suaves y severas, estos cebadores se pueden utilizar ya sea con la t&eacute;cnica de PCR bi-direccional (Cevik et &aacute;l., 1996) o con la t&eacute;cnica de IC-RT-PCR en un solo tubo para obtener dos bandas de tama&ntilde;o diferente en la migraci&oacute;n de fragmentos en el gel de agarosa.</p> <p align="center"><a name="f5"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f5.JPG"></a></p> <p> Con la hibridaci&oacute;n <i>in situ</i> empleando una sonda marcada con digoxigenina, sintetizada para detectar el gen de la c&aacute;pside de CTV a partir de los cebadores CTV espec&iacute;ficos (CTV 42 y 43), se identificaron regiones de hibridaci&oacute;n en los vasos conductores en los cortes de pec&iacute;olo (<a href="#f6">figura 6</a>).</p> <p align="center"><a name="f6"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f6.JPG"></a></p> <p> Las diferentes t&eacute;cnicas utilizadas en este trabajo de tipo serol&oacute;gico (IMI, <i>Elisa</i>-DAS), moleculares (IC-RT-PCR, hibridaci&oacute;n <i>in situ</i>) y &oacute;pticas (microscop&iacute;a de luz y microscop&iacute;a electr&oacute;nica), permitieron detectar al CTV en los aislados de Lima Tahit&iacute; mantenidos por Corpoica Meta, y en las pl&aacute;ntulas de Calamondino. El uso conjunto de estas metodolog&iacute;as es interesante, algunas de ellas son propuestas de implementaci&oacute;n original como la hibridaci&oacute;n <i>in situ</i> y el &ldquo;merge&rdquo; o sobreposici&oacute;n entre el resultado de Azure A y detecci&oacute;n con anticuerpos (IMI) que permitieron el diagn&oacute;stico y la visualizaci&oacute;n del CTV tanto en algunos aspectos biol&oacute;gicos de localizaci&oacute;n viral en el tejido <i>in situ</i> (microscop&iacute;a, IMI, hibridaci&oacute;n <i>in situ</i>, serolog&iacute;a) como en algunos aspectos bioqu&iacute;micos como la amplificaci&oacute;n y detecci&oacute;n del gen de la prote&iacute;na de la c&aacute;pside por IC-RT-PCR, e hibridaci&oacute;n <i>in situ</i>, debidos a la infecci&oacute;n con el CTV. Es importante mencionar que los aislados utilizados en este trabajo ten&iacute;an expresi&oacute;n de SP y se hab&iacute;a informado previamente la detecci&oacute;n de variantes SP severa utilizando sondas CTV espec&iacute;ficas (B3A). Entonces, puesto que ya se conoc&iacute;a la presencia de variante SP en estos aislados, no era el inter&eacute;s ahondar en este aspecto sino presentar otras propuestas metodol&oacute;gicas simples para la detecci&oacute;n del CTV. Tanto en LT como en Ca, se estableci&oacute; la presencia de variantes de tipo severo, al usar el anticuerpo monoclonal discriminante MCA13, que como ha sido reportado es un anticuerpo que discrimina entre variantes severas y suaves del CTV con un 95% de confiabilidad. Hay que tener en cuenta que la detecci&oacute;n con este anticuerpo es a &ldquo;grosso modo&rdquo;, es decir, que incluye la positividad a todas las variantes sintom&aacute;ticas severas de CTV como son SP o SY o QD, las cuales pueden estar presentes en un mismo aislado. A partir de los resultados de severidad utilizando anticuerpos anti CTV, y las t&eacute;cnicas IMI y de <i>Elisa</i>-DAS, se prosigui&oacute; a realizar las metodolog&iacute;as para la detecci&oacute;n viral por microscop&iacute;a, sobre muestras de peciolo positivas y severas para la infecci&oacute;n por CTV. Con la tinci&oacute;n con Azure A y con la observaci&oacute;n bajo microscop&iacute;a de luz se pudo visualizar un gran campo de inclusiones citoplasm&aacute;ticas a nivel del floema y de las c&eacute;lulas acompa&ntilde;antes, t&iacute;picas de la localizaci&oacute;n del CTV, que es una part&iacute;cula viral que se limita a la zona de vascularizaci&oacute;n (floema) de la planta. Sin embargo, con esta tinci&oacute;n no se pudo delimitar cu&aacute;les regiones corresponden a la presencia de inclusiones virales y cu&aacute;les pueden corresponder al virus o a otro tipo de restos de la planta. Por tanto, al utilizar de manera original la superposici&oacute;n del mismo tejido expuesto a tinci&oacute;n con Azure A, y expuesto a anticuerpos anti CTV sobre la secci&oacute;n impresa en membrana de nitrocelulosa por la t&eacute;cnica IMI, se determin&oacute; que no existe una completa correspondencia entre los tejidos detectados por las dos t&eacute;cnicas, y que los anticuerpos delimitan m&aacute;s la localizaci&oacute;n espacial en el tejido de las inclusiones virales. Una posible raz&oacute;n ser&iacute;a que IMI solamente est&aacute; detectando las regiones en las cuales est&aacute; presente la c&aacute;pside viral, puesto que los anticuerpos empleados est&aacute;n dirigidos a esta prote&iacute;na espec&iacute;ficamente, mientras que para la tinci&oacute;n con Azure A se reporta que la uni&oacute;n de este colorante se realiza frente a acumulaciones de nucleoprote&iacute;na localizadas en los haces vasculares, por tanto la detecci&oacute;n pudo ser m&aacute;s amplia o, por otro lado, m&aacute;s inespec&iacute;fica incluyendo fragmentos propios de la planta. De otra parte, por microscop&iacute;a electr&oacute;nica en los microcortes de pec&iacute;olo se observaron vacuolas gigantes e inclusiones que hacen parte de las malformaciones citop&aacute;ticas informadas con esta infecci&oacute;n, y para los efectos citoplasm&aacute;ticos de otros virus (Ecale Zhou et &aacute;l., 2002, Brlansky et &aacute;l., 2002). Las t&eacute;cnicas utilizadas miden aspectos diferentes por lo que no son exactamente comparables entre s&iacute; pero pueden servir, individualmente o en conjunto, para estudios investigativos o de diagn&oacute;stico viral. IMI es altamente sensible y sencilla, y aunque cualitativa, permiti&oacute; un rastreo r&aacute;pido de la infecci&oacute;n en el &oacute;rgano-pec&iacute;olo analizado, ubicando claramente la acumulaci&oacute;n viral en las zonas correspondientes al floema, con correspondencia con aquellas con la tinci&oacute;n Azure A. La t&eacute;cnica <i>Elisa</i>-DAS proporcion&oacute; informaci&oacute;n cuantitativa del t&iacute;tulo viral en el tejido, en la medida en que se utiliz&oacute; la misma muestra para realizar <i>Elisa</i>, IMI, IC-RT-PCR. La hibridaci&oacute;n <i>in situ</i> y la microscop&iacute;a electr&oacute;nica, son &uacute;tiles para estudios morfol&oacute;gicos o de expresi&oacute;n de genes virales durante la infecci&oacute;n (Ecale Zhou et &aacute;l., 2002; Borlido et &aacute;l., 2002; Takeshita et &aacute;l., 2004). Es bastante posible que estas metodolog&iacute;as se puedan utilizar en propuestas investigativas o de diagn&oacute;stico para otras especies virales utilizando los cebadores y anticuerpos virus espec&iacute;ficos requeridos.</p> <p><b> Conclusiones </b></p> <p> La tinci&oacute;n con Azure A permite localizar &ldquo;inclusiones virales&rdquo; en el floema y c&eacute;lulas asociadas, pero con poca claridad sobre la presencia de las acumulaciones virales en los haces vasculares; por tanto, de manera original, para la detecci&oacute;n espec&iacute;fica del CTV en el floema en este trabajo se utiliz&oacute; de una parte microscop&iacute;a de luz y tinci&oacute;n con Azure de los cortes transversales de pec&iacute;olo continuando con la superposici&oacute;n &ldquo;merge&rdquo; de im&aacute;genes de la misma secci&oacute;n expuesta a anticuepos anti CTV a trav&eacute;s de la t&eacute;cnica ser&oacute;logica de &ldquo;tissue printing&rdquo; o inmunoimpresi&oacute;n. De otra parte, la sonda espec&iacute;fica de hibridaci&oacute;n utilizada, derivada de secuencias del gen de la prote&iacute;na mayor de la c&aacute;pside del CTV, permiti&oacute; reconocer de manera original la especificidad de infecci&oacute;n con CTV en las c&eacute;lulas de floema y acompa&ntilde;antes de los cortes de pec&iacute;olo. Es decir, que la sonda reconoci&oacute; en los viriones &ldquo;parcialmente descubiertos&rdquo; secuencias del gen de la prote&iacute;na de c&aacute;pside impresas en las membranas de nitrocelulosa que mostraron correspondencia de localizaci&oacute;n en el floema de la planta. Sobre los cortes transversales de pec&iacute;olo realizados con micr&oacute;tomo se detectaron con microscop&iacute;a electr&oacute;nica los cambios en la estructura y ultraestructura celular, con presencia de grandes vacuolas debidas a la infecci&oacute;n con este fitopat&oacute;geno confirmando los resultados de la literatura sobre vacuolizaci&oacute;n para otros c&iacute;tricos infectados por el virus. Las metodolog&iacute;as utilizadas en conjunto por primera vez, algunas de manera original, son sencillas y permiten observar la localizaci&oacute;n y la distribuci&oacute;n viral dentro de la planta infectada, y pueden ser &uacute;tiles para detecci&oacute;n de otras especies virales. Se se&ntilde;ala la importancia de las t&eacute;cnicas serol&oacute;gicas y de amplificaci&oacute;n por IC-RT-PCR para la detecci&oacute;n viral r&aacute;pida y masiva. Seg&uacute;n nuestro conocimiento es la primera vez que se realiza la detecci&oacute;n del CTV en plantas ornamentales y en Lima Tahiti utilizando este conjunto de t&eacute;cnicas  serol&oacute;gicas, moleculares y &oacute;pticas , las cuales no son per se comparables entre s&iacute; por cuanto eval&uacute;an aspectos bioqu&iacute;micos y biol&oacute;gicos distintos, y se pueden utilizar independientemente ya sea para efectos de investigaci&oacute;n b&aacute;sica o de diagn&oacute;stico de plantas &uacute;nicas (microscop&iacute;a electr&oacute;nica, hibridaci&oacute;n <i>in situ</i>, Azure A y serolog&iacute;a) o de diagn&oacute;stico masivo (serolog&iacute;a, IC-RT-PCR, hibridaci&oacute;n <i>in situ</i>). En Colombia, la Lima Tahit&iacute; es una especie interesante para la exportaci&oacute;n, y es poco lo que se ha estudiado con relaci&oacute;n a la susceptibilidad al CTV. Tambi&eacute;n es poco lo que se sabe sobre los efectos del CTV en c&iacute;tricos ornamentales como los calamondinos, que se utilizan en los bancos de germoplasma, viveros y cultivadores como patrones de injerto a pesar de ser reservorios del CTV incluyendo variantes de tipo severo, lo que puede potenciar la expresi&oacute;n de s&iacute;ntomas severos. Es importante continuar estudios de diferente orden (serol&oacute;gicos, moleculares, biol&oacute;gicos y de microscop&iacute;a) para ampliar la caracterizaci&oacute;n de cepas virales y vislumbrar estrategias futuras de control viral.</p> <p><b>Agradecimientos</b></p> <p> Las autoras expresan sus agradecimientos a la Universidad Nacional de Colombia (DIB, Instituto de Biotecnolog&iacute;a, y al Laboratorio de Microscop&iacute;a) por la financiaci&oacute;n del presente trabajo; al doctor Javier Orduz y a Corpoica-Meta por la colaboraci&oacute;n con las muestras c&iacute;tricas; al doctor G. Nolasco de la Universidad de Algarbe, Portugal, por la donaci&oacute;n del anticuerpo SP6; al doctor S. Garnsey por la donaci&oacute;n del anticuerpo MCA13, y al doctor Pedro Moreno por la donaci&oacute;n de los anticuerpos 3CA5 + 3DF1.</p> <p><b>Referencias bibliogr&aacute;ficas</b></p> <p>1 Acosta, O., Alegr&iacute;a, A., Guzm&aacute;n, M., Lee, R., Niblett, C., Pe&ntilde;aranda, J. 1994. El Virus de la Tristeza de los C&iacute;tricos: una grave amenaza para la citricultura colombiana. Bogot&aacute;: Ed. Cient&iacute;fica.</p> <p>2 Aubert, B., Etienne, J., Cottin, R., Leclant, F., Cao Van, P., Villaume, C., Jaramillo, C., Barneau, G. 1992. Citrus tristeza virus a new threat for the Caribbean basin. Report of a survey to Colombia, Dominican Republic, Guadaloupe. Martinique and Trinidad. Fruits 3: 393-404.</p> <p>3 Bar-Joseph, M., Marcus, R., Lee, R. F. 1989. The continuous challenge of Citrus tristeza virus control. 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