Caracterización de rizobacterias asociadas al cultivo del maíz en la producción de metabolitos del tipo AIA, sideróforos y
ácido salicílico
Characterization of rhizobacteria associated to maize crop in IAA, siderophores and salicylic acid metabolite production
Annia Hernández*, Narovis Rives**, Alberto Caballero***, Ana N. Hernández****, Mayra Heydrich*
RESUMEN
Se ha demostrado que las rizobacterias tienen la capacidad de producir metabolitos de interés agrícola, entre los que se destacan el ácido salicílico, los sideróforos y las f itohormonas; dentro de estas últimas, el ácido Indol acético (AIA) es la auxina más conocida y estudiada, la cual desempeña un papel rector en el crecimiento de los cultivos. Esta investigación se realizó con el objetivo de caracterizar rizobacterias asociadas al cultivo del maíz en cuanto a la producción de AIA, sideróforos y ácido salicílico. Para ello se empleó un conjunto de cepas de Burkholderia cepacia y Pseudomonas fluorescens previamente aisladas de la rizosfera del maíz variedad Francisco mejorado. Se utiliza­ron técnicas colorimétricas y cromatográf icas para la detección de los metabolitos estudiados, y análisis multivariado de conglomerado jerárquico y ligamiento completo para la selección de las mejores cepas con respecto a la producción de los metabolitos de interés. Los resultados demostraron que la mayoría de las cepas estudiadas produce metobolitos del tipo AIA, sideróforos y ácido salicílico, desta­cándose de forma integral las cepas de Burkholderia cepacia MBf21, MBp 1, MBp2, MBf22, MBp3, MBf20, MBf 15 y Pseudomonas fluorescens MPp4, por las mayores producciones de los metabolitos en estudio, lo que evidencia que estas cepas pueden ser utilizadas en la promo­ción del crecimiento vegetal en cultivos de importancia económica.
Palabras clave: Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia, AIA, sideróforos, ácido salicílico.
ABSTRACT
It has been demonstrated that rhizobacteria are able to produce metabolites having agricultural interest, including salicylic acid, the siderophores and phytohormones. Indol acetic acid (IAA) is the most well-known and studied auxin, playing a governing role in culture growth. The object of this work was to characterise rhizobacteria associated with the maize crop in terms of producing IAA, siderophores and salicylic acid metabolites. Burkholderia cepacia and Pseudomonas fluorescens strains previously isolated from maize Francisco variety rhizosphere were used. Colorimetric and chromatographic techniques for detecting these metabolites were studied; multi-variable analysis of hierarchic conglomerate and complete ligament were used for selecting the best strains for producing metabolites of interest. These results demonstrated that all rhizobacteria strains studied produced IAA, siderophores and salicylic acid metabolites. Burkholderia cepacia MBf21, MBp1, MBp2, MBf22, MBp3, MBf20, MBf 15 and Pseudomonas fluorescens MPp4strains have presented the greatest production of these metabolites, showing that these strains could be used in promoting vegetal growth in economically important cultures.
Key words: Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia, IAA, siderophore, salicylic acid.
INTRODUCCIÓN                                                          las raíces de las plantas y a sus beneficios para la
agricultura (Rodríguez et al., 2003). El uso desmedido de fertilizantes químicos y pestici-
das sintéticos ha provocado graves consecuencias                Las bacterias promotoras del crecimiento vege-
ambientales, por lo que se ha prestado especial aten- tal (PGPB) se encuentran entre los principales gru-ción al estudio de los microorganismos asociados a pos microbianos estudiados, destacándose por sus
Doctores en ciencias biológicas, Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana. Cuba. Correo
electrónico: annia@fbio.uh.cu
Microbióloga, Instituto de Investigaciones del Arroz, La Habana, Cuba.
Doctor en ciencias agrícolas, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), La Habana, Cuba.
Maestro en ciencias en microbiología, Centro de Desarrollo de Productos Bióticos. Morelos. México.
Recibido: enero 30 de 2004. Aceptado: mayo 14 de 2004.
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CARACTERIZACIÓN DE RIZOBACTERIAS ASOCIADAS AL CULTIVO DEL MAÍZ
efectos beneficiosos tanto para las plantas como para los ecosistemas (Hernández et al., 2003). En este sentido, se ha demostrado la presencia abundante de los géneros Pseudomonas, Burkholderia, Azospirillum, Bacillus y Streptomyces en diferentes condiciones y localidades edafoclimáticas, así como su asociación con las gramíneas (Hebbar et al., 1998; Picard et al., 2000; Rives et al., 2003).
Pseudomonas fluorescens y Burkholderia cepacia se destacan por su alta frecuencia de aparición en la rizosfera. Entre sus mecanismos de acción se encuen­tran el aumento de la toma de agua y nutrientes por la planta (González et al., 2000), la producción de regu­ladores del crecimiento vegetal (De Salmone et al., 2001) y el control biológico de patógenos, dado fun­damentalmente por la producción de sideróforos (Alexander y Zuberer, 1991; Barelman et al., 1996), la antibiosis (Picard et al., 2000) y la inducción de resistencia a la planta (Nandakumar et al., 2001).
Diversos autores han demostrado la producción de fitohormonas por rizobacterias (Dibut, 2000). Dentro de ellas el Ácido Indol Acético (AIA) es la auxina más conocida y estudiada, desempeñando un papel rector en el crecimiento de los cul­tivos (Hernández, 1998).
En este sentido, obtener cepas con la capaci­dad de producir estos metabolitos es un aspecto de interés dentro de la biotecnología agrícola en Cuba, pues de este modo podrán ser utilizados para la ob­tención de inoculantes microbianos con la seguridad de obtener resultados benéficos en plantas, que se manifiesten de forma permanente durante el ciclo de desarrollo del cultivo.
Este trabajo tiene como objetivos caracterizar rizobacterias asociadas al cultivo del maíz en cuanto a la producción de AIA, sideróforos y ácido salicílico.
MATERIALES Y MÉTODOS Cultivos microbianos
Para la realización de este trabajo se utilizó un con­junto de cepas previamente aisladas de la rizosfera del maíz y cepas patrones y de referencia proceden­tes del Cepario Nacional de Biofertilizantes de la Facultad de Biología de la Universidad de la Habana y de la Colección de Cultivos de la Universidad de Gent en Bélgica (tabla 1).
Tabla 1. Cultivos microbianos utilizados.
Los sideróforos son pigmentos extracelulares, fluorescentes o no, de bajo peso molecular (500-1000 Da) y solubles en soluciones acuosas a pH neutros (Dybas et al., 1995). Su modo de acción se relaciona con el secuestro de hierro, convirtiendo este elemento en un factor limitante en la rizosfera. Tam­bién se ha demostrado su papel en la inducción de resistencia en diferentes sistemas planta-patógeno (Maurhofer et al., 1994; Ardon et al., 1998).
El ácido salicílico (AS) es otro metabolito cuyo papel fundamental está relacionado con la inducción de resisten­cia sistémica (ISR). Se ha demostrado que cepas que pierden la capacidad de producir AS, también pierden su capaci­dad de inducir resistencia en plantas (De Meyer y Hofte, 1997).
Código
Identificación
Procedencia
MBp1
MBp2
MBp3, MBp4,
Bulkholderia cepacia
Cepario de Rizobacterias
MBp5
MBp6
MBp7, MBp8,
del Instituto Nacional de
MBp9,
MBp10
, MBp14,MBp15
Ciencias Agrícolas, La Ha-
MBf4,
, MBf5, MBf6, MBf7, MBf8,
bana, Cuba.
MBf9,
MBf10,
MBf11, MBf12,
MBf13
MBf15
MBf16 MBf18,
MBf19
MBf20,
MBf21, MBf22
MPp4,
MPp11,
MBp12, MPp13,
Pseudomonas
Cepario de Rizobacterias
MPp18
, MBp19
9, MBp20, MPf1,
fluorescens
del Instituto Nacional de
MPf14,
MPf17
Ciencias Agrícolas, La
Habana, Cuba.
0057
Bulkholderia cepacia
Cepario Nacional de
Biofertilizantes, Facultad
de Biología, Universidad
de La Habana, Cuba.
J-143
Pseudomonas
Cepario Nacional de
fluorescens
Biofertilizantes, Facultad
de Biología, Universidad
de La Habana, Cuba.
7 NSK,
, 7NSK2
-562, KMPCH
Pseudomonas
Colección de Cultivos de
aeruginosa
la Universidad de Gent,
Bélgica.
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REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL. VI No.1 Julio 2004 6 - 13
Producción de fitohormonas del tipo AIA (Ácido 3 indol acético)
Se utilizó el medio líquido descrito por Grapelli y Rossi (1981). Como inductor se empleó el DL-Triptófano en una concentración de 0,1 g/L (Tien et al., 1979). Los cultivos bacterianos fueron cultivados en zaranda a 150 rpm y 30°C durante 48 horas, posteriormente se centrifugaron 15 000 rpm durante 20 minutos. Se to­maron 5 mL de los caldos libres de células para la extracción de auxinas según metodología descrita por Tien et al. (1979). Para la cuantificación se utilizó el reactivo de Salkowski (Send y Leopold, 1954). La con­centración se calculó utilizando una curva patrón con diferentes concentraciones de AIA preparado a partir de 1mg/mL de AIA sintético en metanol.
Producción de sideróforos
Para la determinación cuantitativa de sideróforos se utilizó el medio Caldo Casimino Ácido (CAS) (5g de ácido casimino, 1g de K2HPO4, 5g de hierro y 0.25 g de MgSO4 por litro), los cultivos fueron incubados durante 48 horas a 200 rpm y 30 °C. Se determinó la absorbancia a 595 nm (concentración celular) y se centrifugó a 5000 rpm durante 10 minutos para eli­minar las células. En el sobrenadante se determinó la absorbancia a 405 nm en espectrofotómetro. La concentración fue expresada en ^M de sideróforos por 108 UFC/mL de bacteria (De Meyer, 1999), co­rrespondiente a una turbidez del 0.5 de la escala de MacFarland (Rodríguez, 2003).
Producción de ácido salicílico
Se inocularon erlenmeyers que contenían 25 mL de Caldo Casimino Ácido (CAS) con 100 ^L de los cul­tivos, y se incubaron durante 48 horas a 200 rpm y 30 °C. Posteriormente se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 minutos para eliminar las células. La ex­tracción y cuantificación de ácido salicílico se reali­zó según metodología descrita por Buysens et al. (1996). Se realizó una curva patrón en salicilato de sodio en concentraciones de 0.5-5 mg/mL en metanol. Para el análisis cualitativo se aplicaron lO^Ldecada muestra de las cepas seleccionadas a placas de cromatografía con Sílica Gel G. Como sistema de solventes se utilizó cloroformo-ácido acético-etanol en una relación 90-5-2.5.
Análisis biométricos
Para el estudio de la producción de cada uno de los metabolitos por las diferentes cepas se realizó un análisis de varianza de clasificación simple según un diseño aleatorio, y las medias se compararon a tra­vés de la prueba de Rangos Múltiples de Duncan para p<0.05.
La selección de las mejores cepas se realizó a través de un análisis multivariado de conglome­rado jerárquico y ligamiento completo mediante el procesador estadístico "STADISTIC" versión 5.0. Se creó un patrón positivo (concentraciones óptimas de metabolitos) y un patrón negativo (bajas concentra­ciones de metabolitos) para comparar las cepas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Producción de AIA
Dentro de los mecanismos por los cuales las rizobac-terias pueden manifestar su acción se destacan la producción de compuestos indólicos, atribuyéndose a los mismos incrementos en el desarrollo y rendi­miento de diversas especies de plantas.
De acuerdo con las determinaciones realizadas, las cepas estudiadas producen entre 5.30 y 21.53 ng/mL de AIA. Los mayores niveles en la producción de esta auxina se obtienen con las cepas de Burkholderia cepacia 0057, MBf20, MBf21, MBp1, MBp2, MBp3 y de Pseudomonas fluorescens MPf 17, destacándose las cepas 0057 y MBf21 por los ma­yores incrementos (tabla 2). Las concentraciones obtenidas en las cepas promisorias pueden ser sufi­cientes para tener una influencia directa en el creci­miento vegetal, si se tiene en cuenta que los regula­dores del crecimiento vegetal actúan en pequeñas concentraciones sobre el crecimiento de las plantas.
Resultados similares fueron obtenidos por Hernán­dez (1994) quien demostró que cepas de Pseudomonas y Burkholderia cepacia producen diversas hormonas vegetales cuando se cultivan en medios líquidos. Una de las principales es el AIA, demostrando que las cepas más activas en cuanto a la producción de esta auxina producían entre 5 y 20.6 ^g/rnL de AIA. Sin embargo, cuando se comparan los resultados obte­nidos con los informados por diversos autores al es-
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CARACTERIZACIÓN DE RIZOBACTERIAS ASOCIADAS AL CULTIVO DEL MAÍZ
tudiar la producción de AIA por otras bacterias de la rizosfera, entre las cuales se encuentran cepas del género Azospirillum y Rhizobium (Pazos et al., 2000;
Rojas y Pérez, 1998), se observa que los niveles pro­ducidos por las cepas de Pseudomonas y Burkholderia son bajos.
Tabla 2. Producción de AIA, sideróforos y ácido salicílico por las cepas en estudio.
Cepas
AIA
{[iglmL)
Sideróforos
(M*l)
Ácido Salicílico (Hg/mL)
Pseudomonas aeruginosa KMPCH
-
4.48 op
51.00 f
Pseudomonas aeruginosa 7NSK2-562
-
40.30 a
ND
Burkholderia cepacia 0057
20.10 ab
11.68 i
53.50 e
Pseudomonas fluorescens J-143
14.60 f
31.55 d
7.20 mn
Pseudomonas fluorescens MPf1
5.90 lmnop
34.00 c
3.50 g
Burkholderia cepacia MBf4
6.67 jklmno
7.30 jklm
7.00 mn
Burkholderia cepacia MBf5
8.27 hijk
9.43
32.60 g
Burkholderia cepacia MBf6
5.23 nopp
9.16 j
ND
Burkholderia cepacia MBf7
4.53 op
5.23 mno
ND
Burkholderia cepacia MBf8
4.97 nop
6.20 klmno
5.30 nop
Burkholderia cepacia MBf9
5.50 lmnop
5.57 mno
ND
Burkholderia cepacia MBf10
7.30 lmnop
5.53 mno
4.90 nop
Burkholderia cepacia MBf11
6.33 klmnop
5.03 nop
3.30 nop
Burkholderia cepacia MBf12
4.33 p
3.20 p
4.10 nop
Burkholderia cepacia MBf13
5.30 mnop
5.83 lmno
ND
Pseudomonas fluorescens MPf14
7.47 hojkl
39.40 a
3.80 nop
Burkholderia cepacia MBf15
5.93 lmnop
18.13 f
66.10 ab
Burkholderia cepacia MBf16
5.70 lmnop
17.20 fgh
6.90 mn
Pseudomonas fluorescens MPf17
18.07 cd
30.03 d
5.80 no
Burkholderia cepacia MBf18
5.93 lmnop
15.97 gh
4.30 nop
Burkholderia cepacia MBf19
7.50 hijkl
3.10 p
ND
Burkholderia cepacia MBf20
9.37 gh
15.47 gh
61.50 cd
Burkholderia cepacia MBf21
21.53 a
8.03 jk
68.70 a
Burkholderia cepacia MBf22
13.80 g
17.47 fg
61.50 cd
Burkholderia cepacia MBp1
19.07 bc
18.13 f
67.30 a
Burkholderia cepacia MBp2
17.77 cd
17.37 fg
63.50 bc
Burkholderia cepacia MBp3
16.50 de
15.20 h
59.90 de
Pseudomonas fluorescens MPp4
15.63 ef
27.47 e
35.00 g
Burkholderia cepacia MBp5
9.13 ghi
7.77 jkl
21.20 h
Burkholderia cepacia MBp6
8.67 ghij
8.03 jk
13.10 jk
Burkholderia cepacia MBp7
9.23 gh
7.30 jklm
17.50 i
Burkholderia cepacia MBp9
7.37 hijklmn
6.43 klmno
11.70 kl
Burkholderia cepacia MBp10
7.07 ijklmn
6.73 klmn
16.50 i
Pseudomonas fluorescens MPp11
8.47 ghij
31.00 d
15.20 ij
Pseudomonas fluorescens MPp12
9.00 ghi
27.30 e
7.00 mn
Pseudomonas fluorescens MPp13
8.13 hijk
27.50 e
14.90 ijk
Burkholderia. cepacia MPp14
9.17 ghi
7.33 jklm
13.00 jk
Burkholderia cepacia MPp15
4.77 op
6.47 klmno
5.90 no
Pseudomonas fluorescens MPp18
7.57 hijkl
37.07 b
12.03 jkl
Pseudomonas fluorescens MPp19
5.70 lmnop
28.17 e
9.60 lm
Pseudomonas fluorescens MPp20
8.83 ghi
38.53 ab
15.40 ij
Esx CV (%)
0.63 7.76
0.65 6.96
1.03 7.99
ND-Valores por debajo del límite de detección de 3 (|ig/ml_) de ácido salicílico en el cultivo. Medias con letras iguales no difieren significativamente para p<0.05.
Velázquez et al. (1999) y Her­nández (1996) encontraron que la cepa de B. cepacia 0057 producía 20.1 ng/mL de AIA. Los autores infor­maron resultados positivos al inocu­lar plantas de maíz con esta cepa, logrando incrementos en el crecimien­to y rendimiento del cultivo, lo que corrobora que la concentración de AIA producida fue adecuada para ejercer un efecto positivo sobre el crecimien­to de las plantas.
Yahalom (1991) demostró que el efecto de esta hormona sobre las raí­ces depende de su concentración, encontrando que concentraciones de 10-8M estimularon el alargamiento ra­dical, mientras que concentraciones mayores a 10-6M lo inhibieron y redu­jeron la longitud de la zona de alarga­miento. Por otro lado, Strezelczyk et al. (1994) plantearon que las hor­monas vegetales pueden promo­ver la capacidad de Azospirillum para fijar nitrógeno atmosférico y es­timular el crecimiento de las bacterias en la rizosfera.
Producción de sideróforos
La producción de sideróforos por ce­pas de rizobacterias pertenecientes a diferentes grupos microbianos y su papel en el biocontrol de enfer­medades de plantas ha sido infor­mada por varios autores. En este trabajo se demuestra que todas las cepas de Pseudomonas fluorescens y Burkholderia cepacia aisladas de la rizosfera del maíz y utilizadas en este estudio tienen la capacidad de producir sideróforos bajo condicio­nes limitantes de hierro (tabla 2).
De modo general, los mayo­res niveles de producción de este metabolito se obtienen en las cepas
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de Pseudomonas fluorescens MPf1, MPf14, MPf17, MPp4, MPp11, MPp18 y MPp20, destacándose las cepas MPf14 y MPp20 por las mayores produccio­nes. Los resultados corroboraron que la cepa de Pseudomonas fluorescens J-143 produce sideróforos (31.55nM), coincidiendo con lo informado por Her­nández et al. (1999) quien demostró que la misma produce un solo tipo de estos metabolitos, el cual en Silica Gel G aparece como una mancha verde carmelitosa fluorescente.
La cepa 7NSK2-562 -mutante en la producción de ácido salicílico y piochelin- también presentó altos niveles en la producción de estos metabolitos, sin di­ferencias significativas con las cepas promisorias para p<0.05, lo que demuestra que los sideróforos produ­cidos por las cepas de P. fluorescens en estudio son pioverdines. Estos resultados se corroboran al tener en cuenta que la cepa KMPCH, mutante en la produc­ción de pioverdines y productora de ácido salicílico y pioquelin (De Meyer, 1999), produjo valores medios de sideróforos.
En los últimos años se han planteado criterios divergentes acerca del papel de los pioverdines en el control biológico de patógenos que habitan en la rizosfera. Hamdam et al. (1991), trabajando con ce­pas mutadas en cuanto a la producción de diferentes tipos de sideróforos, encontraron que los mutantes de­ficientes en la producción de pioverdines controlaban enfermedades fúngicas en el trigo de la misma ma­nera que las cepas parentales. Por otro lado, Buysens et al. (1996) demostraron la efectividad de este tipo de sideróforos en el control de enfermedades causa­das por Fusarium oxysporum y Pythium sp.
Asimismo, se ha demostrado que P. fluorescens cepa CHAO produce pioverdines y AS e induce re­sistencia en tabaco contra el virus de la necrosis del tabaco (TNV). La cepa CHA 400, un mutante en cuan­to a producción de pioverdines de la cepa CHAO, sólo indujo resistencia parcial contra el TNV, demos­trándose que estos metabolitos estaban implicados en la inducción de resistencia contra este virus (Maurhofer et al., 1994).
Las cepas de B. cepacia produjeron niveles medios y bajos de este metabolito, si se comparan con la cepa de referencia de B. cepacia 0057 utiliza­da en este estudio. Se destacan por los mayores valores las cepas MBf15, MBf16, MBf18, MBf20, MBf22, MBp1, MBp2 y MBp3. Velázquez et al. (1999)
demostraron que en condiciones limitantes de hierro la cepa de B. cepacia 0057 produce dos tipos de sideróforos del tipo hidroxomato que se diferencian fundamentalmente en el tamaño y la composición de la cadena polipeptídica que se encuentra unida al cromóforo fluorescente.
Diversos estudios han demostrado que Burkholderia cepacia produce diferentes tipos de sideróforos. En este sentido, Meyer et al. (1995) plan­tearon que las cepas ATCC 25416 y ATCC 17759 pro­ducían pioquelin, cepabactin y ornibactin. Barelman et al. (1996) encontraron que la cepa PHP7 producía ornibactin y cepaciaquelin, un sideróforo de tipo hidroxamato y otro catecol, constituyendo éste el pri­mer caso informado de miembros de este grupo con la capacidad de producir ambos sideróforos. Es im­portante señalar que el análisis de los tipos de sideróforos producidos por las cepas puede ser una vía para discriminar entre las especies B. cepacia y B. vietnamiensis, ya que esta última sólo tiene la capaci­dad de producir ornibactin.
Hasta el momento la mayor cantidad de repor­tes de aplicación de sideróforos para combatir en­fermedades que afectan a cultivos de interés eco­nómico ha estado relacionada con productos obtenidos a partir de Pseudomonas fluorescentes. Sin embargo, varios autores han demostrado la efec­tividad de cepas de Burkholderia cepacia en el biocontrol, cuestión que podría estar relacionada con los diferentes tipos de sideróforos que esta especie produce. Resultados obtenidos por Miranda et al. (2000) con diferentes cepas de Burkholderia cepacia para el biocontrol de Phytophthora infestans en el cultivo de la papa demuestran mayores porcentaje sde inhibición en medios con condiciones limitantes de hierro que en medios donde se añade FeCl3 al medio de cultivo, lo que demuestra el papel rector de los sideróforos en este sistema.
Hebbar et al. (1998) lograron suprimir los sínto­mas provocados por el ataque de los hongos fitopatógenos Phytium y Fusarium sp. al cultivo del maíz mediante la aplicación de la cepa de Burkholderia cepacia PHQM, planteando que en este efecto pudie­ron estar involucrados diferentes mecanismos de ac­ción, entre los cuales se señalan la producción de sideróforos y la inducción de resistencia en la planta.
Finalmente, teniendo en cuenta todo lo plantea­do, se puede señalar que por el importante papel que
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CARACTERIZACIÓN DE RIZOBACTERIAS ASOCIADAS AL CULTIVO DEL MAÍZ
desempeñan los sideróforos en el control de patógenos de plantas, la búsqueda de nuevas cepas producto­ras y medios donde la producción de los mismos sea óptima, resulta de gran interés.
Producción de ácido salicílico (AS)
Diversos autores han señalado el papel que desempe­ña el ácido salicílico en la inducción de resistencias en las plantas contra el ataque de diferentes patógenos, constituyendo uno de los principales determinantes invo­lucrados en la inducción de resistencia sistémica (ISR) por rizobacterias (Van Loon et al., 1998; Maurhofer et al., 1998; Grill y Himmelbanch, 1998).
La producción de AS in vitro por las cepas de Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia y Pseudomonas aeruginosa (controles) fue analiza­da cuantitativamente por espectrofotómetro median­te la detección del complejo púrpura formado por la unión del hierro y el AS (tabla 2). Los resultados demostraron diferentes niveles en la producción de AS para las cepas estudiadas con diferencias signi­ficativas entre ellas para un p<0.05. La cepa de Pseudomonas aeruginosa KMPCH, utilizada como control positivo, mostró niveles altos de producción de este metabolito, lo que co­rrobora los buenos resultados obtenidos con esta cepa en la inducción de resisten­cia en frijol ante el ataque de Botrytis cinerea y Colletotrichum lindemuthianum (De Meyer y Hofte, 1997).
No se detectó producción de AS por la cepa de Pseudomonas aeruginosa 7NSK2-562 utilizada como control negati­vo. Esto confirma que esta cepa no tiene la capacidad de producir AS y corrobora los resultados obtenidos por De Meyer y Hofte (1997) quienes demuestran que es un mutante en la producción de ácido salicílico y piochelin. Tampoco se detectó la produc­ción de este metabolito en la cepa de Pseudomonas fluorescens MPf13 y en las cepas de Burkholderia cepacia MBf6, MBf9 y MBf 19. Las cepas de referencia 0057 y J-143 también mostraron altos niveles en la producción de AS. Se han encontrado efectos beneficiosos en la estimulación del crecimien­to vegetal y biocontrol de patógenos al inocular es­tas cepas en diferentes cultivos de interés agrícola (Hernández et al., 1995).
En comparación con la cepa KMPCH, utilizada como control positivo en este estudio, las cepas de B. cepacia MPBp1 y MBf 15 producen altos niveles de este metabolito, mientras que las otras cepas pro­ducen niveles intermedios o bajos. Es importante señalar que las cepas que se destacan por las ma­yores producciones de este metabolito están identifi­cadas como B. cepacia. Este comportamiento podría estar relacionado con los tipos de sideróforos que producen estas bacterias. Se han encontrado altos niveles en la producción de AS de cepas pioverdines negativos que indican que el AS compensa la au­sencia del pioverdin. Este fenómeno ha sido obser­vado en la cepa de Pseudomonas fluorescens CHAO y la cepa de Pseudomonas aeruginosa KMPCH, ambas deficientes en la producción de este tipo de sideróforo (Meyer et al., 1992).
El análisis de Conglomerado Jerárquico y de Ligamiento Completo, sobre la base de la distancia euclidiana, permitió agrupar las cepas por su capaci­dad de producir los metabolitos en estudio (distancia de unión de 25) en dos grupos (Figura 1), dentro de los cuales se encontraban los patrones creados.
vol_6231-2004-6-13-1.jpg
Figura 1. Dendrograma para el agrupamiento de las cepas de acuerdo con la producción de AIA, sideróforos y AS. Dendrograma calculado a partir del análisis de las concentraciones de los metabolitos en estudio. El control positivo está formado por las concentraciones más altas de metabolitos del tipo AIA, sideróforos y AS producidas por las cepas, y el control negativo por las concentraciones más bajas.
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Dentro del grupo I quedó incluido el patrón positi­vo, formado por las mayores concentraciones de AIA, sideróforos y AS, junto a las cepas de B. cepacia MBp1, MBp2, MBf22, MBp3, MBf20, MBf15 y de P. fluorescens MPp4; el resto de las cepas y el patrón negativo (con­centraciones más bajas obtenidas de los metabolitos en estudio) quedaron incluidos dentro del segundo gru­po. A partir de estos resultados se seleccionaron las cepas del grupo I como las de mejor comportamiento integral pues producían las mejores concentraciones de los metabolitos estudiados (tabla 2).
La mayoría de las cepas seleccionadas pertene­ce a la especie Burkholderia cepacia, lo que corrobo­ra la interacción entre cepas pertenecientes a este grupo microbiano y el cultivo del maíz. Al respecto, Hernández et al. (1995) y Hernández (2002) encon­traron que las cepas de Pseudomonas cepacia eran las de mayor frecuencia de aparición en el cultivo del maíz y las que mayores efectos benéficos producían al ser inoculadas a las plantas.
Al realizar el análisis cromatográfico de produc­ción de AS, los resultados corroboran la producción de este metabolito por las cepas seleccionadas (figura 2). Se observa que a diferencia de las cepas nativas en estudio y las cepas KMPCH, 0057 y J-143, la cepa de Pseudomonas aeruginosa 7NSK2-562 no produce manchas en las placas para cromatografía, lo que indi­ca que no produce este metabolito, corroborando los resultados obtenidos y los informados por otros auto­res (De Meyer, 1999; Bigiramana et al., 2000).
que pueden influir en la estimulación del crecimiento vegetal y el biocontrol de patógenos en diferentes cultivos de importancia económica.
CONCLUSIONES
La mayor parte de las cepas de Pseudomonas fluorescens y Burkholderia cepacia estudiadas pro­ducen metabolitos del tipo AIA, sideróforos y ácido salicílico. Las cepas de Burkholderia cepacia MBf21, MBp1, MBp2, MBf22, MBp3, MBf20, MBf15 y Pseudomonas fluorescens MPp4 se destacaron de forma integral por las mayores producciones de los metabolitos de interés, demostrándose que las mis­mas son eficientes en la promoción del crecimiento vegetal en cultivos de importancia económica, por lo que constituyen fuentes de reserva para la produc­ción de inoculantes microbianos factibles desde el punto de vista ecológico.
BIBLIOGRAFÍA
Alexander, D. B; Zuberer D. A. 1991. Siderophore producing bacteria of iron-efficient and inefficient grass: 308. In D. L Keister and P. B. Crigan (eds.). The Rhizosfere and plant growth. The Netherlands: Kluver Academic Publiser.
Ardon, O.; Weizman, H.; Libman, J.; Shanzer, A.; Chen, I.; Hadar Y. 1998. Iron uptake in Ustilago maydis: tracking the iron path. J. Bacteriol. 180: 2021-2026.
Barelman, I.; Meyer J. M.; Taraz, K.; Budzikiewicz H. 1996. Cepaciachelin, a new catecholate siderophore from Burkholderia (Pseudomonas) cepacia. Z. Natarfosch. 51: 627-630.
Bigiramana, J.; Fontaine, R.; Hofte. M. 2000. Bean anthracnose: virulence of Colletotrichum lindemuthianum isolates from Burundi, Central Africa. Plant Dis. 84:491.
Buysens, S., Heungens, K., Poppe, J. and M. Hofte. 1996. Involvement of pyochelin and pyoverdin in suppresion of Pythium induced damping off of tomato by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2. Appl Environ Microbiol. 62: 865-871.
De Meyer, G. 1999. Role of salycilic acid in systemic resistance to disease induced by the root -colonizing bacterium Pseudomonas aeruginosa 7NSK2. Thesis submited in the fulfilment of the requimerents for the degree of Doc­tor (Ph. D,) in Applied Biological Sciences-Agronomy. Gent University.
De Meyer, G.; Hofte M. 1997. Salicylic acid produced by the rhizobacterium Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 indu­ces resistance to leaf infection by + Botrytis cinerea on bean. Phytopathology. 87:588-593.
De Salmone, I. E. G.; Hynes, R. K.; Nelson, L. M. 2001. Cytoquinin production by plant growth promoting rhizobacteria and selected mutants. Canadian Journal of Microbiolgy. 47(5):404-411.
Dibut, B. 2000. Obtención de un bioestimulador del crecimiento y el rendimiento vegetal para el beneficio de la cebolla (Allium cepa L.). La Habana. Tesis de Doctorado en Cien­cias Agrícolas. Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas.
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Figura 2. Análisis cromatográfico del ácido salicílico secretado por las 9 cepas seleccionadas. El ácido salicílico obtenido a partir del sobrenadante de las bacterias crecidas hasta la fase estacionaria en medio Casimino ácido fue corrido en placas de Sílica Gel G., utilizando cloroformo/ácido acético/agua (90/5/2.5) como sistemas de solventes. Las manchas de AS fueron visualizadas en las placas mediante luz ultravioleta. Los números representan: 1, Patrón de AS; 2, KMPCH (control positivo); 3, 7NSK2-562 (control negativo); 4, MBf15; 5, MBf20; 6, MBp2; 7, MBp3; 8, MPp4; 9, MBp1; 10, MBf22; 11, 0057; 12, J-143.
De manera general, los resultados confirmaron la capacidad de las rizobacterias para producir metabolitos del tipo AIA, sideróforos y ácido salicílico
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CARACTERIZACIÓN DE RIZOBACTERIAS ASOCIADAS AL CULTIVO DEL MAÍZ
Dybas, M. J.; Tarara, G. M.; Criddle, C. S. 1995. Localization of de carbon tetrachloride transformation activity of Pseudomonas sp strain KC. Appl. Environ. Microbiol. 61(2):p758-762.
González, A.; Lacasa, A.; Rodríguez, R.; Fernández, J. A.; Fran­co, J. A. 2000. Rizobacterización de plántulas de pimiento: influencia en la fase de semillero y en la producción del cultivo. Agrícola Vergel, pp. 727-735.
Grapelli, A.; Rossi W. 1981. The effect of phytohormones produced by Arthrobacter sp. on the phosphatase activity in plants roots. Folia Microbiol. 26: 137-141.
Grill, H.; Himmelbanch, J. 1998. Systemic acquired resistance by rh izo bacteria. In Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 36: 453-483.
Hamdam, H.; Weller, D. W.; Tomashow, I. 1991. Relative importance of fluorescent siderophores and other factors in biological control of G. Graminis var. tritici by P. fluorescens 2-79 and M4-Bor. Appl. Environ. Microbiol. 57 (11): 3270-3277.
Hebbar, K. P.; Martel, M. H.; Heulin, T. 1998. Suppression of pre and post emergence damping off in corn by Burkholderia cepacia Eur. J. Plant. Pathol. 104:29-36.
Hernández, A. N. 1996. Selección de rizobacterias para la biofertilización en el cultivo del maíz. La Habana. Tesis (en opción al título de magíster en ciencias biológicas); Facultad de Biología. Universidad de La Habana.
Hernández, A. 1998. Caracterización de cepas de Burkholderia (Pseudomonas) cepacia y Pseudomonas fluorescens aisladas de la rizosfera del maíz. La Habana. Tesis (en opción al grado científico de magíster en ciencias bioló­gicas); Facultad de Biología. Universidad de la Habana.
Hernández, A. 2002. Obtención de un biopreparado a partir de rizobacterias asociadas al cultivo del maíz (Zea Mays L.). La Habana. Tesis (en opción al grado científico de doctor en ciencias biológicas), Facultad de Biología. Universidad de La Habana.
Hernández, A. N.; Hernández, A.; Heydrich, M. 1995. Selec­ción de rizobacterias asociadas al cultivo del maíz. Cul­tivos Tropicales (CU) 16 (3): 5-8.
Hernández, A. N.; Martínez, J.; Velázquez, M. 1999. Identifi­cación de alcaloides en cultivos de Burkholderia cepacia. Memorias XXX Congreso Nacional de Microbiología. Oaxtepec, Morelos, México.
Hernández, A.; Caballero, A.; Pazos, M.; Ramírez, R.; Heydrich, M. 2003. Identificación de algunos géneros microbianos asociados al cultivo del maíz (Zea Mays L.) en diferen­tes suelos de Cuba. Revista Colombiana de Biotecnolo­gía (CO) V (1): 45-55.
Hernández, M. 1994. Síntesis de ácido 3-indol acético a partir de fuente microbiana. Trabajo de Diploma. Facultad de Biolo­gía. Universidad de la Habana.
Maurhofer, M.; Hase, C.; Meuwly, P.; Métraux, J-P.; Défago, G. 1994. Induction of systematic resistence of Tobacco to Tobacco Necrosis Vi rus by the root colonizing Pseudomonas fluorescens strain CHAO: Influence of the gac A Gene and of Pyoverdin production. Phytopathology. 84 (2): 562-570.
Maurhofer, M.; Reimmann, C.; Schmidli-Sacherer, P.; Heeb, S.; Haas, D; Défago, G. 1998. Salicylic acid biosynthetic genes expressed in Pseudomonas fluorescens strain P3 improve the induction of systemic resistance in tobacco against tobacco necrosis virus. Phytopathology. 88: 678-684.
Meyer, J. M.; Azelvandre, P.; Georges, C. 1992. Iron metabolism in Pseudomonas: Salicylic acid, a siderophore of Pseudomonas fluorescens CHAO. BioFactors. 4. 23-27.
Meyer, J. M.; Trân Van, V.; Stinzi, A.; Berge, O.; Winkelmann, G. 1995. Ornibactin production and tranport properties in strains of Burkolderia vietnamiensis and Burkolderia cepacia (formally Pseudomonas cepacia). BioMetals. 8: 309-317.
Miranda, S.; Hernández, A.; Marqués, R. 2000. Estudio del efecto antagónico de productos bacterianos ante Phytophthora infestans. En: Programa y resúmenes XII Seminario Científico. Instituto Nacional de Ciencias Agrí­colas (11: 2000: La Habana).
Nandakumar, R.; Babu, S.; Viswanathan, R.; Raguchander, T.; Samiyappan, R. 2001. Induction of systemic resistance in rice against sheath blight disease by Pseudomonas fluorescens. Soil Biology and Biochemistry. 33(4-5): 603-612.
Pazos, M.; Hernández, A.; Paneque, V. M.; Santander, J. L. 2000. Caracterización de cepas del género Azospirillum aisladas de dos tipos de suelos de la localidad de San Nicolás de Bari. Cultivos Tropicales (CU) 21 (3): 19-23.
Picard, C.; Di Cello, F.; Ventura, M., Fani, R.; Guckert, A. 2000. Frequency and Biodiversity of 2,4 Diacetylphloroglucinol-producing bacteria isolated from the maize rhizosphere at different stages of Plant Growth. Applied and Environmental Microbiology. 66 (3): 948-955.
Rives, N.; Hernández, A.; Heydrich, M.; Rodríguez, A. J.; Man­zano, J. 2003. Bacterias asociadas al arroz como una alternativa en la búsqueda de la sustentabilidad agríco­la. IV Taller de la Cátedra de Medio Ambiente, julio.
Rodríguez, A. J. 2003. Caracterización fisiológica de cepas de la comunidad microbiana endófita de la caña de azúcar. La Habana. Tesis (en opción al título de magíster en ciencias biológicas), Facultad de Biología. Universidad de La Habana.
Rodríguez, A. J.; Rojas, M. M.; Trujillo, I. D.; Manzano, J.; Heydrich, M. 2003. Caracterización de la comunidad microbiana endófita de la caña de azúcar. En: Memo­rias. V Taller Internacional sobre Recursos Fitogenéticos FITOGEN 2003. Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes, La Habana, Cuba.
Rojas M. M.; Pérez, L. C. 1998. Mejoramiento de las condicio­nes de cultivo para la producción de ácido-3-indol acéti­co por R. meliloti. Biología (CU) 12: 65-70.
Send, S. P.; Leopold, A. C. 1954. Paper chromatography of plant growth regulators and allied compounds. Physiol. Plant. 7: 98-108.
Strezelczyk, E.; Kampert, M.; Le, C. I. 1994. Effect of plant growth hormones on growth of Azospirillum sp. in media with carbon souces. Acta Microbiol. Polonica. 43: 89-95.
Tien, T. M.; Gaskin, M. H.; Hubbell, D. H. 1979. Plant Growth Substance produced by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennistem americanun L.). Appl. Environ. Microbiol. 37: 219-226.
Van Loon, L. C.; Bakker, R A. H. M.; Pieterse, C. M. J. 1998. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 36:453-483.
Velázquez, M.; Hernández A.; Heydrich, M.; Hernández, A. N. 1999. Estudio de la interacción maíz-Burkholderia cepacia. Revista Latinoamericana de Microbiología. 41: 17-23.
Yahalom, E. 1991. Bacterial Production of auxins. En: Interac­ciones entre plantas y microorganismos benéficos. Terra. 14 (2): 159-192.
13