_____________________REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL. VI No. 2 Diciembre 2004 43-53
Análisis exploratorio para la optimización de un medio de cultivo para la fermentación de Bacillus
thuringiensis
Exploratory analysis for the optimization of culture media for Bacillus thuringiensis fermentation
Jenny M. Escobar*, E. Milena Pardo*, Gustavo Buitrago*, Luis A. López
RESUMEN
Los insecticidas químicos usados indiscriminadamente traen riesgos para la salud de quienes los aplican y de quienes consumen alimentos contaminados con éstos; además atacan insectos benéficos, aves, peces y mamí­feros. Como alternativa al uso de insecticidas químicos están los bioinsecticidas, como es el caso de Bacillus thuringiensis, que es específico para el insecto plaga que se desea controlar. Un factor clave en la producción por fermentación de biopesticidas basados en Bacillus thuringiensis es el diseño del medio de cultivo, el cual debe ser económico y contener todos los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo. Del cultivo se espera que rinda una alta producción de ingrediente activo conformado por los cristales que contie­nen las toxinas y por la espora del microorganismo, y que este ingrediente posea el valor de toxicidad requeri­do para la formulación del producto comercial. En este trabajo se estudiaron diferentes medios de cultivo, se seleccionó un medio promisorio y se optimizó para la fermentación con una cepa nativa de B. thuringiensis te­niendo en cuenta no sólo el ingrediente activo sino también los costos que éste genera en materias primas. Se lograron concentraciones finales de ingrediente activo entre 15 y 16 g/L con un costo aproximado por mate­rias primas de $650/kg producto (aproximadamente US$0,30/kg producto). Para esto se utilizó la metodología de superficies de respuesta en un diseño compuesto central (DCC) para la fase de experimentación, y para la fase de optimización se utilizó el método desarrollado por Derringer y Suich (1980) para múltiples respuestas.
Palabras clave: biopesticidas, medios de cultivo, superficie de respuesta, respuesta dual, gráficas de contorno, diseño compuesto central.
ABSTRACT
Agrichemical involve health risks for producers and consumers; they can also affect beneficial insects, birds, fish and mammals. Bacillus thuringiensis-based biopesticides specific for insect plagues are available, which, represent an alternative to traditional chemically-based products. Culture media design is an impor-tant factor in the production of biopesticides based on Bacillus thuringiensis. The media have to be economi-cal and they must contain all the nutrition factors required by the bacteria. The yield of active ingredient, comprising the toxin-containing crystal protein and bacterial spores, must be high and with adequate toxi-city to formulate the biopesticide. In this work we studied different culture media and optimised a promi-sing culture medium for B. thuringiensis fermentation to obtain an active ingredient for use as raw material in manufacturing a biopesticide. The final concentration of active ingredient was 15 to 16 g/L and the raw material cost around US $0,30/kg product. Calculations for the experimental phase were done using the res-
* Ingenieros químicos. Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá. Grupo de
Biopesticidas. Correo electrónico: gbuitragoh@unal.edu.co ** Estadístico, Ph. D. Estadística. Profesor asociado, Departamento de Estadística, Universidad Nacional de Colombia.
Recibido: septiembre 3 de 2003. Aceptado: julio 30 de 2004.
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REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL.VI No. 2 Diciembre 2004 43-53
ponse surface technique in a central composite design (CCD), the optimisation phase used Derringer and Suich (1980) method for dual response.
Key words: Biopesticides, culture media, surface response, dual response, contour plots, central composite design.
INTRODUCCIÓN
El 15% de las pérdidas mundiales en agricultura se debe al ataque de insectos, por esta razón, el produc­tor agrícola se ve obligado a invertir en el control de plagas, aumentando los costos de producción. Los in­secticidas químicos pueden generar resistencia en los insectos, obligando a aumentar las dosis e incre­mentando los costos. Adicionalmente, generan dese­quilibrio en el ambiente. El uso de biopesticidas es una alternativa económica al tratamiento con insecti­cidas químicos, cada vez más difundida en el sector agrícola en razón de la necesidad de producir bajo cri­terios de sostenibilidad ambiental.
Las características del ingrediente activo determi­nan en gran medida la economía del proceso, por esta razón la optimización de la fermentación toma como variables respuesta la cantidad y calidad del ingredien­te activo producido, las cuales dependen del medio y condiciones de cultivo empleados. Este trabajo desa­rrolla una estrategia para optimizar la producción de in­grediente activo en cultivos con una cepa nativa de B. thuringiensis, recurriendo a una herramienta estadística para la validación y el análisis de los datos generados.
Muchos autores han estudiado medios de culti­vo para B. thuringiensis (Smith, 1982; Arcas et al., 1984; Avignone y Arcas, 1992; Pearson y Ward, 1988). Uno de los artículos más relacionados con el presente trabajo fue el desarrollado por Liu y Tzeng (1998), quienes buscaban encontrar las concentra­ciones de almidón, harina de pescado, CaCO3 y (NH4)2SO4 que produjeran la mayor concentración de esporas, utilizando la metodología de superficies de respuesta para una sola respuesta. Sin embargo, Liu y Tzeng maximizaron el número de esporas viables sin tener en cuenta los costos que el medio generaba; en este trabajo los objetivos contemplaron, además de obtener concentraciones altas de ingrediente acti­vo, también obtener un producto económico, es decir, se buscó maximizar el peso seco y minimizar los cos­tos. Los costos trabajados corresponden sólo a los de materias primas sin incluir los costos de producción.
En el presente trabajo se estudiaron y evaluaron medios de cultivo reportados en la literatura (tabla 1),
a partir de estos resultados se seleccionó para optimi­zar aquel que produjo las mayores concentraciones de ingrediente activo medido como peso seco (espo­ra y cristal paraesporal). De los medios de cultivo eva­luados, el propuesto por Galán (1993) produjo los me­jores resultados. Éste utiliza melaza, harina de soya, jarabe de maíz y CaCO3.
Para la experimentación se aplicó el diseño com­puesto central que está enmarcado en la metodología de superficie de respuesta, dado que dentro del marco de la optimización de medios de cultivo, y en general de productos o procesos, es una de las técnicas más empleadas para desarrollar y formular nuevos produc­tos y mejorar productos existentes (Myers y Montgo-mery, 1995). Para la fase de optimización se trabajaron respuestas duales bajo el método desarrollado por Derringer y Suich (1980) que optimizan conjuntamen­te dos respuestas teniendo rangos a priori de estas variables. Este método ofrece varias ventajas compa­rado con otros métodos desarrollados posteriormente (Myers y Montgomery, 1995).
Al realizar el análisis de los resultados obtenidos en los cultivos, el modelo que mejor se ajustó para la concentración final de ingrediente activo fue el lineal (ecuación 2), para el cual el punto estacionario (que se interpreta como el punto óptimo) se encontró en el borde de la región experimental; esta condición llevó a realizar una exploración de la superficie por medio de gráficos en tres dimensiones (3d) y de gráficos de contornos, como se explica más adelante (Myers y Montgomery, 1995). Para minimizar en función del costo se ajustó un modelo cuadrático (ecuación 3). Esta exploración mostró que la variable respuesta peso seco presenta un comportamiento creciente, a medida que las concentraciones de los componentes del medio aumentan, sin observarse una zona en la superficie de respuesta donde se encuentre una cur­vatura que dé indicio de un máximo.
MATERIALES Y MÉTODOS
La producción de biopesticidas basados en B. thu­ringiensis se realiza comercialmente por fermenta­ción sumergida, bajo condiciones controladas que
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ANÁLISIS EXPLORATORIO PARA LA OPTIMIZACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO
Tabla 1. Composiciones en g/L de los siete medios estudiados inicialmente
~~~~~~~_^^ Medio Compuesto ~~—-~-^
Abarca (1992)
HCO (*)
HCO modif. (**)
Galán (1993)
Soler y Té-llez (2002)
Medio Leche (**)
Medio J. M. (**)
Harina de soya
6
-
-
20
2,9
-
-
Hidrolizado de caseína
-
-
-
-
0,5
-
-
Peptona de caseína
-
7
-
-
-
-
-
Extracto de levadura
-
-
-
-
-
0,1
0,1
Puré de tomate
40
-
-
-
-
-
-
Melaza
-
-
3
20
-
10
10
Leche
-
-
-
-
-
10
-
Jarabe de maíz
-
-
7
10
-
-
20
Glucosa
3
-
Maltodextrina
-
-
-
-
2
-
-
CaCl2-2H2O
0,056
0,18
0,24
-
-
-
-
CaCO3
-
-
-
1
-
-
-
KH2PO4
4,650
6,8
6,8
-
8
-
-
K2HPO4
-
-
-
-
2
-
-
FeSO4-7H2O
0,028
0,02
0,0365
-
-
0,002
0,002
(NH4)2SO4
-
-
-
-
-
0,1
0,1
MgSO4-7H2O
0,060
0,002
0,002
-
1
0,002
0,002
MnSO4-4H2O
0,026
0,002
0,0015
-
-
0,002
0,002
ZnSO4-7H2O
0,014
0,014
0,014
-
-
0,002
0,002
KOH
-
-
-
-
3
-
-
* Avignone-Rossa y Arcas (1992).
** Medios propuestos por Grupo de Biopesticidas del IBUN (Pardo, 2003).
aseguren calidad y competitividad al producto. La cepa de B. thuringiensis utilizada fue aislada en el IBUN de muestras de suelo del departamento de Cundinamarca (Colombia), se mantuvo en cajas de Petri con el medio Luria Bertani (LB) (Cerón et al., 1989) y le fue asignado el código IBUN 28.6.
El medio de cultivo empleado para la fermenta­ción de B. thuringiensis debe contener: una fuente de carbono que suministra la energía para los procesos anabólicos (Mignone y Avignone, 1996), una fuente de nitrógeno de origen inorgánico y otra de origen or­gánico para el crecimiento y la esporulación de la bac­teria y para la síntesis de las endotoxinas (Sachida-nandham et al., 1997). Una fuente de carbono comúnmente utilizada es la melaza que en Colombia presenta las concentraciones medias que se indican en la tabla 2. Como fuentes de nitrógeno orgánico se emplean: el jarabe de maíz (tabla 2), la harina de soya (que contiene alrededor de 40% de proteína y 12% de lípidos), el extracto de levadura (Difco) y la caseína. Como fuente inorgánica de nitrógeno se evaluó el
sulfato de amonio (Merck). También es importante la adición de micronutrientes como calcio, potasio, man­ganeso, hierro y magnesio (Pardo, 2003).
Las fermentaciones se realizaron durante 96 ho­ras (tiempo en el cual la esporulación es mayor al 80%), a 30 °C y agitación orbital de 200 rpm, relación de volúmenes 1:10 (volumen de medio/volumen de matraz), 25 mL de medio de cultivo en matraces de 250 mL para evitar la inhibición de crecimiento del ba­cilo por limitación de oxígeno. Los matraces se inocu­laron con asa directamente de una caja de Petri. En ensayos realizados en matraces agitados a escala de laboratorio se ha observado que la esporulación de B. thuringiensis pasa del 70 al 100% cuando el coefi­ciente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa) se incrementa de 38 a 220 h-1 (Ríos y Buitrago, 1999).
En los cultivos se recuperó la biomasa para de­terminar el peso seco según el procedimiento descri­to por Pardo (2003).
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Tabla 2. Composiciones de la melaza y el jarabe de maíz empleados en los experimentos
Debido a que esta relación entre la variable res­puesta y las variables independientes se desconoce, el primer paso consiste en determinar una aproxima­ción apropiada de esta relación. De esta aproxima­ción depende el éxito de la superficie de respuesta. Por lo general se emplea un polinomio de primer o segundo orden sobre alguna región de las variables independientes. Si la respuesta es descrita correcta­mente por una función lineal, la función de aproxima­ción es el modelo de primer orden:
Compuesto
Melaza*
Jarabe de maíz**
Sólidos (%)
78,5
50
Proteínas (%)
6,3
39
Azúcares reductores (%)
11,5
6
Cenizas (%)
16
20
pH
5,5
3,9
Densidad (g/L)
1414
1,2
Grados Brix
86
_
* Ingenio del Cauca, Incauca S. A., Cali, Colombia, 2002. ** Industrias del Maíz, Maizena, Cali, Colombia, 2002.
= po+p1x1+p2x2+...+pnxn+e
(2)
Las variables independientes o controladas (factores) corresponden a los diferentes componen­tes del medio de cultivo; como variables de respues­tas se tomaron el peso seco o ingrediente activo y los costos de materias primas. Adicionalmente se fijaron algunos parámetros como: porcentaje de esporula-ción, tiempo de fermentación, pH y temperatura.
La primera fase de la experimentación se realizó con los medios seleccionados a partir de la literatura (tabla 1); de éstos se escogió el medio Galán que pre­sentó mayores rendimientos en ingrediente activo. A partir de estos resultados, y en el marco de la metodo­logía de superficies de respuesta, surgen dos alterna­tivas de análisis (Myers y Montgomery, 1995): Si los resultados son más bajos que los reportados en la li­teratura, se aplicará la técnica llamada máxima pen­diente en ascenso, que consiste en buscar una región donde pueda estar el punto óptimo. Si los rendimien­tos son mayores o iguales a los obtenidos con el me­dio de cultivo seleccionado, entonces no se busca una región de óptimo sino que se toma el medio base como punto central para buscar el punto óptimo.
Diseño experimental. La metodología de superficie de respuesta se basa en el ajuste de un modelo li­neal en el cual se busca establecer una relación en­tre la o las variables respuesta y las variables inde­pendientes. Puesto que las variables y los niveles varían de un experimento a otro, es conveniente que los valores estén dados en forma estándar (Chávez, 1980); estas variables están representadas porx1, x2,..., xk, y por lo general tienen media cero y varian-za constante. En términos de variables codificadas la ecuación es escrita en la forma:
Pero si existe una curvatura en el sistema debe usarse un polinomio de orden mayor, por ejemplo, el modelo de segundo orden:
= po+¿p¡x¡+¿p¡jx¡2+XXp¡jx¡xj+e (3)
i=1
Para estimar los parámetros del polinomio de aproximación se utiliza el método de mínimos cuadra­dos y el análisis de la superficie de respuesta se hace en términos de la superficie ajustada. La estimación de los parámetros del modelo se hace más eficaz­mente si se utilizan los diseños experimentales apro­piados para recopilar datos (Montgomery, 2002).
Respuesta dual. En muchos casos no sólo se quiere optimizar una respuesta, sino dos o más al mismo tiempo. Cuando se tienen datos con múltiple respues­ta y se analizan separadamente, los resultados no son muy satisfactorios, en especial cuando las res­puestas están correlacionadas. Por ejemplo, análisis separados pueden conducir a conflictos en las reco­mendaciones sobre los niveles de los factores, es de­cir, un nivel de un factor puede mejorar una respuesta pero empeorar otra. Desde los años sesenta se han venido trabajando varios métodos (Cristancho, 2004) con el objetivo de optimizar respuestas duales (dos respuestas), uno de estos es el desarrollado por De-rringer y Suich (1980) que tomó la función de deseabi-lidad desarrollada por Harrington (1965) y la adaptó para utilizarla en la metodología de superficies de res­puesta. Esta función es una transformación de la va­riable respuesta a la escala 0 a 1, en donde 0 repre­senta una respuesta no deseable y 1 representa la respuesta deseable; la optimización simultánea de varias respuestas es reducida a la optimización de una sola respuesta que es la media geométrica de las deseabilidades individuales.
= f(x1,x2,...,xj+e
(1)
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ANÁLISIS EXPLORATORIO PARA LA OPTIMIZACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO
Diseños compuestos centrales. El diseño com­puesto central es probablemente el diseño experi­mental más utilizado para ajustar superficies de res­puesta (Box y Hunter, 2000).Consiste en un factorial o factorial fraccionado 2k aumentado por 2k puntos axiales (±a, 0, 0,..., 0), (0,±,a, 0,..., 0), (0, 0,± a 0,..., 0),...,(0, 0, ...,± a), y nc puntos centrales (0, 0, 0, ..., 0). Cada uno de estos tres componentes juega dife­rentes e importantes papeles dentro del diseño. Los puntos factoriales representan un diseño óptimo de varianza para modelos de primer orden o para mo­delos de primer orden más interacciones de dos fac­tores. Los puntos centrales dan información acerca de la existencia de curvatura en el sistema. Si existe curvatura, la adición de puntos axiales lleva a una estimación eficiente de los términos cuadráticos (Hinkelmann y Kempthorne, 1984).
En el presente artículo se trabajó con la meto­dología de superficies de respuesta, tomando como región del óptimo las concentraciones del medio de cultivo seleccionado bajo un diseño compuesto cen­tral 24. Los cuatro factores fueron: fuente de carbono, fuente de nitrógeno, fuente compleja de nutrientes y sales. La cantidad de ensayos se determina según la cantidad de factores, aquí se tendrían 16 ensayos del componente factorial, más 8 ensayos por los puntos axiales, más nc puntos centrales, en este caso resultaron 12 ensayos, para un total de 36.
Para el análisis se trabajó con los programas SAS versión 8 y con Design-Expert 6.10 (De-sign-Expert 6 User's Guide. 2001).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Luego de la fermentación se recuperó la biomasa para determinar el peso seco según el procedimien­to descrito por Pardo (2003), obteniéndose los resul­tados de la tabla 3.
Se seleccionó el medio propuesto por Galán (1993) debido a que éste produjo las más altas con­centraciones finales de ingrediente activo. A partir de este medio se propuso la matriz de experimentación para el diseño compuesto central (tabla 4). Dicha matriz está compuesta por los puntos factoriales (ni­veles 1 y -1), puntos axiales (niveles a y -a) y puntos centrales (nivel 0).
Involucrando las variables y sus niveles repor­tados se elaboró la matriz de experimentación con 36 ensayos, cuyos resultados se presentan en la ta­bla 5, con los niveles de las variables codificadas.
Para ajustar un modelo a los datos se trabajó con el programa Design-Expert 6.10 (Design-Expert 6 User's Guide. 2001), estableciendo en primer término el orden del modelo que se debe ajustar. Como se tra­bajaron dos respuestas, primero se establecieron los modelos que se ajustan a cada respuesta y luego se optimizó conjuntamente.
Peso seco. Para que los supuestos de normalidad y homocedasticidad se cumplieran, primero se realizó una transformación de la variable respuesta; la transformación fue logaritmo natural. Todos los re­sultados mostrados a continuación corresponden a
Tabla 3. Resultados obtenidos con los medios de cultivo estudiados, medidos en peso seco, porcentaje de esporulación y morfología
Variable Medio cultivorespuesta
Peso seco
(g/L)
%de esporulación
Morfología del cristal
U.F.C. (Esp/mL) 1010
Abarca (1992)
0,690
80
Bipiramidal grande y mediano
6,50
HCO*
0,477
75
Bipiramidal mediano y pequeño
22,00
HCO modificado**
0,558
85
Bipiramidal mediano
24,75
Galán (1993)
10,900
90
Bipiramidal grande
30,75
Soler y Téllez (2002)
0,790
95
Bipiramidal grande y mediano
22,40
Medio leche**
1,620
95
Bipiramidal mediano
-
Medio J. M.**
1,020
95
Bipiramidal mediano
-
* Avignone-Rossa y Arcas (1992).
** Medios propuestos por Grupo de Biopesticidas del IBUN (Pardo, 2003).
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Tabla 4. Concentraciones en g/L para un diseño DCC 24
medio de cultivo. Este análisis se presenta en la tabla 7 encontrándose que todos los compo­nentes son significativos porque el nivel de sig­nificancia es menor del 5% (Prob>F); adicio-nalmente, la magnitud de la Prueba F (columna 5) nos dice que el componente hari­na es el que presenta mayor impacto sobre la respuesta.
Factor
Símbolo
Nivel
-a
-1
0
1
a
CaCO3
X1
0
0,5
1,25
2
2,75
Jarabe de maíz
X2
0
5
12,5
20
27,5
Melaza
X3
0
10
20
30
40
Harina de soya
X4
2,5
10
17,5
25
32,5
la variable transformada, sin embargo las conclusio­nes se dan en términos de la variable real.
En la tabla 6 se presentan los modelos propues­tos; para el modelo lineal el p-valor (columna 6) es menor a 5% (nivel de significancia), por lo que el mo­delo que ajustaría los datos sería el dado por la ecua­ción (2), donde Y es el peso seco, a es el intercepto y P¡ son los coeficientes lineales del modelo.
Teniendo como base el modelo lineal, se pro­cede a realizar el análisis de varianza para determi­nar la significancia de los componentes del modelo, es decir, cuánto aporta al peso seco cada factor del
En la tabla 7 se observa que la prueba de falta de ajuste (Lack of Fit) es no significativa (Montgomery, 1991), por lo que se puede concluir que el modelo propuesto se ajusta adecuadamente a los datos. El modelo matemático a ajustar es el dado en la ecuación (2) y los coeficientes de este modelo se estiman por medio del método de míni­mos cuadrados. El modelo resultante se presenta en la ecuación (4) para variables no codificadas.
Ln(Peso) = 0,816 + 0,086*CaCO3 + 0,0276*Jarabe + 0,0124*Melaza + 0,0367*Harina
(4)
Para que este modelo se ajuste adecuadamen­te a los datos, hay que hacer pruebas de diagnóstico
Tabla 5. Resultados de la experimentación para el diseño central compuesto con las variables codificadas
x1
x2
x3
x4
Peso seco
Costo/kg producto
x1
x2
x3
x4
Peso seco
Costo/kg producto
-1
-1
-1
-1
3,27
1116
0
2
0
0
10,92
635
-1
-1
-1
1
7,60
1122
0
-2
0
0
6,38
1017
-1
-1
1
-1
5,81
714
0
0
2
0
12,17
580
-1
-1
1
1
8,80
1026
0
0
-2
0
7,01
865
-1
1
-1
-1
8,49
474
0
0
0
2
16,58
690
-1
1
-1
1
12,12
734
0
0
0
-2
4,54
372
-1
1
1
-1
8,65
523
0
0
0
0
8,08
812
-1
1
1
1
13,53
695
0
0
0
0
9,46
694
1
-1
-1
-1
4,93
756
0
0
0
0
7,94
827
1
-1
-1
1
8,35
1030
0
0
0
0
8,79
747
1
-1
1
-1
7,26
582
0
0
0
0
14,34
458
1
-1
1
1
11,30
805
0
0
0
0
9,72
675
1
1
-1
-1
8,57
478
0
0
0
0
9,60
684
1
1
-1
1
13,06
687
0
0
0
0
7,20
911
1
1
1
-1
9,45
487
0
0
0
0
8,06
814
1
1
1
1
16,45
576
0
0
0
0
8,57
766
CSI
0
0
0
9,61
691
0
0
0
0
9,07
724
CSI
0
0
0
8,66
763
0
0
0
0
8,42
779
48
ANÁLISIS EXPLORATORIO PARA LA OPTIMIZACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO
del mismo, que consisten en probar
Tabla 6. Modelos propuestos para el ajuste de la variable Peso Seco
los supuestos de normalidad y homo-cedasticidad (varianza constante) de los residuales (Montgomery, 1991; Hinkelmann y Kempthorne, 1984). Las pruebas que se contemplaron en este trabajo fueron la prueba de Sha-piro-Wilk para normalidad (Montgo­mery, 1991), la prueba de Levene modificada (Montgomery, 2002) y el
Fuente de variación
Suma de Cuadrados
G.L*
Cuadrados Medios
Valor F
Prob >
F**
Media
162,98
1
162,98
Lineal
3,31
4
0,83
65,04
< 0,0001
Interacción
0,10
6
0,02
1,43
0,2444
Cuadrático
0,01
4
000
0,26
0,9000
Residual
0,10
12
0,01
Total
166,67
35
4,76
gráfico de residuales contrastados
*G.L se refiere a los grados de libertad de cada modelo propuesto. *Probabilidad > F: probabilidad de aceptar o rechazar la hipótesis de ajuste del mo­delo, se trabaja con un nivel de significancia del 5%.
con los datos estimados (Montgo-mery,1991) para homocedasticidad.
Los resultados de estas pruebas son satisfactorios y el lector puede con­sultarlos en Escobar (2004); se usa este modelo para el análisis.
En la figura 1 se tiene la superficie de respuesta para la variable Peso Seco transformada y sin trans­formar, con niveles constantes de CaCO3 y melaza. La respuesta aumenta a medida que se aumentan las concentraciones de los componentes; este com­portamiento se observó en todos los componentes. En este artículo se presenta la gráfica que relaciona harina frente a jarabe (figura 1) porque son los com­ponentes que más influyen en la respuesta.
Costo de materias primas por kg producto. Al
igual que con peso seco, el costo de materias primas por kg producto fue transformado en la escala de lo­garitmo natural para que cumpliera los supuestos de normalidad y homocedasticidad.
En la tabla 8 se observan los modelos propues­tos para esta variable; se aprecia que los modelos
lineal y cuadrático son significativos (Prob> F). Al comparar estos dos modelos por adición de térmi­nos, el cuadrático (ecuación 3) es el mejor modelo propuesto para ajustar los datos.
Tomando el modelo cuadrático, se pasa a esti­mar los coeficientes del modelo, sin embargo como este modelo tiene muchos parámetros para estimar y no todos son significativos para el costo, se utiliza el método "backward" para seleccionar los paráme­tros que si son significativos, obteniendo el mejor modelo (Searle, 1971). El modelo resultante se ob­serva en la tabla 9.
En la tabla 9 se observa que aparte de los efec­tos lineales, la interacción jarabe*melaza y el efecto cuadrático de harina aportan a la respuesta, es decir, son significativos a un nivel de 5%. El valor F indica que las variables de mayor impacto sobre el costo son el jarabe y la harina. Por la prueba de Lack of Fit o falta de ajuste se observa que el modelo no
Tabla 7. Análisis de varianza para la variable de respuesta Peso Seco
Fuente de variación
Suma de cuadrados
G.L
Cuadrados medios
Valor F
Prob > F
Modelo
3,309
4
0,827
65,043
< 0,0001
signifi cativo
CaCO3
0,101
1
0,101
7,919
0,0086
Jarabe
1,027
1
1,027
80,746
< 0,0001
Melaza
0,368
1
0,368
28,925
< 0,0001
Harina
1,814
1
1,814
142,582
< 0,0001
Residual
0,382
30
0,013
Lack of Fit
0,296
20
0,015
1,719
0,1900
no significativo
Error puro
0,086
10
0,009
Total
3,691
34
49
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL.VI No. 2 Diciembre 2004 43-53
vol_vi_232_2004-43-53-1.jpg
constantes los otros dos factores. Al observar todas las gráficas que resultan de la combinación de los factores, vemos el efecto cuadráti­co de harina en los gráficos de con­tornos (figura 3). De acuerdo con éstos, la concentración de harina presenta un efecto creciente sobre el costo, un máximo y vuelve a de­crecer. Esto hace que variaciones de la concentración de harina en la variable costo tengan efectos de reducción a bajas y a altas con­centraciones.
Optimización conjunta. Teniendo los modelos ajustados para cada respuesta, se procede a realizar el método de optimización conjunta desarrollado por Derring y Suich. Este método utiliza la función de de-seabilidad, sin embargo, para esta­blecer esta función se necesita tener un conocimiento a priori de los ran­gos de valores deseables.
Como el objetivo es maximizar el ingrediente activo, pero a su vez minimizar los costos del medio, se trabajaron los criterios de la tabla 10. Estos criterios fueron establecidos por el grupo de investigación, te­niendo en cuenta los resultados y análisis anteriores.
Figura 1. Gráficos de la superficie de respuesta para peso seco.
Tabla 8. Modelos propuestos para el ajuste de la variable Costo
Fuente de variación
Suma de cuadrados
G.L*
Cuadrados medios
Valor F
Prob > F**
Media
1513,139
1
1513,139
Lineal
1,523
4
0,381
18,642
< 0.0001
Interacción
0,083
6
0,014
0,625
0.7084
Cuadrático
0,305
4
0,076
6,778
0.0013
Residual
0,102
12
0,009
Total
1515,275
35
43,294
* G.L se refiere a los grados de libertad de cada modelo propuesto. ** Probabilidad > F: probabilidad de aceptar o rechazarla hipótesis de ajuste del mo­delo, se trabaja con un nivel de significancia del 5%.
presenta problemas puesto que la probabilidad re­sulta mayor al 5%, por tanto no es significativa.
Al igual que con peso seco se probaron los su­puestos del modelo, comprobándose que éste es adecuado para el análisis, portanto, el modelo ma­temático que se debe ajustar es el dado en la ecua­ción (3) cuyos coeficientes se estiman por medio del método de mínimos cuadrados. El modelo re­sultante se presenta en la ecuación (5) para varia­bles no codificadas.
Ln(Costo) = 6,537 -0,08*CaCO3+0,0394*Jara-be -0,0178*Melaza + 0,0787*Harina (5) -0,0017*Ha-rina2+0,0007*Jarabe_Melaza
En la figura 2 se muestra la superficie ajustada para las variables Harina y Jarabe, manteniendo
Definidos estos criterios se procede a realizar el algoritmo de optimización, este método presenta varias soluciones que se muestran en la tabla 11; la mejor solución es aquella que presenta un valor de la función de deseabilidad más cercano a 1. En este caso la mejor solución es la presentada en el número 1, con una deseabilidad de 0,835, una respuesta es­timada de peso seco de 16,8 y un costo aproximado de $622.
La región óptima de las dos respuestas con los criterios de la tabla 10 se muestra en la figura 4. La región no sombreada es aquélla delineada por los criterios de selección, en esta región se encuentra el máximo obtenido en la optimización numérica.
50
ANÁLISIS EXPLORATORIO PARA LA OPTIMIZACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO
Tabla 9. Análisis de varianza para la variable Costo
Fuente de variación
Suma de cuadrados
G.L
Cuadrados medios
Valor F
Prob > F
Modelo
1,863
6
0,311
31,947
< 0,0001
signifi cativo
CaCO3
0,086
1
0,086
8,869
0,0059
Jarabe
0,770
1
0,770
79,173
< 0,0001
Melaza
0,160
1
0,160
16,419
0,0004
Harina
0,507
1
0,507
52,197
< 0,0001
(Harina)2
0,287
1
0,287
29,502
< 0,0001
Jarabe*Melaza
0,054
1
0,054
5,524
0,0260
Residual
0,272
28
0,010
Lack of Fit
0,186
18
0,010
1,203
0,3940
no significativo
Error puro
0,086
10
0,009
Total
2,136
34
Figura 2. Gráficos de la superficie de respuesta para Costo.
vol_vi_232_2004-43-53-2.jpg
El efecto de éstas sobre la concentra­ción final del ingrediente activo es significativo, de acuerdo con los re­sultados obtenidos al desarrollar las matrices experimentales propuestas en este trabajo.
Con el modelo propuesto se observa que el comportamiento del producto de la fermentación (peso seco) es lineal con respecto a las concentraciones de carbonato de calcio, jarabe de maíz, melaza y ha­rina de soya. Ninguna interacción de factores resultó significativa debido a que son fuentes muy complejas y, por tanto, cada una está aportando diferentes componentes.
La harina de soya es un sus­trato complejo que contiene la ma­yoría de los nutrientes que requiere la bacteria para su crecimiento y de­sarrollo. Al comparar el comporta­miento de la variable Peso Seco, en relación con los componentes del medio de cultivo, se aprecia que este componente -harina de soya-, es el que presenta mayor velocidad de asimilación por parte del mi­croorganismo. El jarabe de maíz es muy rico en ni­trógeno y factores de crecimiento, sin embargo, sus componentes se asimilan a menor velocidad que la harina de soya.
vol_vi_232_2004-43-53-3.jpg
Figura 3. Gráficos de contornos para Costo.
CONCLUSIONES
Los componentes del medio de cultivo corresponden a materias primas de bajo costo y amplia disponibilidad.
51
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL.VI No. 2 Diciembre 2004 43-53
Tabla 10. Rangos para optimizar las respuestas.
embargo, al combinar la variable Peso Seco con el costo por kg de producto se obtuvieron concentra­ciones de peso seco de 16,8 g/L a un costo de $622/litro bajo concentraciones de CaCO3, jarabe, melaza y harina de 1,94 g/L, 20 g/L, 30 g/L y 24,96 g/L, respectivamente.
Respuesta
Objetivo
Límite inferior
Límite superior
Peso Seco (g/L)
Maximizar
13
_
Costos ($/Kg producto)
Minimizar
595
660
Overlay Plot X = D: HARINA Y = B: JARABE
vol_vi_232_2004-43-53-4.jpg
En general se delimitó una región de estudio aceptable en la cual se obtienen rendimientos altos, entre 13 g/L y 16 g/L, a un bajo costo por litro de medio, entre $600 y $670. Los resultados obtenidos a través de las técnicas empleadas se deben verifi­car con experimentos confirmatorios que ayuden a ratificar los modelos propuestos en este trabajo.
Actual Factors A: CACO3 = 1.94 C: MELAZA = 30.00
Un análisis separado de cada variable puede generar conclusiones erróneas. En el presente trabajo se emplea el análisis de respuestas duales, ampliamente utilizado, aunque presenta ciertas desventajas com­parado con otras metodologías desarrolla­das recientemente (Cristancho, 2004). Sin embargo, es una metodología de fácil apli­cación, implementada en paquetes de esta­dística de libre acceso.
Figura 4. Gráfica de la región óptima dejando fijos CaCO3 y melaza.
El efecto de las materias primas sobre el costo por kg de producto es significativo para todos los componentes. La harina de soya presentó un com­portamiento cuadrático respecto al costo, correspon­diendo al efecto que mayor incidencia presenta so­bre esta variable respuesta.
Debido al comportamiento lineal de la variable respuesta Peso seco respecto a los factores estudia­dos, no se encontró un único punto máximo. Sin
Este trabajo muestra una manera dife­rente de analizar la información con ayuda de técnicas estadísticas que, aunque no son recien­tes, hasta ahora se están utilizando en el área de bio­tecnología en Colombia.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Servicio Nacional de Aprendizaje (SENA), por el apoyo financiero otorga­do en el marco del Programa de Fortalecimiento de
Tabla 11. Soluciones para la optimización conjunta según método de Derring y Suich
Número
CaCO3
(g/L)
Jarabe
(g/L)
Melaza
(g/L)
Harina
(g/L)
Peso
(g/L)
Costo ($/Kg producto)
Deseabilidad
1
1,94
20,00
30,00
24,96
16,8086
621,81
0,835
2
1,93
20,00
320,00
25,00
16,8094
622,524
0,830
3
1,91
20,00
20,00
25,00
16,7782
623,508
0,822
4
2,00
19,98
30,00
20,66
14,4183
615,577
0,709
5
1,94
20,00
30,00
17,88
12,9597
595,915
0,640
6
2,00
20,00
12,84
25,00
13,6785
644,498
0,447
52
ANÁLISIS EXPLORATORIO PARA LA OPTIMIZACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO
Centros de Desarrollo Tecnológico. Al ingeniero agrónomo Wilson Martínez por el soporte dado en la realización de bioensayos, al químico farmaceuta Ph. D. Jairo Cerón por el suministro permanente del microorganismo y la orientación; a las ingenieras químicas Patricia Téllez y Andrea Soler por el respal­do dado a la ejecución de los ensayos de fermenta­ción, y al profesor Óscar Melo por su continua aseso­ría en el desarrollo de este trabajo.
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