La dorada Brycon moorei, es un pez endémico de Colombia, distribuido en las cuencas del Magdalena y el Caribe (Maldonado-Ocampo et al., 2008). En el Magdalena se distribuye en las sub-cuencas de los ríos Cauca, San Jorge, Cesar, La Miel y Manso; mientras que en el Caribe se ha reportado en el Ranchería, desde el Cercado hasta Cuestecita (Mojica et al., 2012). Conocida comúnmente como Dorada, mueluda, sardinata (Magdalena) o lisa (Ranchería) (Mojica et al., 2012); es considerada una especie de gran importancia comercial con potencialidad piscícola debido a su tamaño, rápido crecimiento, alimentación omnívora y aceptación de alimento artificiales (Rodríguez-Franco et al., 2014).

En la cuenca del Magdalena la dorada es considerada vulnerable a la extinción, debido a la alta presión pesquera a que es sometida y la fuerte alteración antrópica que experimenta la cuenca; mientras que en el río Ranchería su situación es considerada crítica (Mojica et al., 2012). Ante esta situación se requiere de acciones de conservación, entre las que se destaca la crioconservación de semen, la cual ha sido considerada una herramienta para la conservación de especies amenazadas o en peligro de extinción mediante el establecimiento de bancos genéticos (Bobe y Labbé, 2009).

La crioconservación ofrece ventajas como optimización de los procesos reproductivos en cautiverio de especies con maduración gonadal asincrónica y ciclos reproductivos estacionales (Atencio-García et al., 2014); así como un uso eficiente del semen durante los procesos de reproducción artificial (Lahnsteiner et al., 2004). Según Medina-Robles et al. (2005) la crioconservación beneficia las actividades de reproducción en acuicultura, porque incrementa la posibilidad de reproducción por fuera de la temporada reproductiva, facilita el movimiento e intercambio de material genético, mejora la eficiencia en la utilización de los parentales y contribuye a disminuir la presión sobre las poblaciones silvestres ejercida por los piscicultores en procura de nuevos sementales.

Existe reportes de crioconservación de semen de más de 200 especies de organismos acuáticos en el mundo (Tiersch, 2011). Sin embargo en Colombia, los estudios de crioconservación de semen de peces nativos son recientes, destacándose los avances en el desarrollo de protocolos de crioconservación de cachama blanca Piaractus brachypomus (Navarro et al., 2004, Ramírez-Merlano et al., 2005), yamú Brycon amazonicus (Cruz-Casallas et al., 2004; Velasco-Santamaría et al., 2006), bagre rayado Pseudoplatystoma metaense (Ramírez-Merlano et al., 2011), bocachico Prochilodus magdalenae (Atencio et al., 2013) y bagre blanco Sorubim cuspicaudus (Atencio-García et al., 2014); con resultados satisfactorios del semen crioconservado en la reproducción artificial de estas especies.

Sin embargo, al tratar de utilizar estos protocolos en otras especies los resultados no han sido los mejores, debido a que se considera un proceso especie-específico (Lim y Le, 2013). Para que un protocolo de crioconservación de semen de una especie de pez sea exitoso es necesario ajustar cada uno de los factores considerados críticos en la realización de este proceso, entre los cuales se destacan la recolección del semen, la composición del diluyente, la concentración del crioprotector, y las curvas de congelación y descongelación (Tiersch, 2011, Irawan et al., 2010).

Los diluyentes o agentes crioprotectores son soluciones que tienen como función proteger la integridad del espermatozoide de la acción tóxica de los productos generados por su propio metabolismo durante el proceso de crioconservación, y reducir la temperatura de congelación del medio en el que se encuentran suspendidas las células para disminuir o contrarrestar la formación de cristales de hielo (Woods et al., 2004). La determinación del porcentaje de inclusión del crioprotector es importante porque define la capacidad de protección a la célula espermática y reduce la toxicidad sobre la misma. Por tanto, el objetivo de presente estudio fue evaluar el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) a tres porcentajes de inclusión (5, 10, 15%) como crioprotector en la crioconservación de semen de dorada Brycon moorei evaluando la calidad seminal post-descongelación.

El color del semen de dorada estuvo en el rango de amarillo pardo a amarillo, con volumen seminal promedio de 3,5±1,8 ml y movilidad total previa al proceso de congelación mayor a 80%, de acuerdo a lo propuesto por Martínez et al. (2011) para Prochilodus magdalenae. El tiempo de activación osciló entre 28,5 y 41 s; mientras que la concentración espermática osciló entre 10188,1 y 14590,2 millones/ml (tabla 1).

Tabla 1

Los valores de movilidad total (84,0±3,2%), progresividad total (52,4±8,8%), velocidad curvilínea (118,7±23,1 µm/s) y velocidad lineal (65,9±15,7 µm/s) de semen fresco fueron mayores con respecto a los registrados en semen descongelado (p<0,05). El semen fresco también registró el mayor porcentaje de espermatozoides con movilidad rápida (44,0±9,6%) y media (16,6±4,7%) y el menor porcentaje de espermatozoides estáticos (17,0±3,7%), se observó diferencia significativa con relación a los registros del semen descongelado (p<0,05) (tabla 2).

Tabla 2

La movilidad total del semen descongelado fue mayor cuando fue tratado con DMSO 5% (40,1±5,0%) y DMSO 10% (43,3±8,7%) sin observarse diferencia significativa entre estos tratamientos (p>0,05); mientras que DMSO 15% (30,6±7,9%) registró el menor valor (p<0,05). Sin embargo el porcentaje de espermatozoides rápidos en el semen descongelado osciló entre 6,2±4,3% (DMSO 5%) y 1,8±1,3% (DMSO 15%), sin observarse diferencia significativa entre estos tratamientos (p>0,05); así mismo el porcentaje de espermatozoide con movilidad media osciló entre 7,3±5,5% (DMSO 5%) y 5,8±3,3% (DMSO 15%) (p>0,05); mientras que el semen tratado con DMSO 15% registró el mayor porcentaje de espermatozoides estáticos, observándose diferencia significativa con el resto de tratamientos evaluados (p>0,05). Cuando el semen fue crioconservado con DMSO 5%, el porcentaje de espermatozoides con movilidad lenta fue de 26,7±6,4%; valor que no mostró diferencia significativa (p>0,05) con los resultados obtenidos para semen fresco (21,9±5,0%) ni con el semen crioconservado con DMSO 15% (23,0±5,1%) (tabla 2).

La progresividad total del semen descongelado osciló entre 9,9±5,9% (DMSO 5%) y 4,4±2,7% (DMSO 15%) sin observarse diferencia entre estos valores (p>0,05). La velocidad curvilínea del semen descongelado osciló entre 48,3±17,8 µm/s (DMSO 5%) y 35,3±9,2 µm/s (DMSO 15%) (p>0,05). Una tendencia similar fue observada en la velocidad lineal, la cual osciló 25,7±9,3 µm/s (DMSO 5%) y 15,9±5,7 µm/s (DMSO 15%) (tabla 2).

Los resultados de las características seminales de B. moorei del presente estudio son los primeros registros para machos mantenidos en cautiverio, cuyo semen fue obtenido mediante inducción hormonal. Sin embargo, existen reportes de las características seminales de otros co-específicos del género Brycon en cautiverio, con semen obtenido mediante hipofización como B. sinuensis (Montes y Salgado 2014), B. amazonicus (Cruz-Casallas et al., 2006a) y sin inducción hormonal como B. henni (Montoya-Lopez et al., 2006; Pineda-Santis et al., 2015).

En semen de brycónidos migratorios, obtenido mediante inducción hormonal por hipofización, Montes y Salgado (2014) en B. sinuensis reportaron una concentración espermática de 10058±5493 millones/ml y tiempo de activación entre 27 y 46 seg y Cruz-Casallas et al. (2005) en B. amazonicus registraron concentración de 13900±4000 millones/ml y tiempo de activación de 41±7 s; mientras que Pineda-Santis et al. (2015) en B. henni, un brycónido no migratorio, en semen fresco obtenido sin inducción hormonal, obtuvieron una concentración de 14554±5138 millones/ml, valores que podrían considerarse similares o cercanos a los obtenidos en el presente estudio.

La movilidad total del semen crioconservado es considerada un criterio de calidad espermática, que permite medir el éxito o fracaso del proceso de crioconservación. Padilla (2014) señaló que desde el mismo momento en que el semen entra en contacto con la solución crioprotectora se produce daños en las mitocondrias, membrana espermática y fragmentación del DNA como consecuencia del choque hiperosmótico y la toxicidad del crioprotector y que estos daños se incrementan durante los procesos de congelación y descongelación. La magnitud de los daños criogénicos puede resultar en disminución de la movilidad y velocidad espermáticas; lo cual termina afectando la capacidad fertilizante del semen descongelado (Ramírez-Merlano et al., 2010).

En los resultados del presente estudio, se encontró que en todos los casos el proceso de crioconservación y descongelación causó una reducción de la movilidad total, de las velocidades espermáticas, progresividad total e incrementó el porcentaje de espermatozoides inmóviles en el semen descongelado. La movilidad total del semen descongelado se redujo entre 48-52% con relación a la del semen fresco (84,0%) cuando fue tratado con DMSO 5% (40,1±5,0%) o DMSO 10% (43,3±8,7%) y cayó a alrededor de la tercera parte cuando fue tratado con DMSO 15% (30,6±7,9%). Pineda-Santis et al. (2015) obtuvo una reducción aproximada de 38% de la movilidad total del semen fresco de B henni cuando lo criopreservó con DMSO 5%.

El porcentaje de espermatozoides rápidos en el semen descongelado no mostró diferencia estadística a los diferentes porcentajes de inclusión del DMSO; pero mostró una drástica reducción con relación al semen fresco (44,0±9,6%) cuando fue tratado tanto con DMSO 5% (6,2±4,3%) como con DMSO 15% (1,8±1,3%) (p>0.05). El porcentaje de espermatozoides estáticos (sin movimiento) se triplicó con DMSO 5% (59,0±5,0%) y DMSO 10% (56,7±8,7%) con relación a semen fresco (17,0±3,7%); pero se incrementó a cuatro veces cuando DMSO se utilizó a 15% (69,4±7,9%) (tabla 2).

Las velocidades espermáticas (curvilínea y lineal) del semen descongelado se redujeron en más del 60%; mientras que la progresividad total disminuyó en más del 80% con relación a los registros de semen fresco (tabla 2). A pesar que en estas variables, en el semen descongelado, no hubo diferencia estadística entre las tres inclusiones de DMSO probadas (5, 10 y 15%), se observa una tendencia de menores velocidades y progresividad a medida que aumenta la inclusión del crioprotector. Según Lahnsteiner et al. (2000) la reducción de la velocidad espermática reduce la probabilidad que el espermatozoide alcance el micrópilo.

La movilidad total del semen crioconservado con DMSO 5% o 10%, fueron mayores a las obtenidas con DMSO 15% (p<0,05), lo cual sugiere que porcentajes de inclusión por encima de 10% ocasionan mayores daños a los espermatozoides de dorada; que cuando DMSO se incluye entre 5% y 10%. En otros brycónidos, la crioconservación de semen con DMSO entre 5 y 10%, también ha mostrado resultados adecuados como los reportados por Cruz-Casallas et al. (2006b) para B. amazonicus, quienes encontraron que DMSO a niveles de inclusión entre 5% (76±2%) y 10% (33±4%) permitieron buenos porcentajes de movilidad del semen descongelado. Murgas et al. (2001) reportaron valores de movilidad espermática de 53% en piracanjuba Brycon orbygnyanus utilizando DMSO al 10%, valores muy cercanos a los obtenidos en el presente estudio. Martínez (2010) recomendó crioconservar semen de Prochilodus magdalenae con DMSO a 10% para obtener una alta movilidad total (71±9.02%).

Los daños que sufren las mitocondrias y la membrana citoplasmática en el proceso de crioconservación se consideran como las principales causas de la pérdida de movilidad, tipos de movilidad y velocidades espermáticas (Cabrita et al., 2010; Padilla, 2014). Varios estudios han encontrado alta correlación entre el daño mitocondrial y la movilidad total (Fraser y Strzezek, 2007; Martínez et al, 2012; Padilla, 2014). La funcionalidad de la mitocondria juega un papel importante en la activación espermática, ya que suministra la energía en forma de ATP necesaria el movimiento del espermatozoide y la duración del mismo (Medina-Robles et al., 2005).

Los daños que sufren las mitocondrias se explican como consecuencia de la producción de especies reactivas de oxígeno (EROS); lo cual disminuye la movilidad por el descenso en la fosforilación de proteínas del axonema (O'Connell et al., 2002; Paasch et al., 2004; Martin et al., 2004). Se ha sugerido que el incremento del estrés oxidativo es causado por un desbalance entre la producción y remoción de las EROS que conduce al aumento en la concentración de los radicales libres y en consecuencia un aumento en el daño celular (Gallardo, 2007).

Martínez y Pardo (2010) sugieren que es probable que los crioprotectores interactúan directamente con las reservas de ATP, lo que disminuye su concentración en la célula espermática, como consecuencia del estrés osmótico por la adición del crioprotector y/o por la congelación del agua externa.

He y Woods (2004) crioconservaron semen de Morone saxatilis y encontraron que el nivel de ATP de semen precongelado disminuyó considerablemente cuando el crioprotector entró en contacto con los espermatozoides, y su pérdida fue mayor después de la congelación, lo cual les permitió sugerir que el proceso de crioconservación ocasiona daño en las mitocondrias.

Los resultados del presente estudio permiten concluir que DMSO debe ser incluido entre 5 y 10%, junto con glucosa al 6% y yema de huevo al 12% para crioconservar semen de dorada Brycon moorei; ya que concentraciones mayores ocasionan altas pérdidas de calidad del semen crioconservado.