DOI: https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v17n2.48522
ARTÍCULO CORTO
Estandarización de un protocolo para Northern blot no radioactivo usado en la detección de pequeños RNA en células Vero
Standardization of Northern blot non-radioactive protocol used in the detection of small RNAs in Vero line cells
Natalia Campillo-Pedroza*, Juan Pablo Franco Salazar*, Juan Carlos Gallego- Gómez*
* Grupo de Medicina Molecular y de Translación. Faculta de Medicina. Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. naticampillo@gmail.com, jp.salazar04@gmail.com, juanc.gallegomez@gmail.com.
Recibido: enero 21 de 2015 Aprobado: octubre 23 de 2015
Resumen
El interés en la detección, identificación, y caracterización funcional de los pequeños RNAs no codificantes (sRNAs), ha generado la necesidad de optimizar las metodologías comúnmente usadas en su detección, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR) y Northern blot, con el fin de que sean más sensibles y específicas. A pesar de la baja sensibilidad del Northern blot, esta metodología continúa siendo de uso común en la detección de sRNAs porque permite detectar el RNA pequeño así como a sus precursores, razón por la cual se usa como una metodología complementaria en este tipo de investigaciones. En este trabajo se describe la implementación de un nuevo protocolo para Northern blot no radioactivo, con modificaciones dirigidas a mejorar su sensibilidad y especificidad. El diseños de la sonda con la tecnología LNA, el marcaje de esta con Digoxigenina y por último la fijación del RNA a la membrana mediante 1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carboniimide (EDC) y finalmente se discuten los fundamentos teóricos de estos cambios.
Palabras clave: 1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carboniimide), Digoxigenina, Northern blot no radioactivo, Sondas LNA, sRNAs.
Abstract
The interest in detection, identification and functional characterization of small non-coding RNAs (snRNAs), has generated the need to optimize the methodologies commonly used in its detection in specificity and sensitivity, The Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) and Northern blot. Even though the low sensitivity of Northern blot, this method continues to be commonly used in the sRNAs, because its capacity to detect the sRNA and its precursor, which is the reason why Northern blot is used as complementary method in this sort of Research.
This work describes the implementation of an innovative non-radioactive Northern blot protocol, with modifications that improving the sensibility and specificity, with the discussion of the theoretical foundations of such modifications.
Key words: 1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carboniimide), Digoxigenine, Northern blot non-radioactive, LNA probe, sRNAs.
Introducción
Los pequeños RNA no codificantes (sRNAs, small non-coding RNAs) son secuencias involucradas en diversas funciones celulares, tanto constitutivas como de regulación. Desde el descubrimiento del primer RNA pequeño, lin-4 (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993), la lista de pequeños RNAs no codificantes ha aumentado, reportándose la participación de alguno de ellos en procesos biológicos como corte y empalme de exones, traducción genética, desarrollo, diferenciación, muerte celular, control metabólico, defensa antiviral, regulación de expresión genética transcripcional y post-transcripcional (Gomes et al., 2013; van Wolfswinkel & Ketting, 2010; Winter et al., 2009). La función para muchos de estos sRNAs aún se desconoce, por lo cual el interés y la necesidad de su detección, caracterización y validación funcional continúan.
Las metodologías utilizadas para la detección de los sRNAs, enfrentan grandes desafíos impuestos por su tamaño (≤200 nucleótidos) y el bajo nivel de expresión de los pequeños RNAs, que en algunos casos no supera el umbral de detección de las técnicas usadas hasta el momento. Por las limitaciones anteriormente mencionadas, los métodos más utilizados para la detección de sRNAs (RT-qPCR y Northern blot) deben ser constantemente optimizados para mejorar la sensibilidad, especificidad de detección y cuantificación.
El Northern blot es una metodología directa que permite la detección de los pequeños RNAs, sus secuencias precursoras o intermediarias, evaluar sus propiedades de expresión y determinar su tamaño Wang & Yang (2010) razón por la cual sigue siendo ampliamente usado. El proceso general del Northern blot consiste en extraer RNA total, separarlo por tamaño mediante electroforesis y transferir e inmovilizar en una superficie sólida (membrana). La sonda con secuencia complementaria al RNA de interés, es marcada con métodos radioactivos o no radioactivos, luego se incorpora en la membrana que contiene el RNA inmovilizado y finalmente la hibridación con la secuencia complementaria es detectada.
Para la metodología Northern blot se han publicado diferentes protocolos que varían principalmente en el diseño y marcaje de la sonda, donde comúnmente se utilizan sondas de DNA marcadas con fósforo radioactivo (32P) (Gurman S Pall & Hamilton, 2008; Várallyay et al., 2008). Un nuevo protocolo para Northern blot no radiactivo denominado LED (LNA-EDC-DIG), fue reportado Kim et al. (2010), integra tres metodologías desarrolladas separadamente, que modifican a su vez tres aspectos del proceso determinantes de la especificidad y sensibilidad del Northern blot. Las modificaciones consisten básicamente en remplazar las sondas de oligonucleótidos de DNA, por sondas que contienen ácidos nucleicos bloqueados o no accesibles (Locked Nucleic Acid, LNA). La inmovilización del RNA en la membrana, que normalmente se hace con luz ultravioleta (UV), es remplazado por el uso de EDC (1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carboniimide)). Adicionalmente, el uso de radioisótopos (32P), el método más común de marcaje de sondas, con el cual se deben asumir todos los riegos de la radioactividad, es sustituido por el uso de Digoxigenina (DG).
Este nuevo protocolo aumenta la sensibilidad y especificidad en la detección de pequeños RNAs por Northern blot, por lo que su uso e implementación en los estudios de detección, caracterización y funcionalidad de nuevos sRNAs será de gran utilidad. Por lo anterior, la descripción de la implementación y modificaciones realizadas de este protocolo usado en la detección de un RNA pequeño, así como la explicación y discusión de los fundamentos teóricos de las modificaciones planteadas son el objetivo de este trabajo.
Materiales y Métodos
Extracción de RNA total a partir de células Vero
Todas las extracciones de RNA total se hicieron con TRI-reagent (Sigma™), de manera breve 4x106 células Vero fueron lavadas con PBS 1X para eliminar proteínas, se re-suspendieron en 1ml de Trizol, se incubaron 3 minutos (min) a temperatura ambiente (TA), se adicionó 200µl de Cloroformo (Merck™) y se centrifugó a 5000 revoluciones por minuto (rpm) durante 15 min, se tomó la fase acuosa y se adicionó Isopropanol frío, se incubó durante 10 min a -20°C, nuevamente se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min usando microcentrífuga (Eppendorf™, 5810 R). El pellet se lavó con 1ml de Etanol al 75% con vortex suave, se centrifugó nuevamente a 10.700 rpm durante 5 min, se dejó secar el etanol a TA y posteriormente se re-suspendió el pellet en 100µl de agua tratada con DEPC. Con NanoDrop 2000 (Thermo Scientific™) se determinó pureza y concentración del RNA extraído.
Northern blot no radioactivo
El RNA extraído, fue evaluado por Northern blot no radioactivo. Para esto se modificó, implementó y estandarizó el protocolo para detectar miRNAs, previamente descrito Kim et al. (2010), el protocolo se desarrolló en 4 pasos (figura 1): 1) Separación del RNA en gel de poliacrilamida, 2) Transferencia e inmovilización del RNA, 3) Pre-hibridación e Hibridación de la sonda, 4) Detección del RNA. Para implementar el protocolo se usó una sonda específica y complementaria al RNA pequeño nuclear U6 (snRNA U6, del inglés small nuclear RNA) conteniendo nucleótidos modificados LNA (Exiqon™), como control negativo se usó una sonda también de nucleótidos modificados LNA (Exiqon), pero en una secuencia desorganizada "Scramble".
Resultados y discusión
Con el protocolo descrito anteriormente se observó señal cuando el RNA fue evaluado con la sonda específica del snRNA U6 (figura 2), un RNA pequeño nuclear involucrado en el ensamblaje y funcionamiento del complejo de corte y empalme celular, con un tamaño aproximado de 150 nucleótidos (nt). Cuando se evaluó el mismo RNA con la sonda de control negativo Scramble (con nucleótidos desorganizados) no se observó señal (figura 5), lo que indica que la señal observada con la sonda complementaria al snRNA U6 es específica. Con lo anterior se demuestra la sensibilidad y especificidad del protocolo en la detección de un snRNA constitutivo celular.
Como se mencionó inicialmente en este protocolo se proponen cambios en tres aspectos que contribuyen a la especificidad, sensibilidad y seguridad de esta técnica, como son el tipo de sonda, su marcaje y el proceso de inmovilización del RNA en la membrana. Para entender la razón de las modificaciones realizadas y con el fin de que este protocolo pueda ser implementado y modificado posteriormente, a continuación se explicarán y discutirán los fundamentos teóricos de los cambios realizados en el mismo.
Diseño de sondas
Cuando se diseñan y sintetizan moléculas similares a los ácidos nucleicos, como las sondas utilizadas en Northern blotting, tres características generales deben tenerse en cuenta: primero, las moléculas diseñadas deben ser eficientes en la oligomerización. Segundo, deben tener alta afinidad y reconocimiento selectivo del ácido nucleico complementario; esta propiedad puede ser medida por los valores de temperatura de fusión (Tm), con altos valores menor afinidad, valores bajos mayor afinidad. Tercero, tener buena solubilidad en agua (Wengel 1999).
Para obtener sondas con oligomerización eficiente y alta afinidad en la hibridación con las cadenas complementarias de los ácidos nucleicos, estas deben ser diseñas de forma tal que la estructura de cada una de estas sondas tenga una configuración estructural lo más similar posible a la encontrada en los ácidos nucleicos naturalmente Petersen et al. (2002). Los ácidos nucleicos naturalmente tienen dos configuraciones estructurales, el tipo A (también llamado tipo N) y el tipo B (también llamado tipo S). Estas conformaciones están dadas por los cambios de estructura en los azúcares de los nucleótidos (Wenge 1999). La ribosa (azúcar del RNA) normalmente se encuentra con configuración del tipo A, mientras que el DNA puede encontrarse en cualquiera de las dos configuraciones dependiendo del ambiente (fuerza iónica y humedad relativa) (Wengel 1999) (figura 3).
Por su parte los LNA (Locked Nucleic Acids) son nucleótidos modificados, su estructura se caracteriza por tener un puente de metileno que conecta el 2'-Oxigeno con el 4'-Carbono de la ribosa (figura 4). Este puente resulta en una conformación bloqueada C3'-endo, impidiendo que el nucleótido adopte otra configuración diferente a la A, configuración en la que se encuentra el RNA naturalmente (Gurman S Pall & Hamilton, 2008; Wengel 2009).
Esto hace que las sondas LNA usadas en el protocolo propuesto por Kim et al., 2010 tengan alta afinidad y estabilidad térmica representada en bajos valores de Tm y mayor especificidad.
Inmovilización del RNA en la membrana
La inmovilización del RNA en la membrana inducida por UV sucede por el entrecruzamiento entre fracciones de residuos de uracilo y los grupos amino cargados positivamente presentes en la membrana Sambrook et al. (2001). El proceso tiene tres desventajas que afectan notablemente la detección de pequeños RNAs. Ocurre degradación por UV de los grupos funcionales (grupos amino de la membrana) requeridos para el apareamiento de bases. Los RNA se fragmentan, disminuyendo su longitud impidiendo conservar las secuencias completas, limitándose así la hibridación de las sondas. Como última desventaja, tenemos que el número de bases involucradas no puede ser controlado en la reacción inducida por UV, por esto podría ocurrir un entrecruzamiento excesivo, reduciendo la disponibilidad de bases para la hibridación con una sonda complementaria.
A pesar de lo anterior el entrecruzamiento entre RNA y membrana inducido por UV es rápido, poco costoso y eficiente para RNA con más de 70nt Gurman S Pall & Hamilton (2008). Sin embargo lo ideal para la detección por hibridación de pequeños RNAs, debe ser el acoplamiento de la secuencia de forma tal que permanezca completamente disponible para la hibridación con la sonda complementaria (Gurman et al., 2008; Gurman et al., 2007). El entrecruzamiento por medio del extremo 5' (diferentes modificaciones pueden encontrarse en el extremo 3', por esto se prefiere el 5' para un entrecruzamiento) de los pequeños RNAs, y no a partir de las bases nitrogenadas como sucede usando UV, es una alternativa. Este tipo de entrecruzamiento es posible realizarlo usando 1- Ethyl-3 (3-dimetilaminopropil) Carboniimida (EDC), compuesto que previamente ha sido usado para entrecruzar el extremo 5' de oligonucleótidos sintéticos en diferentes substratos sólidos Gurman Singh Pall et al. (2007). El uso del EDC en la inmovilización del RNA en la membrana dirigido a la detección de miRNA surge como una alternativa que mejora de manera notable la sensibilidad en la detección de estas pequeñas moléculas.
Marcaje de sondas
El análisis de transferencia de Northern blot usando radioisótopos es la metodología usada actualmente para la detección de sRNAs, sin embargo, esta técnica generalmente es dispendiosa, costosa, implica riesgos ambientales y laborales, adicionalmente en nuestro país existe una justificada y seria exigencia para no promover el uso de radioisótopos. Como una alternativa, el sistema de marcaje (DIG)-Digoxigenina basa su sistema de detección en el proceso de quimioluminiscencia, lo que genera varias ventajas en comparación a las técnicas de marcado radioactivo, como: alta sensibilidad, tiempos cortos de exposición, vida útil más larga, y mayor seguridad (Ramkissoon et al., 2006).
Conclusión
La creciente necesidad e interés de identificar, detectar, caracterizar y validar nuevos sRNAs, ha ido de la mano con la optimización y mejora de las metodologías utilizadas para tales fines, dándose lugar a protocolos como el descrito previamente. El conocer y entender los fundamentos teóricos por los cuales se optimizan protocolos como el descrito en este trabajo, aporta al desarrollo, planteamiento de nuevas optimizaciones, a la creación de nuevos protocolos y metodologías que puedan ser consideradas en el desarrollo de investigaciones de este tipo.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Departamento Administrativo de Ciencia Tecnología e Innovación -COLCIENCIAS- por su apoyo en la realización de este trabajo, mediante la financiación del proyecto 111554531621. NCP tuvo financiación también de Colciencias como Joven Investigadora, durante el período 2010-2011. JCGG agradece a la Universidad de Antioquia, por la concesión de su Dedicación Exclusiva 2014-2015 para la Facultad de Medicina.
Referencias
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