Introducción

La enfermedad periodontal es la patología más frecuente en cavidad oral a nivel mundial, son varios los factores etiológicos asociados, sin embargo, el más relevante es la presencia de placa bacteriana, dado que las bacterias allí presentes interactúan y desencadenan el inicio y progreso de la misma (Ferro y Gomez, 2007). En la población colombiana, los marcadores microbiológicos más significativos para la aparición de la enfermedad periodontal son: Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermendia y Fusobacterium nucleatum (Van Winkelhoff et al. , 2002; Crandall et al., 2012).

Dependiendo de la respuesta producida por el huésped (edematosa o fibrosa), a los mecanismos bacterianos se generan signos clínicos de enfermedad periodontal, los cuales pueden ser tratados clínica (terapias mecánicas y su potencialización con el uso de terapias antibióticas) (Drake y Villhauer, 2011), química (colutorios, cremas) (Cha et al., 2007) o naturalmente (Mosquera y Veloz, 2011).

La clorhexidina, una bisguanida catiónica (Cha et al., 2007), se ha empleado como agente antimicrobiano de amplio espectro. Aunque actúa como un potente bacteriostático o bactericida según la concentración, causa efectos adversos sobre los tejidos dentales, células epiteliales y restauraciones existentes. Por tal motivo, el uso de plantas como fuente de principios activos antimicrobianos, ha generado gran interés en el tratamiento de múltiples patologías y algunos microorganismos orales (Neira y Ramirez, 2005; Vitery et al., 2010), ya que son de fácil acceso, bajo costo y pocos efectos colaterales indeseables (Cha et al., 2007).

Dentro de las alternativas de origen natural se encuentran los aceites esenciales, fracciones liquidas volátiles responsables del aroma de las plantas. Es posible extraer el aceite esencial de hojas, raíces, pericarpio del fruto, semillas, tallo, flores y frutos (Mosquera y Veloz, 2011). Estos aceites poseen acción bacteriostática y bactericida, dependiendo de la concentración y el tipo de aceite. Se han utilizado como enjuagues bucales mostrando efectividad en el control de la placa dental y en el desarrollo y progreso de enfermedades que comprometen las estructuras de soporte dental (Kuboniwa y Lamont, 2010).

Aceites esenciales extraídos de plantas de la familia Rutaceae (naranja, limón, mandarina) han mostrado efectividad antimicrobiana (Shankar y Mohan, 2014). Los aceites esenciales de la cáscara de naranja son efectivos para controlar Escherichia coli, Salmonella spp (Pittman et al., 2011), Mycobacterium tuberculosis y otras Micobacterias no tuberculosas (Crandall et al., 2012; Espina et al., 2011). El aceite esencial de Citrus aurantium, presenta propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, ansiolíticas y antimicrobianas (Fuselli et al., 2008), presentando una mayor efectividad sobre bacterias Gram positivas (Tsai et al., 2008).

El Aceite esencial (AE) de mandarina (Citrus reticulata) presenta inhibición de crecimiento bacteriano contra Enterococcus faecium (ATCC 19434), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Salmonella entérica subsp. entérica ser. Enteritidis (ATCC 49214) y Escherichia coli O157:H7. El aceite esencial de mandarina tiene actividad antibacteriana del tipo bactericida contra B. subtilis, S. aureus y L. monocytogenes (Martinez et al., 2003), Shigella flexneri y los hongos Neurospora crassa y Candida albicans (Hsouna et al., 2013; Martinez et al., 2003).

Basados en la evidencia científica y en la efectividad de los aceites esenciales de cítricos frente a otros microorganismos con características similares a los presentes en cavidad oral, se hace necesario el estudio y análisis in vitro de estas sustancias naturales para determinar su posible aplicabilidad en el tratamiento patologías más importantes en cavidad oral, abriendo la senda para futuros estudios in vivo de compuestos cítricos que busquen complementar las terapias convencionales.

Materiales y métodos

Se realizó un estudio de tipo experimental in-vitro, a partir de cepas referencia ATCC de Fusobacterium nucleatum. Tomando como unidad muestral las unidades formadoras de colonia con crecimiento homogéneo y sin contaminación. Se tomaron en cuenta las siguientes variables para el desarrollo de los experimentos: variedad del aceite esencial (Oneco/Arrayana), halo de inhibición a diferentes concentraciones (100%, 80%, 60%, 40% 20%), actividad bactericida a diferentes concentraciones (100%, 80%, 60%, 40% 20%) y actividad bacteriostática a diferentes concentraciones (100%, 80%, 60%, 40% 20%).

Resultados

Teniendo en cuenta los halos de inhibición producidos por los aceites esenciales de las dos variedades de mandarina evaluadas, se observó que el promedio de inhibición para la concentración al 100% (17,73 mm; IC95% 15,52-19,94) es similar al producido por el control positivo (18,12 mm; IC95% 16.24-20), no encontrándose diferencias significativas entre ellas (p>0,05). Los promedios del diámetro de los halos de inhibición disminuyeron a medida que la concentración del aceite esencial también disminuía, presentándose valores entre 0 mm y 24 mm (tabla 2).

Las concentraciones menores evaluadas (20% y 40%) tienden a presentar diferencias significativas con las concentraciones mayores (60%, 80% y 100%). La concentración al 20% presentó diferencias significativas en el diámetro del halo de inhibición en relación a las concentraciones de 60%, 80% y 100% (p>0,05); y la concentración al 40% presentó diferencias significativas con las concentraciones al 80% y 100% (p>0,05).

Al comparar los halos de inhibición de los aceites esenciales de las dos variedades de mandarina, no se observaron diferencias significativas entre ellas a las concentraciones evaluadas (p>0,05). Para la variedad Oneco, no se encontraron diferencias significativas entre las diferentes concentraciones (a partir de las comparaciones entre los IC95%) (tabla 2).

Se observó una actividad bactericida del 88,2% en combinación para las dos variedades de aceite esencial a una concentración al 100%. Las concentraciones de 100% y 80% presentaron un comportamiento bactericida, mientras que las concentraciones del 60%, 40% y 20% mostraron un comportamiento bacteriostático. A la concentración más baja evaluada (20%), los aceites esenciales presentaron una actividad bacteriostática combinada de 76,5%. No se encontraron diferencias significativas entre las actividades bacteriostáticas o bactericidas de las variedades Arrayana y Oneco (p>0,05) (tabla 3).

Discusión

Fusobacteirum nucleatum es una bacteria que se ha asociado fuertemente con el establecimiento y mantenimiento de la biopelícula oral por la capacidad de promover la coagregación bacteriana, que finalmente termina generando múltiples enfermedades en cavidad oral como la periodontitis (Flanagan et al., 2014; Dahya et al., 2015; Budd et al., 2015). Su tratamiento ha estado marcado por medicamentos de orígen sintético como la clorhexidina, el cual ha logrado efectos bactericidas sobre periodontopatógenos y biopelícula oral, reflejados en disminución de la inflamación, enrojecimiento y bolsa periodontal. Sin embargo, diversos estudios argumentan que su uso continuo genera efectos adversos en la cavidad oral, tales como alteración del gusto, pigmentación de la estructura dental, sensación de quemazón o ardor en el epitelio gingival (Arjunkumar y Balagopal, 2013).

Tratamientos naturales alternos como los aceites esenciales de cítricos han demostrado tener una excelente actividad antimicrobiana y podrían ser una buena opción para el control de especies bacterianas presentes en biopelículas que causan enfermedades orales (Almeida et al., 2014). Tal como se encontró en este estudio, en donde el aceite esencial de mandarina en sus variedades Arrayana y Oneco, mostraron un efecto antimicrobiano sobre Fusobacterium nucleatum, una especie bacteriana clave en la formación de biopelículas (Socransky y Haffajee, 2005). En este estudio sin embargo, la actividad antimicrobiana del aceite esencial fue dependiente de la concentración, lo cual podría ser explicado por la complejidad de la envoltura celular de doble membrana de los microorganismos gram negativos como F. nucleatum (Ben et al., 2013) que podrían reaccionan ante sustancias antimicrobianas difundiendo la sustancia tóxica al medio externo y llevando los demás compuestos, al medio interno (Pendleton, 2011). Esto podría dar cuenta de la resistencia, el efecto bacteriostático y no bactericida en algunas especies bacterianas como Prevotella intermedia y Porphyromonas gingivalis ante la presencia de aceites esenciales derivados de cítricos (Hussain et al, 2015).

Otros estudios han mostrado que aceites esenciales derivados de cítricos como el Citrus limonum y Citrus aurantium son eficientes a la hora de controlar la composición bacteriana de las biopelículas (Almeida et al., 2014). Especies bacterianas como Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus y Aggregatibacter actinomycetemcomitans involucrados en procesos carcinogénicos y periodonto patológicos han mostrado ser sensibles ante los efectos de los aceites esenciales de Citrus sinensis (Hussain et al., 2015) (Shetty et al., 2016).

De acuerdo a los resultados, parece no haber diferencias significativas en el efecto bactericida y bacteriostático entre las dos variedades de mandarina evaluadas (tablas 2 y 3). Esto es importante pues para la selección de aceites esenciales en el tratamiento de enfermedades orales de origen infeccioso es importante tener en cuenta la composición química y sus propiedades biológicas (Stashenko et al., 2014) debido a que la actividad puede variar de un aceite a otro dependiendo de su quimiotipo (Pino et al., 2014). Aunque no se realizó un estudio para determinar la caracterización de cada aceite esencial, se podría concluir que a pesar de las diferencias morfológicas entre las dos variedades, no hay diferencias entre la composición de sus aceites esenciales y por lo tanto no se podría hablar de quimiotipos diferentes.

El potencial antimicrobiano de los aceites esenciales posiblemente se debe a la presencia de taninos, saponinas, compuestos fenólicos, aceites esenciales y flavonoides, compuestos biológicamente activos con actividad antimicrobiana. Aproximadamente el 80.3% de los compuestos presentes en cáscaras frescas de Citrus reticulata Blanco son monoterpenos (Sawamura et al., 2004). El terpineno, mirceno y pineno presente en las cáscaras de una gran variedad de mandarinas han mostrado tener una alta actividad antimicrobiana (Fuselli et al., 2008), se ha reportado que el tanino que se encuentra en extractos de cascaras de Citrus sinensis inhibe la síntesis proteica celular debido a la formación de complejos irreversibles con proteínas ricas en prolina (Shimada, 2006); esto permite comprender las propiedades biológicas de los aceites esenciales y los responsables de la actividad antimicrobiana contra microorganismos.

Los resultados de este estudio muestran la eficacia de los aceites esenciales de cáscara de mandarina sobre una especie bacteriana clave en la formación de biopelículas como es Fusobacterium nucleatum, la combinación de estos aceites esenciales con otros derivados de cítricos podría ser una alternativa terapéutica para el para el control de comunidades bacterianas presente en las biopelículas principalmente las asociadas a enfermedad periodontal, sin embargo es importante tener en cuenta su complejidad de los microbiomas presentes.