A los 30 días de cultivo se evaluaron variables morfológicas, fisiológicas y bioquímicas como indicadores de estrés hídrico.

Morfológicos

Se determinó el número de brotes por explante y la altura de la planta (cm) medida con una regla graduada desde la base de cada planta hasta el punto de inserción en el pseudotallo de la hoja más joven completamente expandida.

Fisiológicos

Se determinó la masa fresca (MF) (g) y la masa seca (MS) (g) de las plantas. La primera de estas variables se obtuvo tras pesar las plantas inmediatamente después de extraerlas de los frascos de cultivo. Para determinar la MS las plantas se secaron en la estufa a 60ºC y se pesaron varias veces en el tiempo hasta mantener peso constante.

Bioquímicos

Se evaluaron tres indicadores bioquímicos correspondientes a: contenido de prolina y de H₂O₂ los cuales se determinaron de acuerdo a lo descrito por Moreno-Bermúdez et al. (2014), y el contenido de malondialdehido (MDA) que se determinó según Wang et al. (2009).

Diseño experimental y procesamiento estadístico

Se tuvieron en cuenta dos tratamientos: plantas in vitro sometidas a estrés y plantas in vitro no sometidas a estrés hídrico con PEG-6000. De cada tratamiento, para cada cultivar estudiado, se tuvieron en cuenta 12 réplicas; cada una estuvo conformada por un frasco de cultivo con seis plantas in vitro.

Para la determinación de las variables morfológicas y la MF se evaluaron 72 plantas, mientras que para la MS se evaluaron 24 plantas de cada cultivar para cada tratamiento respectivamente. Para determinar las variables bioquímicas fueron empleadas como material vegetal las plantas in vitro completas de ocho réplicas de cada cultivar para cada tratamiento. Las seis plantas de cada réplica se pulverizaron juntas en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC, para posteriormente tomar la cantidad necesaria para hacer las determinaciones. Estas se realizaron por espectrofotometría, con el uso de un espectrofotómetro GENESYS 6 (Thermo Electron Corporation (USA); Visionlite; Versión 2,1). Las determinaciones de los indicadores bioquímicos, para cada una de las réplicas de cada cultivar y tratamiento fueron realizadas tres veces.

Para el análisis estadístico se empleó el programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences) ver. 18,0 para Windows. Para el procesamiento de los resultados se comprobaron los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas por las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene respectivamente. Debido a que los datos no cumplieron con estos supuestos, para buscar diferencias entre los tratamientos se realizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para un intervalo de confianza del 95% (p <0,05). Las comparaciones para cada variable fueron realizadas entre ambos tratamientos para un mismo cultivar.

Morfológicos

Se observó una disminución en la altura de las plantas de los tres cultivares estudiados sometidas a estrés hídrico con PEG-6000, cuando se compararon con las plantas no sometidas a estrés (figura 2). Estas diferencias comenzaron a notarse a partir de los 15 días de cultivo, y fueron significativas al finalizar el experimento a los 30 días (figura 3A). Por otro lado, el número de brotes por explante también disminuyó significativamente para el cultivar ‘Manzano’ en las plantas tratadas con PEG-6000 cuando se realiza la misma comparación (figura 3B).

Figura 2

Figura 3

Tanto la altura como el número de brotes por explante son variables que se relacionan con el crecimiento vegetal. Jaleel et al. (2009))plantean que el crecimiento es uno de los procesos que se ven afectados en las plantas a causa del estrés abiótico. Por otro lado, Surendar et al. (2013b) refieren que la altura de la planta es un importante indicador morfológico relacionado con el crecimiento y desarrollo de los cultivos, procesos que envuelven a su vez el crecimiento y desarrollo celular. Estos últimos consisten en la división, alargamiento y diferenciación de las células, y son muy sensibles al déficit hídrico por su dependencia con el grado de turgencia de las mismas (Wareing y Phillips, 1970).

De acuerdo con los criterios anteriores la disminución en la altura de las plantas para los tres cultivares estudiados, podría constituir una evidencia de su sensibilidad al déficit hídrico impuesto. Sin embargo, también se plantea que como consecuencia de la falta de agua, las plantas limitan su crecimiento para evitar o tolerar la deshidratación, lo cual constituye un mecanismo de defensa ante el estrés (Valladares et al., 2004).

Por otra parte, la disminución en el número de brotes por el efecto del PEG-6000 significativa solo para el cultivar ‘Manzano’ podría ser indicativo de una mayor sensibilidad por parte de este a un déficit de agua. Esta respuesta pudiera deberse a su composición genómica, ya que a pesar de poseer la contribución de la especie M. balbisiana, Ravi et al. (2013) lo clasifican como sensible al estrés hídrico.

Una disminución en diferentes caracteres morfológicos de plantas de Musa spp. sometidas a estrés hídrico, también ha sido informada por otros autores, por ejemplo, Moreno-Bermúdez et al. (2014) en el cultivar ‘Grande naine’, Bidabadi et al. (2012) y Mahmood et al. (2012) en el cultivar ‘Berangan’ (AAA) sometido a estrés hídrico in vitro con PEG-6000. En cultivares de plátano con genotipo B, que como se mencionó con anterioridad se les atribuye una mejor tolerancia a la sequía, solo se han encontrado respuestas semejantes para las variables morfológicas aquí evaluadas, en condiciones ex vitro. Ejemplos de lo anterior son los estudios realizados por Ismail et al. (2004) en el cultivar ‘Pisang mas’ (ABB), y Surendar et al. (2013b) en los cultivares ‘Ney Poovan’ (AB), ‘Poovan’ (AAB), ‘Karpuravalli’ (ABB) y ‘Saba’ (ABB).

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el presente trabajo para las variables morfológicas evaluadas, sería necesario el análisis de otras variables para llegar a una mejor conclusión sobre el grado de tolerancia o sensibilidad de los cultivares estudiados al estrés hídrico in vitro.

Fisiológicos

La MF no varió de manera significativa a causa del estrés en el cultivar ‘Pelipita’, sin embargo en el ‘Manzano’ y el ‘Grande naine’ se observó una reducción significativa en aquellas plantas crecidas en presencia del PEG-600, en comparación con las que crecieron en condiciones normales (Figura 4A). Por otra parte, la MS disminuyó significativamente solo para las plantas sometidas a estrés del cultivar ‘Grande naine’ (figura 4B).

La MF y la MS son variables que tienen implícito el factor biomasa, una disminución de estas puede indicar una menor cantidad de biomasa. La MF además, incluye la cantidad de agua en los tejidos de la planta, por lo que una disminución de la misma también refleja la dificultad de las plantas para estar hidratadas (Rodríguez & Leihner, 2006).

Figura 4

Teniendo en cuenta lo anterior, la afectación de la MF en las plantas de ‘Manzano’ y ‘Grande naine’ sometidas a estrés, sugiere una sensibilidad por parte de estos cultivares al déficit hídrico in vitro, por la dificultad para producir biomasa. Si se tiene en cuenta que en el cultivar ‘Grande naine’ también se afectó de manera negativa la MS, pudiera asumirse que la sensibilidad fue mayor que en el ‘Manzano’. Por otro lado, el hecho de que para el cultivar ‘Pelipita’ ninguna de estas dos variables se haya modificado de manera significativa por el estrés (figura 4A y B), pudiera indicar que las plantas tratadas con el PEG-6000 fueron capaces de tolerarlo.

Los resultados de este acápite concuerdan con lo informado por Ravi et al. (2013), quienes clasifican al ‘Manzano’ y al ‘Grande naine’ susceptible y altamente susceptible al déficit hídrico respectivamente. Por otra parte, también en el trabajo referido se clasifica al grupo genómico ABB, al cual pertenece el ‘Pelipita’, como tolerante al factor abiótico evaluado. Estos autores basan su clasificación en observaciones realizadas en el ambiente ex vitro. Los resultados del presente trabajo muestran que en condiciones in vitro, los cultivares evaluados responden de manera similar. Adicionalmente, Moreno-Bermúdez et al. (2015), le confieren al cultivar ‘Pelipita’ tolerancia al estrés hídrico, tras evaluar la variable fisiológica “contenido de agua” en condiciones in vitro.

Por otro lado, Placide et al. (2012), obtuvieron resultados similares a los del presente trabajo en las variables MF y MS, tras evaluar la respuesta de diferentes cultivares de Musa spp. al estrés hídrico in vitro. Estos autores estudiaron los cultivares ‘Lep Chang’ (BBB), ‘Cachaco’ (ABB), ‘Popoulou’ (AAB), ‘Obino l´Ewai’ (AAB), ‘Williams’ (AAA), y ‘Mbwazirume’ (AAA). Los resultados mostraron que los cultivares en los cuales ambas variables fisiológicas se afectaron en menor medida, fueron los de mayor contribución de M. balbisiana (‘Cachaco’ y ‘Lep Chang’), por el contrario, el más afectado fue el ‘Mbwazirume’, y en el resto la afectación de estas y otras variables fue intermedia. De igual manera Bidabadi et al. (2012) y Mahmood et al. (2012) observaron una reducción de la MF en plantas de ‘Berangan’ sometidas a estrés hídrico con 30 g/L PEG-6000 como en el presente estudio.

Bioquímicos

Contenido de Malondialdehido (MDA)

Se observó un aumento significativo del contenido de MDA en las plantas sometidas a estrés de los cultivares ‘Manzano’ y ‘Grande naine’ cuando se comparan con las plantas no tratadas con PEG-6000 respectivamente. Para el cultivar ‘Pelipita’ no se observaron diferencias significativas en el contenido de este indicador entre plantas de ambos tratamientos (figura 5A).

Figura 5

El MDA es un indicador de daños celulares causados por estrés oxidativo, este es el producto final de la peroxidación lipídica, proceso que hace referencia a la degradación oxidativa de los lípidos tras sucesivas reacciones en cadena, ocasionadas por los radicales libres generados ante situaciones de estrés. Este proceso afecta el complejo de membranas de la célula, por lo que puede incidir de manera negativa en procesos celulares tales como la respiración (cuando afecta las membranas mitocondriales) y la fotosíntesis (cuando afecta las membranas de los tilacoides en los cloroplastos) (Mahouachi et al., 2005). Por tanto, aquellas plantas sometidas a estrés en las que no se observa un incremento en los niveles de MDA, presentan una mayor capacidad para tolerar tal condición.

De acuerdo con las explicaciones anteriores, los resultados presentados en la figura 5A sugieren que se produjo una afectación a las membranas celulares de las plantas sometidas a estrés tanto para el cultivar ‘Manzano’ como para el ‘Grande naine’. En cambio, el resultado obtenido para el cultivar ‘Pelipita’ sugiere que no se produjeron tales daños producto del déficit hídrico. Estos resultados pueden relacionarse entonces con una tolerancia del ‘Pelipita’ y una sensibilidad del ‘Manzano’ y el ‘Grande naine’ al factor abiótico estudiado bajo las condiciones evaluadas.

Otros estudios como este en Musa spp. también han informado la presencia de daños a nivel de membranas celulares producto de un estrés hídrico in vitro. Por ejemplo, Moreno-Bermúdez et al. (2014), en el cultivar de banano ‘Grande naine’, Shekhawat & Ganapathi (2014) y Tak et al. (2017), en el cultivar de plátano ‘Rasthali’ (AAB) y Chai et al. (2005), y Rustagi et al. (2015), en los cultivares de banano ‘Berangan’ y ‘Matti’ (AA) respectivamente. En todos estos casos se relacionó el aumento en los contenidos de MDA con una sensibilidad al estrés, y aquellas plantas cuyos valores de MDA no se incrementaron de manera significativa fueron consideradas más tolerantes.

Contenido de peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ )

Se observó un incremento significativo del contenido de H₂O₂ en las plantas sometidas a estrés de los cultivares ‘Manzano’ y ‘Grande naine’ cuando se comparan con las plantas no tratadas con PEG-6000. En las plantas del cultivar ‘Pelipita’ no se observaron diferencias significativas cuando se comparan ambos tratamientos. (Figura 5B).

El H₂O₂ está considerado como una especie reactiva del oxígeno (ERO) conjuntamente con el anión superóxido (O₂ ^•-), el radical hidroxilo (OH^•) y el oxígeno en estado de singlete (¹O₂) (Puthur, 2016). En condiciones normales las células vegetales producen ERO continuamente como subproductos de varias rutas metabólicas localizadas en diferentes compartimentos celulares (cloroplastos, mitocondrias y microcuerpos), pero a un nivel bajo en el que son rápidamente eliminadas por los diferentes sistemas antioxidantes y no provocan daño celular (Tadeo & Gómez-Cárdenas, 2008). En condiciones de estrés la producción de este tipo de compuestos se eleva drásticamente y daña diferentes biomoléculas estructurales de la célula como el ADN, las proteínas y a los lípidos de las membranas a través de la peroxidación lipídica (Rai et al., 2011).

Teniendo en cuenta lo anterior, el incremento significativo en el contenido de H₂O₂, observado en los cultivares ‘Manzano’ y ‘Grande naine’ producto del déficit hídrico, sugiere un mayor estrés oxidativo que pudo resultar en un mayor daño a las membranas celulares. Esto último lo corrobora el incremento en el contenido de MDA discutido con anterioridad, significativo también para estos dos cultivares (figura 5A). Estos resultados, por tanto, demuestran la sensibilidad del ‘Manzano’ y ‘Grande naine’ al estrés ocasionado por el PEG-6000. Por otra parte la respuesta observada para el cultivar ‘Pelipita’ en el contenido de H₂O₂, de igual manera que para los indicadores anteriores donde no se observó variación significativa entre ambos tratamientos, pudo deberse a la tolerancia de este cultivar a las condiciones de estrés osmótico a las que fue sometido.

Aumentos en el contenido de H₂O₂ en plantas de Musa spp. sometidas a estrés hídrico in vitro han sido también observados por varios autores, por ejemplo, Shekhawat et al. (2011), en el cultivar de plátano y ‘Rasthali’ y Bidabadi et al. (2012) en banano cv. ‘Berangan’. En todos estos estudios, como en el presente, los incrementos en el contenido de H₂O₂ estuvieron acompañados de incrementos en los contenidos de MDA, y ambos se han relacionado con una sensibilidad de las plantas a la falta de agua.

Contenido de prolina

Se observó un incremento significativo del contenido de prolina en las plantas sometidas a estrés, comparadas con aquellas crecidas en ausencia de PEG-6000 para los cultivares ‘Grande naine’ y ‘Manzano’. En el cultivar ‘Pelipita’ se observó una tendencia al aumento de este indicador debido al déficit hídrico, sin embargo no hubo diferencias significativas entre ambos tratamientos. (Figura 6).

Figura 6

La respuesta en el contenido de este aminoácido fue similar a la observada para el resto de los indicadores bioquímicos en los tres cultivares. Los incrementos de H₂O₂ y MDA en el ‘Grande naine’ y el ‘Manzano’ demostraron un mayor daño por estrés oxidativo y a las membranas celulares respectivamente. Lo anterior fue interpretado como una muestra de su sensibilidad al estrés por sequía. Por tanto, pudiera decirse que los incrementos de prolina, significativos también solo para estos dos cultivares, se relacionan en estos casos con la sensibilidad al déficit de agua.

Incrementos en el contenido de prolina pueden ocurrir debido a la hidrólisis de las proteínas bajo condiciones de estrés hídrico (Kramer & Boyer, 1983). Por otro lado, como se mencionó con anterioridad, las proteínas son biomoléculas que pueden resultar dañadas ante un déficit de agua por la acción de ERO como el H₂O₂ (Rai et al., 2011). Teniendo en cuenta estos criterios, en el presente estudio los incrementos de la concentración de H₂O₂ pudieron ocasionar un daño a las proteínas, lo cual pudo provocar su hidrólisis, y como consecuencia, ocurrir el aumento en el contenido de prolina libre. lo anterior explicaría la respuesta observada para esta variable. Parra corroborar lo anteriormente argumentado se pudiera tener en cuenta en futuros experimentos la determinación del contenido de proteínas totales, usada también como indicador de tolerancia o sensibilidad a estrés hídrico por autores como Surendar et al. (2013a).

Otra explicación a lo observado para el contenido de prolina en los cultivares ‘Grande naine’ y ‘Manzano’, podría ser que el aminoácido haya tenido que incrementarse, como una necesidad para contrarrestar el déficit de agua al que estaban sometidos. Según Tadeo y Gómez-Cárdenas (2008), esta molécula es un compuesto osmoprotector y un soluto compatible con el funcionamiento celular con la función de conferir estabilidad estructural a las membranas. También se le atribuyen funciones como la captura de ERO y el mantenimiento del potencial redox celular (Hare et al., 1998; Peleg y Blumwald, 2011). No obstante, a pesar del incremento de prolina probablemente como un mecanismo de defensa ante el estrés osmótico, los niveles de H₂O₂ y MDA se mantuvieron elevados. Esto demuestra que en el ‘Grande naine’ y el ‘Manzano’ la condición impuesta no pudo ser contrarrestada, y corrobora su sensibilidad.

En el cultivar ‘Pelipita’ no se observaron diferencias significativas para este indicador entre ambos tratamientos. Esta misma respuesta para el contenido de H₂O₂ y MDA fue interpretada como una prueba de la tolerancia de este cultivar al estrés al que fue sometido. De acuerdo con lo anterior, el resultado obtenido para el contenido de prolina en este caso, se pudiera relacionar con una manifestación de tolerancia al estrés hídrico. Es posible que en el ‘Pelipita’ no existiera la necesidad de incrementar los niveles de prolina de manera significativa, por su capacidad para soportar el déficit de agua a la concentración de PEG-6000 utilizada. Este resultado concuerda con lo informado por Tsoata et al. (2015), quienes demostraron que bajos contenidos de prolina son indicadores de una mejor tolerancia al estrés por sequía.

En Musa spp. la determinación del contenido de prolina ha sido útil para identificar plantas tolerantes al déficit hídrico (Mahmood et al., 2012; Sreedharan et al., 2013). En estos estudios se han relacionado los incrementos de este aminoácido con una tolerancia al estrés, contrario a lo observado en el presente trabajo. Sin embargo, el rol de la prolina ante un déficit hídrico es una cuestión controversial, ya que existen criterios diversos y no se ha llegado a un consenso en este sentido. (Reyes et al., 2012; Florido & Bao, 2014). Algunos autores asocian los incrementos con una tolerancia al estrés (Llano & Alcaraz, 2012; Lum et al., 2014) y otros con una sensibilidad (Lamz et al., 2013).

Los resultados de la presente investigación comprueban la relación que existe entre las respuestas de las plantas en condiciones in vitro e in vivo. Lo anterior lo corrobora el hecho de que los genotipos de Musa spp. estudiados en este trabajo, respondieron de manera similar a como se ha referido en la literatura científica, responden en condiciones naturales (Ravi et al., 2013).

Por otra parte, la determinación de una mayor cantidad de variables indicadoras de estrés hídrico para los cultivares ‘Grande naine’ y ‘Pelipita’ en este trabajo, con respecto a trabajos previos (Moreno-Bermúdez et al., 2014, Moreno-Bermúdez et al., 2015), contribuye a comprender mejor su respuesta al déficit de agua en condiciones in vitro. Los resultados obtenidos para el ‘Manzano’, además, constituyen los primeros informes para este último cultivar en la temática abordada.