Bocachico Prochilodus magdalenae, especie endémica y el principal recurso de la pesquería continental colombiana, fue catalogada como vulnerable a la extinción (Mojica et al., 2012). En los últimos cuarenta años, su captura ha disminuido aproximadamente 67%, pasando de 38000 ton en 1978 a 12728 ton en 2017 (De la Hoz et al., 2017). Entre las principales causas de este declive se señalan la degradación ambiental, la pérdida de conectividad de los ríos, pérdida de planos inundables así como la fuerte presión pesquera. También se le considera una alternativa para la piscicultura de recursos económicos limitados y de seguridad alimentaria por las ventajas que representa su hábito detritívoro, ya que sus cultivos no son dependiente de las dietas comerciales.

La crioconservación de semen de peces es una importante herramienta biotecnológica que se destaca por su contribución al establecimiento de bancos de recursos genéticos, disminución de la presión pesquera sobre las poblaciones silvestres y conservación de especies amenazadas o en peligro de extinción (Boskurt, 2018; Kumar & Betsy, 2015; Atencio-García et al., 2015; Bobe & Labbé, 2009; Medina-Robles et al., 2005). También la criopreservación permite el aseguramiento de semen de calidad, libre de enfermedades y por tanto se considera un método seguro para el suministro de alevinos a la industria piscícola (Cabrita et al., 2014). Además, ayuda a la reducción de los costos en las granjas productoras de alevinos, ya que permite el transporte de semen entre diferentes granjas evitando el traslado de reproductores (Cabrita et al., 2010; Martínez-Páramo et al., 2017; Judycka et al., 2019) y permite reproducciones en cautiverio cuando se presenta asincronía en la maduración gonadal entre machos y hembras (Boskurt, 2018).

Para criopreservar semen es necesario proteger a la célula con sustancias conocidas como crioproptectores que de acuerdo a, su capacidad para penetrar la membrana plasmática pueden ser permeables o impermeables (Xin et al., 2017). Los crioprotectores permeables deben ser hidrosolubles y de baja toxicidad para minimizar los daños criogénicos y evitar la formación de hielo intracelular (Kumar & Betsy, 2015; Moskovtsev et al., 2012).

El semen de bocachico se ha criopreservado utilizando dimetilacetamida (DMA), (Atencio-García et al., 2013) y dimetilsulfóxido (DMSO) (Atencio-García et al., 2015). En ambos estudios el crioprotector permeable estuvo acompañado de yema de huevo (YH) y glucosa como diluyente. Sin embargo, los protocolos de crioconservación son específicos y deben ser optimizado para cada especie (Atencio-García et al., 2014; Glogowsky et al., 1999). Por esta razón hay un interés de buscar protocolos alternativos de criopreservación más eficientes. Un crioprotector interno o permeable que ha sido evaluado con éxito en semen de peces es el etilenglicol (EG) un polialcohol, de bajo peso molecular (62,07 g/mol) y alta permeabilidad celular (Choez, 2016). En el bagre Sorubim cuspicaudus, el semen criopreservado con EG mostró una tasa de eclosión similar a la obtenida con semen fresco (Atencio-García et al., 2014).

Entre los crioprotectores no permeables más usados en la criopreservación de semen de peces se destaca la yema de huevo, en combinación con glucosa como diluyente (Viveiros & Gondinho, 2009). Sin embargo, a pesar de los beneficios de la yema de huevo, su uso podría generar problemas de bioseguridad (riesgo sanitario) que incluyen la producción de metabolitos y toxinas perjudiciales y el riesgo de infección, resultando en la reducción de la calidad del semen (Akhter et al., 2012; Yildiz et al., 2013). Por otro lado, no siempre es posible combinarla con algunos crioprotectores permeables (Maria et al., 2006).

Una alternativa de reemplazo de la yema de huevo es la leche en polvo; cuyas micelas de caseína, interactúan con las proteínas de la membrana plasmática del espermatozoide protegiendo y evitando la remoción de fosfolípidos y colesterol de la membrana (Bergeron & Manjunath, 2006). También se ha sugerido que la caseína tiene un efecto antioxidante y por lo tanto confiere protección a los espermatozoides durante la congelación (Salomon & Maxwell, 2000).

Por tanto el objetivo de este estudio fue evaluar la inclusión de diferentes porcentajes de etilenglicol (6, 8, 10%) y leche en polvo descremada (3, 5, 7%) en la criopreservación de semen de P. magdalenae mediante la determinación de su calidad seminal y capacidad fecundante.

Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con arreglo factorial 3x3, es decir dos factores (nivel de inclusión de EG y nivel de inclusión de LP), cada uno con tres niveles. Todos los datos, previamente transformados (arcsen), fueron sometidos a pruebas de normalidad (test de Shapiro Wilk) y de homogeneidad de varianza (test de Bartlett), cumplidos estos supuestos se realizó un análisis de varianza (ANAVA) y finalmente para identificar diferencias entre los tratamientos se realizó una prueba de rango múltiple de Tukey (p<0,05). Mediante el análisis factorial se determinó el efecto de cada uno de los factores de manera independiente y su interacción sobre cada una de las parámetros evaluados. Los resultados fueron expresados en media ± desviación estándar (DS). Los análisis se realizaron con ayuda del Software estadístico R, versión R Studio 3.0.1.

Característica del semen de bocachico. Las características del semen de bocachico obtenido por inducción hormonal con EPC se muestran en la tabla 2. El semen de color blanco, con volumen seminal (mayor de 2 ml) por encima de los reportes previos para la especie por inducción hormonal (0,7-1,3 mL) (Montes, 2018; Atencio-García et al., 2013), con alta movilidad (> 90%), alta progresividad (> 70%), bajo porcentaje de espermatozoides inmóviles, tiempo de activación y concentración espermática dentro del rango reportado para la especie (Montes, 2018; Atencio-García et al., 2013).

Tabla 2

Características	Media ± DS
Volumen (ml)	2,3±0,4
Concentración espermática (x106/ml)	18838,8±7271,4
Movilidad total (%)	94,5±3,4
Tiempo de activación (s)	28,5±1,5
Rápidos (%)	55,8±18,8
Medios (%)	29,7±18,6
Lentos (%)	10,2±9,3
Inmóviles (%)	4,2±5,0
Progresividad total	70,5±10,0
Velocidad curvilineal (µm/s)	136,0±40,6
Velocidad lineal (µm/s)	65,0±18,6

Efecto de factores e interacción. La tabla 3 registra el efecto de cada factor y su interacción. El porcentaje de inclusión de EG (factor A), en el rango evaluado (6-10%) no afectó significativamente (p>0,05) ninguna de los parámetros de calidad seminal analizadas excepto la tasa de eclosión (p<0,05). Mientras que, la LP (factor B) tuvo efectos significativos sobre el porcentaje de espermatozoides estáticos (p<0,05) y muy significativos sobre las tasas de fertilización y eclosión (p<0,01). De igual forma la interacción de los factores solo afectó significativamente el porcentaje de espermatozoides estático (p<0,05). Los resultados sugieren que la LP es un factor crítico en la capacidad fecundante del semen descongelado de bocachico.

Tabla 3

Parámetros	Factores		Interacción
	EG	LP	EGxLP
Mt	ns	ns	ns
Rápidos	ns	ns	ns
Medios	ns	ns	ns
Lentos	ns	ns	ns
Estáticos	ns	*	*
VCL	ns	ns	ns
VSL	ns	ns	ns
Pt	ns	ns	ns
Fertilidad	ns	**	ns
Eclosión	*	**	ns

Mt, movilidad total; VCL, velocidad curvilínea; VSL, velocidad lineal; Pt, progresividad total; *, significativo (p<0,05); **, muy significativo (p<0,01); ns, no significativo.

Calidad del semen descongelado. En la tabla 4 se presenta la calidad seminal del semen descongelado. Los resultados del presente estudio, sugieren que el proceso de criopreservación y descongelación ocasionó una disminución de la movilidad total, progresividad, espermatozoides rápidos y medios y un incrementó de los espermatozoides estáticos. Las menores movilidades totales (22,0-24,6%) se obtuvieron cuando el EG se incluyó al mayor porcentaje de inclusión (10%) y la LP a 5% o menos (EG10+LP3 y EG10+LP5). Pero cuando EG se incluyó a 6 u 8% a cualquier inclusión de la LP (3-7%) las movilidades totales (27,8-34,3%) fueron similares a las reportadas (~31%) por Atencio-García et al. (2013) cuando criopreservó semen de bocachico con DMA (8 o 10%) y yema de huevo 12%. En el presente estudio, los menores valores de progresividad total (0,7±0,5%) y velocidades espermáticas (VCL entre 21,7±2,8 y 23,0±2,2 µm/s; VSL entre 5,0±1,1 y 5,3±2,1 µm/s) se obtuvieron cuando EG se incluyó a 10% y la LP a 5% o menos.

Tabla 4

Parámetro	Tratamientos
	EG6+LP3	EG6+LP5	EG6+LP7	EG8+LP3	EG8+LP5	EG8+LP7	EG10+LP3	EG10+LP5	EG10+LP7
Mt (%)	28,0±5,4ab	31,9±9,6ab	31,1±10,5ab	27,8±4,8ab	28,7±15,7ab	34,3±18,1ab	22,0±2,0b	24,6±3,4b	38,4±18,4a
Rápidos	1,2±0,7ab	0,9±0,8ab	0,7±0,8ab	0,5±0,4b	0,7±0,7ab	3,8±8,3a	0,4±0,2b	0,3±0,3b	1,2±1,3ab
Medios	3,3±1,5ab	6,0±4,6a	3,7±3,0ab	3,4±1,1ab	3,2±4,1ab	5,3±6,6ab	1,1±0,7b	1,3± 0,8b	5,6±5,0a
Lentos	23,5±3,7ab	25,0±5,5ab	26,7±8,8ab	23,9±3,8ab	24,9±11,4ab	25,0±5,4ab	22,3±5,5b	22,4±3,1b	31,5±12,1a
Estáticos	72,0±5,4a	68,1±9,6ab	69,0±10,5a	72,3±4,8a	71,3±15,7a	45,6±25,9c	74,5±6,7a	49,2±29,1bc	61,7±18,4abc
VCL (µm/s)	29,1±4,2ab	31,3±7,4ab	28,5±6,1ab	26,7±3,0ab	26,3±6,0ab	35,9±23,9a	23,0±2,2b	21,7±2,8b	26,6±6,2ab
VSL (µm/s)	9,5±2,2abcd	12,9±6,7a	9,2±3,6abcd	6,3±1,1bcd	8,1±5,0abcd	10,7±7,3ab	5,0±1,1d	5,3±2,1cd	10,6±6,3abc
Pt (%)	3,0±1,5ab	4,8±4,4ab	2,7±2,0ab	1,3±0,9ab	2,7±3,9ab	5,9±10,4a	0,7±0,5b	0,9±0,4ab	4,8±5,0ab

Letras diferentes en una misma fila indican diferencia estadística significativa (p<0,05). EG, etilenglicol (los números indican el porcentaje de inclusión); LP, leche en polvo liofilizada (los números indican el porcentaje de inclusión); Mt, movilidad total; VCL, velocidad curvilínea; VSL, velocidad lineal; Pt, progresividad total.

El EG también ha sido utilizado en la criopreservación de semen de bagres como Sorubim cuspicaudus a inclusiones entre 6 y 10% con registros de movilidades inferiores a 30% (Espinosa, 2013). Atencio-García et al. (2014) reportaron que la mejor movilidad total del semen criopreservado de S. cuspicaudus se obtuvo con EG 5% (36,9±9,1%) y sugirieron una relación inversa entre la movilidad total y los porcentajes de inclusión de EG. Herrera-Cruz et al. (2019) obtuvieron movilidades entre 22,2 y 10,3% cuando criopreservaron semen de Pseudoplatystoma magdaleniatum con EG incluido a 5 o 10%.

La movilidad han sido considerado el parámetros más utilizado para evaluar la calidad del semen fresco como criopreservado . La movilidad del espermatozoide generalmente presenta una correlación positiva con la capacidad de fertilización, porque afecta la capacidad del espermatozoide para alcanzar el ovocito para una fertilización exitosa (Rurangwa et al., 2004). Está ampliamente demostrado que la criopreservación disminuye la actividad metabólica y calidad de espermatozoide criopreservado (Cabrita et al., 2014; Xin et al., 2020). Una de las principales razones de la disminución de la actividad metabólica y la baja calidad de los espermatozoides descongelado es la alteración de las estructuras mitocondriales y la membrana en la parte media durante la criopreservación (Figueroa et al., 2017). Estas alteraciones afectan la función mitocondrial, incluyendo los procesos bioquímicos involucrados en la producción de ATP (Figueroa et al., 2015) y por tanto disminuyen la energía disponible para la movilidad. Los espermatozoides requieren ATP para cumplir con múltiples funciones celulares y eventos bioquímicos, tales como el mantenimiento de la motilidad y la activación de la fosforilación para la fertilización exitosa (Miki, 2010).

Otras de las causas que afectan la movilidad espermática es el daño a la membrana espermática; lo cual ocasiona pérdida de algunos componentes internos de la célula y reducen su actividad enzimática (Dietrich et al., 2015). Martínez-Páramo et al. (2012) consideran que los procesos de congelación y descongelación inducen alteraciones en la bicapa lipídica de la membrana del espermatozoide, ocasionando su desestabilización y la pérdida de componentes celulares. Estas alteraciones no sólo afectan la movilidad y la viabilidad espermática sino también aumentan la peroxidación lipídica y el porcentaje de espermatozoides estático.

Algunos estudios reportan que las proteínas, que generalmente se disminuyen en los espermatozoides durante la criopreservación están asociadas a la disponibilidad de energía para el movimiento como las de actividad catalítica y al ATP (Dietrich et al. 2015; Nynca et al. 2015). Se ha reportado la disminución de la β-enolasa y de la subunidad β de la ATP sintasa mitocondrial, miembros de una superfamilia de enzimas glucolíticas, que se sugieren asociadas a la reducción de movilidad espermática y viabilidad en el proceso de congelación y descongelación, ya que estas enzimas desempeñan un papel principal en las vías metabólicas, como la gluconeogénesis y la glucólisis (Xin et al. 2018).

Otras causas que se reportan como causas de la disminución de la movilidad del semen descongelado, es el criodaño sobre las proteínas citoesqueléticas, como la dineína y la tubulina, que actúan en la movilidad celular (Nynca et al. 2015). Se ha encontrado que las proteínas del citoesqueleto son muy sensibles a los choques térmicos durante el proceso de congelación y descongelación (Xin et al., 2020).

Los resultados del presente estudio permiten sugerir que la solución crioprotectora compuesta por EG 6%, glucosa al 6% y leche en polvo descremada al 3% es una alternativa viable para la crioconservación de semen de bocachico. Concentraciones de LP mayores a 3% pueden tener efecto negativo sobre el espermatozoide de Prochilodus magdalenae, causándole disminución de su capacidad fertilizante.