Detección de secuencias específicas de ADN de Spongospora subterranea en suelo y tubérculos de papa
Detection of DNA specific sequences of Spongospora subterranea in soil and potato tubers
Cristian Oswaldo Saavedra Rodríguez*, Sandra Janeth Gómez González**, Jorge Evelio Ángel Díaz**
RESUMEN
Con el fin de identificar de manera precoz el agente causal de la sarna polvosa de la papa (Spongospora subterranea fs subterranea) tanto en semillas como en suelos aptos para el cultivo de este tubérculo, se ha desarrollado una prueba basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de tres secuencias ITS (espaciadores de transcripción interna específicos del ADNr) de 372,390 y 391 pb presentes en el genoma de S. subterranea. Para ello se estandarizó una metodología de extracción y purificación de ADN del microorganismo a partir de tejido vegetal infectado (agallas de raíz de papa y pústulas en papa) obtenido en pruebas de propagación del patógeno en invernadero. Una vez optimizada la PCR y determinada su sensibilidad, se validó la metodología molecular examinando muestras de tejido vegetal infectado y suelo infestado por el patógeno, provenientes de los departamentos de Cundinamarca y Nariño. La PCR detectó ADN del microorganismo tanto en el material vegetal infectado, como en las muestras de suelo analizadas (las 30 submuestras del área experimental fueron PCR positivas). Estos resultados muestran que dicha metodología se presenta no sólo como una técnica útil para la detección rápida del patógeno en suelo, sino también como una herramienta para determinar la presencia del microorganismo en suelos declarados libres de éste y como una alternativa eficaz para el control de calidad en la producción de semilla certificada de papa libre del patógeno.
Palabras clave: sarna polvosa, quistosoros, espaciador de transcripción interna, PCR, plasmodiofóridos.
ABSTRACT
A test has been developed for early identification of the casual agent for potato powdery scab (Spongospora subterranea fs subterranea). Identification was carried out in seeds and soil where this tuber is grown. A polymerase chain reaction (PCR) was set up for detecting 372, 390 and 391 bp ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences (ITS) in the S. subterraneagenome. A method for extracting and purifying DNA from infected plant material (potato root nodes and pustules on the potato) was standardised. Plant tissue was obtained by potato tuber propagation using an inoculum from the pathogen in greenhouse conditions. After the PCR had been optimised and its sensitivity determined, a molecular methodology was validated by examining plant material infected with S. subterranea and soil samples infested with the pathogen obtained from the departments of Cundinamarca and Nariño. The PCR detected S. subterranea DNA from infected material and soil samples (all thirty samples from the experimental area analysed proved PCR positive). These results show that this molecular method was not just useful for the early detection of the pathogen in soil samples but as a tool for detecting or determining the possible presence of this micro-organism in places that have been declared f ree of S. subterranea and an effective form of quality control in producing the certif ied potato seed.
Key words: Powdery scab, cystosori, internal transcribed spacer, PCR, plasmodiophorid.
INTRODUCCIÓN                                                          planta de papa y su tubérculo (Solanum tuberosum
L) causando la roña o sarna polvosa de la papa, en-
Spongospora subterranea f.sp. subterranea (S. fermedad que se distribuye ampliamente a nivel mun-subterranea) es un parásito intracelular que produce dial en zonas altas con temperaturas bajas y ricas en plasmodios infectantes en el sistema radical de la materia orgánica (Guerrero, 2002); esta enfermedad
Licenciado en biología. Laboratorio de Diagnóstico Molecular Vegetal, Instituto Colombiano Agropecuario. Correo electrónico:
crissarrod@hotmail.com
Biólogo, Ph. D. Director Laboratorio de Diagnóstico Molecular Vegetal, Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) Tibaitatá, km 14 vía
Mosquera. Correo electrónico: jorgecol@hotmail.com
Recibido: julio 25 de 2003. Aceptado: mayo 21 de 2004.
14
DETECCIÓN DE SECUENCIAS ESPECÍFICAS DE ADN DE S. subterranea
es la responsable de la depreciación en la calidad de los tubérculos debido a la presencia de lesiones en forma de pústula en la epidermis de los mismos y a la disminución en la producción de papa en varieda­des susceptibles. En la actualidad la sarna polvosa es una enfermedad cuya incidencia está en aumen­to debido a la persistencia de S. subterranea por va­rios años en forma de estructuras de resistencia (quistosoros), a la carencia de variedades de papa resistentes, a su fácil dispersión y poca susceptibili­dad a tratamientos agroquímicos, entre otros facto­res (Harrison et al., 1997).
En Colombia se reportó en 1965 y se encuen­tra ampliamente distribuida en los departamentos de Cundinamarca, Boyacá y Nariño, afectando entre un 50 y un 80% la producción de los tubérculos según la edad de cultivo, implicando pérdidas económicas en el sector agroindustrial, problemas fitosanitarios por la diseminación del patógeno a zonas libres de la en­fermedad, y para los productores de semilla de papa, el rechazo en el programa de semilla certificada.
La enfermedad se diagnostica de una forma tardía en semillas y cultivos debido a su difícil detec­ción tanto en el suelo como en semillas asintomáticas; de ahí que sea necesario implementar una metodo­logía rápida, altamente sensible y específica que permita detectar al microorganismo en suelo y semi­lla de papa, para el control fitosanitario del patógeno en programas de producción de semilla certificada libre de S. subterranea.
MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de muestras
El análisis del material biológico se efectuó a partir de tejido vegetal infectado con síntomas típicos cau­sados por S. subterranea (agallas en raíces de plan­tas y pústulas en epidermis de tubérculos), y de sue­los aptos para el cultivo de papa con presencia de este patógeno. Las muestras fueron suministradas y enviadas por el Programa de Producción de Se­milla Certificada del ICA, seccional Cundinamarca, y por el Laboratorio de Diagnóstico Fitosanitario, seccional Nariño, al Laboratorio de Diagnóstico Molecular Vegetal ICA-Tibaitatá; una vez recibido este material, se almacenó a -20 °C para la poste­rior determinación macroscópica, microscópica y molecular del patógeno.
El Laboratorio de Diagnóstico Fitosanitario seccional ICA-Pasto suministró 32 muestras de sue­lo de un campo experimental infestado con S. subterranea; 30 de estas submuestras (suelo entre 0 cm y 20 cm de profundidad) correspondían a cada uno de los puntos muestreados de dicho campo. Las otras dos muestras restantes son mezclas de suelo de los 30 puntos señalados de las submuestras en­tre 0-10 cm y 10-20 cm (gráfica 1). Los detalles del tipo de muestra analizado y su procedencia se ob­servan en la tabla 1.
Detección macroscópica y microscópica en tejido vegetal infectado
Una vez recibido y almacenado el material biológico, se efectuó una descripción macroscópica de las le­siones típicas de la enfermedad tanto en semillas de papa como en raíces infectadas. Al microscopio se determinó la presencia de quistosoros tanto en pústu­las como en agallas de raíz por medio de un montaje húmedo observado bajo los aumentos de 40X y 100X.
vol_6231-2004-14-23-1.jpg
Gráfica 1. Esquema obtención de muestras en suelo de un lote experimental de aproximadamente 1 Ha infestado con S. subterranea: recorrido realizado en zig-zag en el departamento de Pasto para la toma de 30 muestras del suelo entre 0-20 cm de profundidad (cada número corresponde a un punto de muestreo).
15
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL. VI No.1 Julio 2004 14 - 22
Propagación de S. subterranea bajo condiciones de invernadero
Para poder efectuar una estandarización en la ex­tracción y amplificación de ADN de S. subterranea a partir de tejido vegetal infectado se efectuaron prue­bas de propagación del microorganismo bajo condi­ciones de invernadero. Para esto, se inocularon 50 g de raíces con agallas provenientes de los departa­mentos de Nariño (municipio de Pasto, vereda Río Bobo) y Cundinamarca (municipio de Zipaquirá, ve­reda Páramo de Guerrero) en materas con capaci­dad para 2 kg con suelo proveniente de la granja San Jorge del ICA (Cundinamarca); posteriormente se sembraron por triplicado dos especies de semilla de papa (S. tuberosum, variedad Parda Pastusa y S. phureja, criolla) y se determinó el estado de desarro­llo de las plantas y la presencia de infección radical por S. subterranea cada 12 días; una vez determina­da la presencia de agallas en la raíz se procedió a la detección microscópica de quistosoros y a la extrac­ción de ADN a partir de éstos.
de guanidina, 10 mM EDTA, 50 mM de Tris HCl [pH 7.5], 8% mercaptoetanol), incubando a temperatura ambiente por 24 horas. El ADN extraído se purificó utilizando volúmenes iguales de cloroformo-isoamil alcohol (24:1), se precipitó con un volumen de isopropanol y acetato de sodio 3 M (pH 5.2), seguido por dos lavados con etanol 70%; el ADN obtenido se rehidrató en 50 ^L de TE (Bulman et al., 1998).
El segundo método se basó en la extracción de ADN por macerado de 0.25 g de muestra con 1 g de arena de revoque con nitrógeno líquido, resuspendido posteriormente en una solución de leche semides-cremada. Luego de concentrar la suspensión (por centrifugación) el sobrenadante se sometió a un bu-ffer de extracción a base de SDS (0.3% SDS, 0.14 M NaCl, 50 mM de acetato de sodio pH 5.1). El ADN se purificó con un volumen de fenol-cloroformo-isoamil alcohol (25:24:1), mientras que la precipitación se efectuó con 2.5 volúmenes de etanol absoluto, 0.1 volúmenes de acetato de sodio y glicógeno por 12 horas, seguido por dos lavados con etanol 70%, el ADN obtenido se resuspendió en 50 ^L de TE (Volossiouk et al., 1995).
El tercer método utilizado fue un protocolo mo­dificado del propuesto por Aponte (1998) para la ex­tracción de ADN de aislamientos Mycosphaerella fijensis; el protocolo modificado consistió en una disrupción celular de 0.25 g de agallas de raíz con nitrógeno líquido, seguido de una incubación a 65 °C con un buffer de extracción (50 mM Tris HCl, 50 mM EDTA, 3 % SDS, 1% 2p mercaptoetanol) por 30 mi­nutos. El ADN extraído fue purificado primero con un volumen de fenol saturado (pH 8.0) y luego con un volumen de cloroformo-isoamíl alcohol (24:1), pos­teriormente se precipitó con 0.5 volúmenes de eta­nol absoluto y 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) durante 12 horas, seguido por dos lava­dos con etanol 70% y resuspensión en 50 ^L de TE; una vez obtenida la suspensión de ADN, ésta se so­metió al proceso de purificación por columnas GFX™ Genomic Columns (Amersham Farmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las extracciones de ADN a partir de muestras de suelo del departamento de Nariño (municipio de Pasto) fueron sometidas a los protocolos de extrac­ción de ADN para Mycosphaerella fijensis modifica­do y al protocolo del estuche comercial ULTRA CLEAN SOIL DNA (Mo Bio Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Tabla 1. Tipo y procedencia del material biológico examinado para la detección de S. subterranea por PCR
Tipo de muestra
Lugar
Municipio
Departamento
Suelo con infestación natural y raíces de papa con agallas de roña polvosa
Pasto
Nariño
Raíces de papa con agallas de roña polvosa variedad Parda Pastusa
Pasto
Nariño
Tubérculos con pústulas epidérmicas variedad Diacol Capiro
Zipaquirá
Cundinamarca
Tubérculos con pústulas epidérmicas variedad Diacol Capiro
Usme
Cundinamarca
Suelo de cultivo experimental infestado por S. subterranea
Pasto
Nariño
Extracción de ADN a partir de suelo y tejido vegetal infectado
El proceso de extracción de ADN del material obteni­do en invernadero se realizó utilizando tres métodos. El primero consistió en someter 0.25 g de agallas de raíz a una solución de guanidina (5 M isotiocianato
16
DETECCIÓN DE SECUENCIAS ESPECÍFICAS DE ADN DE S. subterranea
El ADN extraído de los diferentes materiales bio­lógicos y orgánicos fue corrido en gel de agarosa 0.8% preteñido con bromuro de etidio a una concentración final de 0.5 \iglmL y visualizado en un transiluminador UV para determinar la calidad y el estado de la molé­cula. En cada electroforesis se incluyó un marcador de 1 kb (DNA Extensión Ladder-Invitrogen™). En el caso de las muestras de suelo procedentes del cam­po experimental del municipio de Pasto, se determinó la concentración (en ng/^L) y el nivel de contaminan­tes proteicos (A260/280) y húmicos (A260/230) del ADN ex­traído por espectrofotometría (Biophotometer EPPENDORF 6131).
PCR a partir de ADN de S. subterranea
Los procesos realizados para la detección de S. subterranea por PCR fueron la preparación de los reactantes utilizados en la mezcla maestra para cada reacción y la posterior amplificación en un termociclador MJ Research PTC-200. Las concentraciones finales de los compuestos para un volumen de reacción de 25 ^L destinados a la amplificación de ADN de S. subterranea a partir de pústulas de epidermis de tu­bérculos y agallas de raíces, fueron 10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 50 mM KCl, 2.0 mM MgCl2, 160 |xM dNTP, 250 nM de cada oligonucleotido, 0.8 unidades de Taq polimerasa (TucanTaq-Corpogen) y 1 ^L de ADN molde. Para el análisis de ADN total de suelo prove­niente del municipio de Pasto, la mezcla maestra para PCR, con un volumen final de 25 ^L, contenía las mismas concentraciones de reacción mencionadas anteriormente, además de Triton® X-100 al 0.1% y albúmina sérica bovina al 0.04%.
Los programas de termociclado utilizados para la amplificación de los tres productos de PCR se muestran en la tabla 2. Los oligonucleótidos usados para la amplificación específica de tres fragmentos de 372, 390 y 391 pares de bases fueron Spo1-Spo2, Spo8-Spo9 y Sps1-Sps2 respectivamente, cuyas re­giones blanco son secuencias específicas de ITS del ADNr de S. subterranea (tabla 3) (gráfica 2) (Bell et al., 1999; Bullman et al., 1998).
Para visualizar los productos de amplificación de la PCR se realizaron electroforesis en gel de agarosa al 2% preteñidos con bromuro de etidio al 0.5 ng/mL, utilizando un marcador de peso molecu­lar de 100 pb (100 pb DNA Ladder-Invitrogen™).
Límite de detección de la PCR en muestras de suelo
La sensibilidad o límite de detección de la PCR usan­do los oligonucleótidos Spo8 y Spo9 fue determina­da por la inoculación de 0.25 g de suelo libre de S. subterranea con 105, 104, 103, 102, 10, 1 y 0.1 formas de resistencia (quistosoros) de agallas de raíz pro­cedentes del municipio de Pasto (Nariño); una vez efectuada la inoculación, se procedió a la extracción y amplificación de ADN total de suelo con el fin de determinar la cantidad mínima de quistosoros detectables por PCR en este tipo de muestras.
Para el conteo de estructuras de resistencia en suspensión se pesó 0.01 gramos de agalla de raíz de la cual se obtuvieron los quistosoros que fueron suspendidos en 1 mL de agua destilada y se efectuó el recuento de formas de resistencia por medio de una cámara de Neubauer (French et al., 1982). Una vez estimado el número de formas presentes, se elabo­raron diluciones seriadas 1/10 a 1/106 en agua destilada para obtener de 105 a 0.1 quistosoros respectivamente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Detección macroscópica y microscópica en tejido vegetal infectado
La figura 1 muestra lesiones irregulares en for­ma de pústula en la superficie de tubérculos de papa, típicas de la enfermedad; las lesiones causadas por el rompimiento de células infectadas en la superficie del tubérculo presentan un color castaño púrpura cir­cunscrito por epidermis (pústulas). De igual forma, la presencia de agallas en hilera en forma de rosario, de color castaño oscuro (lo que indica un avanzado estado de infección por S. subterranea), fueron ob­servadas en muestras de raíz provenientes del de­partamento de Nariño (figura 2). Las lesiones obser­vadas en ambos tipos de muestras concuerdan con las patologías típicas de la sarna polvosa causadas por dicho patógeno, donde se evidenció en las aga­llas y pústulas la presencia de un polvillo color casta­ño que conforma las estructuras de resistencia (quistosoros) (Guerrero, 2002; Agrios, 1996).
Es importante aclarar que las expresiones pa­tológicas observadas en los tubérculos y raíces obe­decen a una patogénesis característica de los dife­rentes sitios geográficos de donde provienen las muestras; es decir, en las zonas de cultivo de papa
17
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL. VI No.1 Julio 2004 14 - 22
Tabla 2. Programas de termociclado empleados para la amplificación de tres fragmentos específicos presentes en los ITS del ADNr de S. subterranea
Oligonucleótidos
Ciclos
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
Spo1-Spo2
1 35 1
94 °C 2 min 94°C30seg NA
*NA 53 °C 30 seg NA
NA 72 °C 45 seg 72 °C 10 min
Spo8-Spo9
1 35 1
94 °C 2 min 94°C30seg NA
NA 57 °C 30 seg NA
NA 72 °C 45 seg 72 °C 10 min
Sps1-Sps2
1 35 1
95 °C 2 min 95°C20seg NA
NA 64 °C 25 seg NA
NA 72 °C 50 seg 72 °C 10 min
* NA: no amplificación.
agallas maduras de las raíces (figura 3b). Dichas estructuras fueron obser­vadas al microscopio en aumentos de 40X y 100X.
Propagación de S. subterranea bajo condiciones de invernadero
Se observaron los primeros síntomas de infección radical por S. subterranea en tubérculos de papa criolla (cultiva­da con suelo infestado por el patóge­no proveniente de Nariño) y Parda Pastusa (cultivada con suelo infesta­
del departamento de Nariño que se encuentran in­fectadas por S. subterranea, la enfermedad se pre­senta en el sistema radical de la planta, lo que pro­duce un descenso hasta del 50% en la producción total de la cosecha de la variedad Parda Pastusa (Guerrero, 2000). Caso contrario ocurre con los cul­tivos infectados en Cundinamarca, donde la produc­ción no se afecta, pero la calidad de los tubérculos es depreciada debido a la presencia de pústulas en la epidermis. Lo anterior sugiere que la resistencia de las raíces y los tubérculos a S. subterranea po­dría estar bajo un control poligénico independiente, como lo propone N. Fornier (citado por Harrison et al., 1997), al observar pelos radicales susceptibles a la infección en plantas cuyos tubérculos mostraron una resistencia considerable a la sarna polvosa.
La confirmación de infección por S. subterranea en los tejidos vegetales analizados se determinó por la presencia de quistosoros del patógeno sobre las pústulas de tubérculos enfermos (figura 3a) y en las
do por el patógeno proveniente de Cundinamarca) a los 60 días de siem­bra; para las siguientes dos semanas se obtuvieron agallas en estado maduro tanto en plantas de la va­riedad Parda Pastusa como en criolla; estos resulta­dos concuerdan con las observaciones de Guerrero (2000) quien señala que en Colombia, en especial en el departamento de Nariño, la variedad Parda Pastusa es la más susceptible a infección por S. subterranea posiblemente por factores genéticos de la misma.
Extracción de ADN a partir de suelo y tejido vegetal infectado
De los tres métodos de extracción utilizados para la obtención de ADN a partir de las agallas de raíz in­fectadas en las pruebas de invernadero y de tejido
lBSgent gTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACACTGAGTCGGTTCT 70
ACCGGCAGACCCCAAAACCACATGAGAACCTGGGTCCGJTTGTCTGTfjTAAGGGTGACGCCCGCTCTGGG 140
SPS'                                     Spo 1
GCTAGCTCGAAACCTTATGCAAACCGTATT.....ACTGAACTTACTAAAGTGGATCGTTTAACTAAATA 210
CAACTCrTAACAGTGGATATCnGGTTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCG 280
s.as
AATTGCAGAATTCAGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCAAGTTGCGCTTTCGAGATATCCTTGAAAGCAT 350
Tabla 3. Secuencia de los oligonucleótidos utilizados para la
amplificación de tres fragmentos específicos presentes en los ITS
del ADNr de S. subterranea.
Oligonucleótidos
Secuencia
*Tm
Sps1
5'-CCTGGGTGCGATTGTCTGTT-3'
58.8 °C
Sps2
5'-CACGCCAATGGTTAGAGACG-3'
56.8 °C
Spo1
5'-ATTGTCTGTTGAAGGGTG-3'
50.4 °C
Spo2
5'-GGTTAGAGACGAATCAGAA-3'
49.4 °C
Spo8
5'-CTGGGTGCGATTGTCTGTTG-3'
57.3 °C
Spo9
5'-CACGCCAATGGTTAGAGACG-3'
56.8 °C
GCCTCTTTGAGTGTCGGTTTCTATTCTCCCGGAAACGCCCTGTGCGTGGAAGGGGACTATGAGCTCTGGT 420
Sps2- Spo9 rr.KTrnATnnr.TrnAAAGATTArCCAACCCGGTGCGCGTCTCTGGCTTCTGATT'CGTCTCTAACCATTGG 490
Spo 2
28S geni CGTG'CCCGGTCATATAGAACCATTTTTTGACTCTAGATCTCAAATGAGGTAAGACTacccgctgaactta 560
Gráfica 2. Ubicación de los sitios de alineación de los oligonucleótidos específicos dentro de los espaciadores de transcripción interna (ITS) de S. subterranea (secuencia tomada del análisis realizado por Bullman et al., 1998).
1 Tm: temperatura de alineamiento.
18
DETECCIÓN DE SECUENCIAS ESPECÍFICAS DE ADN DE S. subterranea
vol_6231-2004-14-23-2.jpg
vol_6231-2004-14-23-3.jpg
Figura 1. Tubérculo de la variedad Diacol Capiro proveniente del departamento de Cundinamarca, con síntomas de sarna polvosa causados por S. subterranea.
vol_6231-2004-14-23-4.jpg
(a)
vol_6231-2004-14-23-5.jpg
Figura 2. Agallas en raíces de planta de papa variedad Parda Pastusa infectada por S. subterranea provenientes del departamento de Nariño.
epidérmico de los tubérculos infectados se pudo ob­tener un ADN de calidad óptima para las pruebas de amplificación, utilizando el protocolo de Aponte (1998), seguido por el uso de columnas de purifica­ción. La figura 4 muestra una electroforesis en gel de agarosa al 0.8% donde se observa el efecto del uso de columnas de purificación (GFX™ Genomic Columns. Amersham Farmacia) en tejidos vegetales y suelo (líneas 2, 4, 6 y 8), con respecto al ADN no purificado por este método con el mismo tipo de muestras (líneas 1, 3, 5 y 7); como se puede obser­var, las columnas de purificación disminuyen sustan-cialmente la cantidad de ADN inicial y a su vez la concentración de sustancias inhibidoras de PCR, brindando un molde óptimo para la amplificación, como se muestra en la figura 6.
Por otro lado, el ADN total de suelo extraído de las 30 submuestras analizadas provenientes del cam­po experimental de Pasto mediante el estuche comer­cial Ultra Clean Soil DNA (Mo Bio Laboratories), pre-
(b)
Figura 3. Estructuras de resistencia (quistosoros) de S. subterranea observadas a 40x tomadas de: (a) agallas de raíz, y (b) pústulas de epidermis con roña polvosa.
sentó un alto nivel de contaminantes húmicos (pro­medio A260/230 0.79 ± 0.08) y proteicos (promedio A260/ 2801.27 ± 0.18) típicos de este tipo de muestra. Dichos resultados son similares a los reportados por Zhou et al. (1996), en un estudio donde se recuperó ADN de diversos tipos de suelo, utilizando tres tratamientos de extracción diferentes, y se obtuvo A^^ para com­puestos húmicos de 0.88 y A260/280 de 1.23 para com­puestos proteicos, usando un buffer de extracción a base de SDS-CTAB (Zhou et al., 1996). Sin embargo, a pesar de la presencia de contenidos húmicos y proteicos, el estuche comercial permitió obtener un ADN de buena cantidad (la concentración promedio de ADN extraído fue de 154 ± 64.8 ng/^L) y calidad donde se observa un ADN no degradado y apropiado para las pruebas de PCR (figura 5).
19
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL. VI No.1 Julio 2004 14 - 22
vol_6231-2004-14-23-6.jpg
plificación positiva al efectuar una PCR utilizando los oligonucleotidos Sps 1-2, Spo 1-2 y Spo 8-9 para S. subterranea; los productos de amplificación obser­vados al nivel de 400 pb (figura 6), concuerdan con las pruebas de PCR realizadas por Bell et al. (1999) quienes obtuvieron un producto de 391 pb usando los iniciadores Sps1-2, y por Bullman et al. (1998) quienes obtuvieron productos de 372 y 390 pb usan­do los iniciadores Spo1-2 y Spo 8-9, respectivamen­te. Estos resultados confirman la homología genética que existe entre los aislamientos de ADN de S. subterranea obtenidos de material vegetal infectado de distintas zonas del país con los aislamientos de diferentes variedades de papa evaluados en otros países (Bell et al., 1999; Bullman et al., 1998); ade­más, pone de manifiesto la utilidad diagnóstica de los ITS, al poder amplificar dichas secuencias emplean­do oligonucleiótidos específicos de la especie para la detección del patógeno tanto en suelo como en semi­llas para garantizar la sanidad del cultivo de papa.
No obstante, el uso de columnas de purificación y la disminución de inhibidores por medio de diluciones de ADN total de suelo (figura 4, líneas 6 y 8) no arro­jaron el mismo resultado de amplificación obtenido a partir de tejido vegetal infectado, debido a diversos componentes de origen orgánico e inorgánico pre­sentes en el suelo que inhiben la PCR y que, a su vez, pueden degradar, inhibir y/o capturar la molécu­la de ADN (figura 4, línea 7), inhabilitándola para la reacción de amplificación (Wilson, 1997).
Caso contrario ocurrió con el ADN extraído a partir de las muestras de suelo provenientes del cam-
Figura 4. Efecto del uso de columnas de purificación de ADN en tejidos vegetales y suelo infectados con S. subterranea. Líneas 1 y 3, ADN de agallas de raíz (Mariño) y pústulas de tubérculo (Cundinamarca) sin tratamiento con columnas, respectivamente; líneas 5 y 7, ADN de suelo (Nariño y Cundinamarca) sin tratamiento con columnas; líneas 2, 4, 6 y 8, ADN purificado con columna de las mismas muestras de agallas de raíz, pústulas de tubérculo y suelo mencionadas anteriormente.
PCR a partir de ADN de S. subterranea
El ADN extraído a partir del tejido vegetal infectado en invernadero fue sometido al tratamiento de purifi­cación por columnas y diluido posteriormente en pro­porción 1/50; dicho ADN molde arrojó señal de am-
40 Kb
40 Kb
(b)
vol_6231-2004-14-23-7.jpg
12 13 14 15 16
|tfi*|ff|t|vw|
Jf - |ffff| Mi
(a)
Figura 5. Extracción de ADN total de 30 muestras de suelo de un cultivo experimental de papa infestado con S. subterranea ubicado en el departamento de Nariño (ver gráfica 1). En las tres figuras aparece en la línea 1 el marcador de peso molecular de 1Kb (Invitrogen). (a) Líneas 2-13: corresponden a ADN de los puntos de muestreo de 1 al 12 (ver gráfica 1); línea 14: corresponden al
control negativo de extracción (suelo libre de ADN de S. subterranea). (b) Líneas 2-15: corresponden a ADN de los puntos de muestreo del 13 al 26 (ver gráfica 1); línea 16: corresponden al control negativo de extracción. (c) Líneas 2-5: corresponden a ADN de los puntos de muestreo 27 a 30 respectivamente; línea 6: control negativo de extracción.
20
DETECCIÓN DE SECUENCIAS ESPECÍFICAS DE ADN DE S. subterranea
400 Kb -
vol_6231-2004-14-23-8.jpg
1996); así como al uso de un ADN óptimo para reac­ciones de amplificación obtenido a partir del estuche comercial de extracción de ADN total de suelo.
Con lo anterior se puede demostrar la especifi­cidad de los oligonucleótidos Spo1-2 en la detección directa de S. subterranea en el suelo, puesto que no se observaron otros productos de amplificación dife­rentes al esperado; esto indica que no existe reac­ción cruzada entre los oligonucleótidos utilizados y el ADN de otros microorganismos del suelo. De igual forma, los oligonucleótidos Spo 8-9 y Sps 1-2 arroja­ron resultados similares de amplificación en las 30 muestras analizadas (estas pruebas se analizaron por duplicado).
Límite de detección de la PCR en muestras de suelo
El estudio realizado por Bell et al. (1999) para la de­tección y cuantificación de S. subterranea logró de­terminar entre 1 y 3 quistosoros por gramo de suelo, utilizando un método de columnas de purificación Sephadex; en este caso, se logró detectar hasta 10 quistoros de S. subterranea en 0.25 gr de suelo ino­culado (la prueba se realizó por duplicado), utilizan­do el estuche comercial de extracción de ADN de suelo. Aunque los resultados obtenidos por Bell et al. (1999) difieren de los obtenidos en esta investiga­ción, se debe aclarar que la visualización de los pro­ductos de amplificación equivalentes al ADN de un (1) quistosoro se efectuó por medio de una técnica de tinción de ácidos nucleicos (SYBR Gold staining),
Figura 6. Amplificación de ITS de S. subterranea con oligonucleótidos específicos (ver gráfica 2). Línea 1: marcador de peso molecular de 100 pb; línea 2: producto de amplificación con los iniciadores Sps 1 y Sps 2; línea 3: producto de amplificación con los iniciadores Spo 1 y Spo 2; línea 4: producto de amplificación con los iniciadores Spo 8 y Spo 9; línea 5: control de reacción negativo.
po experimental de Pasto que, a pesar de tener nive­les altos de compuestos húmicos y proteicos, arrojó señal de amplificación positiva en las 30 submuestras de suelo analizadas utilizando los oligonucleótidos Spo1 y Spo 2 (figura 7). Estos resultados se obtuvie­ron debido a la estabilización de la enzima frente a la presencia de ácidos húmicos y de tal vez otros inhibidores entre la actividad de la Taq polimerasa y el ADN blanco (Kuske et al., 1998; McGregor et al.,
vol_6231-2004-14-23-9.jpg
400 pb
vol_6231-2004-14-23-10.jpg
Figura 7. Productos de amplificación de 372 pb con los oligonucleótidos Spo1 y Spo 2 a partir de ADN total extraído de muestras de suelo infestado con S. subterranea provenientes del campo experimental del departamento de Nariño (ver gráfica 1). En las figuras 7a, 7b y 7c en la línea 1 aparece el marcador de peso molecular de 100 pb (Invitrogen). (a) Línea 2: mezcla de suelo de los 30 puntos de muestreo tomadas entre 0-10 cm de profundidad, línea 3: mezcla de suelo de los 30 puntos de muestreo tomadas entre 10-20 cm de profundidad; Líneas 3-13: amplificación
de ADN de los puntos de muestreo del 1 al 10 (ver gráfica 1); líneas 14-15: controles positivo y negativo de reacción. (b) Líneas 2-11: amplificación de ADN de los puntos de muestreo del 11 al 20 (ver gráfica 1); líneas 12-13: controles positivo y negativo de reacción, respectivamente; línea 14: control de extracción negativo (suelo libre de S. subterranea). (c) Líneas 2-11: amplificación de ADN de los puntos de muestreo del 21 al 30 (ver gráfica 1); líneas 12 y 13: controles positivo y negativo de reacción respectivamente; línea 14: control de extracción negativo.
21
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL. VI No.1 Julio 2004 14 - 22
la cual permite una mejor resolución de productos de PCR menores de 1 ng, diferente a la usualmente utilizada con bromuro de etidio. Por tal motivo es pro­bable que la metodología usada en el presente tra­bajo pueda amplificar fragmentos de ADN a partir de una forma de resistencia y que no puedan ser visualizados en gel de agarosa preteñidos con bromuro de etidio, o que se haya dado la ausencia total de quistosoros en la dilución 1/106 utilizada para la inoculación en suelo y posterior extracción de ADN. No obstante, los resultados obtenidos muestran una sensibilidad 250 veces mayor con respecto a la téc­nica ELISA con anticuerpos monoclonales específi­cos para la cuantificación de quistosoros en suelo (esta metodología permite la detección confiable de inóculo hasta 104 quistosoros por gramo de suelo) (Rodríguez et al., 2002); dicho aspecto es de suma importancia, ya que el conocimiento de la cantidad de inóculo presente en un suelo apto para el cultivo permitirá predecir el grado de severidad de la enfer­medad en la cosecha.
La importancia de la PCR en la detección de S. subterranea radica en la sensibilidad y especificidad de la técnica para tal fin. Como se ha mostrado, la meto­dología utilizada fue altamente específica para detec­tar única y exclusivamente ADN de S. subterranea en suelo, agallas de raíz y pústulas de tubérculos infecta­dos, además de detectar ADN de al menos 10 estruc­turas de resistencia (quistosoros) por cada 0.25 gra­mos de suelo, confiriéndole una alta sensibilidad en la determinación del patógeno.
Los resultados del presente trabajo de desarro­llo tecnológico pueden ser aplicados en los progra­mas de sanidad vegetal y producción de semilla de papa para el diagnóstico, control y manejo de la en­fermedad.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Instituto Colombiano Agropecuario y a su oficina de Planeación Nacional por la financiación de la presente investigación, y al doctor Omar Guerrero Guerrero por el suministro de las muestras para el desarrollo de este proyecto.
BIBLIOGRAFÍA
Agrios, G. 1996. Fitopatología. México D.F.: Editorial Limusa.
Aponte, S. 1998. Caracterización molecular y análisis de va­riabilidad genética en los aislamientos de Mycosphaerella fijiensis provenientes del Magdalena medio y Santander colombiano. Tesis para optar el título de biólogo. Bogo­tá: Pontificia Universidad Javeriana.
Bell, K.; Roberts, J.; Verall, S.; Cullen, D.; Williams, N.; Harrison, J.; Toth, I.; Cooke, D.; Duncan, J.; Claxton, J. 1999. Detection and quantification of Spongospora subterranea f, sp. subterranea in soils and on tubers using specific PCR primers. European Journal of Plant Pathology. 105: 905-915.
Bullman, S. R.; Marshall, J. W. 1998. Detection of Spongospora subterranea in potato tuber lesions using the polymerase chain reaction (PCR). Plant Pathology. 47: 759-766.
French, E.; Herbert, T. T. 1982. Métodos de investigación fitopatológica. Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura. San José de Costa Rica. 287.
Guerrero, O. 2002. Descripción y manejo de las principales enfermedades de la papa. ICA-subgerencia de Protec­ción y Regulación Agrícola seccional Nariño. San Juan de Pasto. 32.
Guerrero, O. 2000. La roña o sarna polvosa de la papa en el departamento de Nariño. Resumen. Papas Colombia­nas. 2a edición. 3 (1-2):27-129.
Harrison, J. G.; Searle R. J.; Williams, N. A. 1997. Powdery scab disease of potato-a review. Plant Pathology. 46: 1 -25.
Kuske, C. R.; Banton, K. L.; Adorada, D. L.; Stark P.C.; Hill, K.K.; Jackson, J. P. 1998. small-scale DNA sample preparation method for filed PCR detection of microbial cells and spores in soil. Applied and Environmental Microbiology 64: 2463-2472.
Mc Gregor, D. P.; Forster, S.; Steven, J.; Adair, J.; Leary, C. E.; Leslie, D. L.; Harries, J. W.; Titball, W. R. 1996. Simultaneous detection of microorganisms in soil suspension based on PCR amplification of bacterial 16S rRNA fragments. Bio Techniques. 21:463-472.
Rodríguez, K.; Murcia, B.; Huertas, W.; Guzmán, M.; García, C. 2002. Estandarización de la técnica DAS-ELISA para la cuantificación de Spongospora subterranea en suelo. Memorias XXIII congreso ASCOLFI. Julio, Bogotá D.C.
Volossiouk, T.; Robb, J.; Nasar, R. 1995. Direct DNA extraction for PCR mediated assays of soil organisms. Applied and Environmental Microbiology. 61: 3972-3976.
Wilson, I. 1997. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and Environmental Microbiology. 63: 3741-3751.
Zhou, J.; Bruns M.; Tiedje, J. 1996. DNA recovery from soils of diverse composition. Applied and Environmental Micribiology. 62:316-322.
22
vol_6231-2004-14-23-11.jpg
4
Procesos Biotecnológicos y Medioambientales
EQUIPOS PARA
FERMENTACIÓN
0 Shakers
0 PH metros
0Oxi metros
0 Autoclaves
0 Fermentadores
0 Bombas Peristálticas
0 Cabinas de Flujo Laminar
0 Controladores de Proceso
0 Columnas para Células inmovilizadas
Asesoría en Diseño de Bioprocesos, Microbiología y Biotecnología
Estudios en Planta Piloto de Procesos de Fermentación
Asesoría en Producción de: Biofertilizantes, Bioinsecticidas, <* Biofungicidas, Degradadoresde Materia Orgánica e Hidrocarburos
vol_6231-2004-14-23-12.jpg
Calle 91 No. 29-38 of. 202 Bogotá
Teléfono 2562662, Fax 2562671, Celular 300-556-7955 Página web: www.pbmcolombia.com E-mail: danilozuluaga@hotmail.com