biote Revista Colombiana de Biotecnología Rev. colomb. biotecnol 0123-3475 Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia 00005 Artículos cortos Evaluación del cultivo in vitro de una cepa mexicana de Ganoderma lucidum Evaluation of in vitro cultivation of a Mexican strain of Ganoderma lucidum 0000-0003-0838-518X Hernández-Rosas Julio César * 0000-0001-8129-5135 Sánchez Meraz José Alfredo ** M.C. en Agroecosistemas Tropicales. Instituto de Tecnología de los Alimentos, Universidad de la Cañada, carretera Teotitlán - San Antonio Nanahuatipán Km 1.7 s/n. Paraje Titlacuatitla, Teotitlán de Flores Magón, Oax. México. https://orcid.org/0000-0003-0838-518X, juliocesar@unca.edu.mx. Universidad de la Cañada Universidad de la Cañada Mexico juliocesar@unca.edu.mx Dr. en Ganadería. Instituto de Tecnología de los Alimentos, Universidad de la Cañada, carretera Teotitlán - San Antonio Nanahuatipán Km 1.7 s/n. Paraje Titlacuatitla, Teotitlán de Flores Magón, Oax. México. https://orcid.org/0000-0001-8129-5135, jasanchez@unca.edu.mx. Universidad de la Cañada Universidad de la Cañada Mexico jasanchez@unca.edu.mx 17 02 2022 Jul-Dec 2021 23 2 36 40 08 06 2021 20 12 2021 Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons RESUMEN

La cepa mexicana CP-145 de Ganoderma lucidum debido a la importancia medicinal que ha presentado últimamente, la presente investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto de la temperatura y medio de cultivo sobre el crecimiento micelial óptimo en diferentes rangos de pH. Los tratamientos correspondieron en la utilización del medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) y extracto de malta agar (EMA), con dos niveles de temperatura (25 y 28 °C) y seis rangos de pH (4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 y 6.5). El diseño experimental fue completamente al azar con medidas repetidas a través del tiempo, analizados con el paquete REPEATED MEASURE y el efecto tiempo con PROC MIXED de SAS. Como resultado se obtuvieron que el efecto de la temperatura y medios de cultivo en los diferentes rangos de pH, presentaron diferencias significativas (P ≤ 0.05). El crecimiento micelial óptimo de la cepa mexicana de G. lucidum fue en el medio de cultivo EMA en los rangos de pH de 4.0 y 4.5 con 8.3 y 8.2 cm respectivamente. De igual forma, en los rangos de pH 4.0 y 4.5 se obtuvieron los crecimientos miceliales óptimos a temperatura de 25 °C con 8.1 y 8.0 cm respectivamente. El cual concluyó esta investigación que el crecimiento micelial óptimo de la cepa mexicana fueron a pH 4.0 y 4.5, temperatura de 25 °C y medio de cultivo EMA.

 ABSTRACT

The Mexican strain CP-145 of Ganoderma lucidum due to the medicinal importance it has presented lately, the present investigation had as objective to evaluate the effect of temperature and culture medium on the optimal mycelial growth in different pH ranges. The treatments corresponded to the use of potato dextrose agar (PDA) and malt extract agar (EMA), with two temperature levels (25 and 28 °C) and six pH ranges (4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 5.5, 6.0 and 6.5). The experimental design was completely randomised with repeated measures over time, analysed with the REPEATED MEASURE package and the time effect with PROC MIXED of SAS. As a result, the effect of temperature and culture media in the different pH ranges showed significant differences (P ≤ 0.05). The optimal mycelial growth of the Mexican strain of G. lucidum was in the EMA culture medium in the pH ranges of 4.0 and 4.5 with 8.3 and 8.2 cm respectively. Similarly, in the pH ranges 4.0 and 4.5 the optimum mycelial growth was obtained at 25 °C with 8.1 and 8.0 cm respectively. This research concluded that the optimal mycelial growth of the Mexican strain was at pH 4.0 and 4.5, temperature of 25 °C and EMA culture medium.

 Palabras clave: crecimiento micelial medio de cultivo temperatura Key words: mycelial growth culture medium temperature INTRODUCCIÓN

El género Ganoderma, pertenecen al Phylum Basidiomycota, Orden Aphyllophorales y Familia Ganodermataceae (Alexopoulos et al., 1996). G. lucidum por las propiedades medicinales que le atribuyen a nivel mundial, ha sido aislada y preservada en medios de cultivo comerciales para la obtención de crecimientos miceliales óptimos (Stamets 1993; Biley et al., 2000; Singh, 2007). Investigaciones por Jayasinghe et al. (2008), evaluaron cepas silvestres coreanas de G. lucidum en medio PDA por 10 días, obteniendo el rango de pH 5 a 9 con 87.0 a 66.7 mm de diámetro a temperaturas de 25 y 30 °C respectivamente y en medios de cultivo glucosa-peptona, extracto de levadura-malta, medio completo, PDA, Lilly y Hamada obtuvieron crecimientos miceliales favorables 87.0 mm de diámetro promedio. Veena y Pandey (2011), determinaron que el aislamiento óptimo de una cepa hindú de G. lucidum fue en medio de cultivo EMA en pH 4.0 a 6.5 y una temperatura de 30 °C. Pooja-Kapoor y Sharma (2014), evaluaron diferentes cepas de G. lucidum en medio EMA por 7 días se obtuvieron a pH 5.0 y temperaturas de 25 y 30 °C con 83.0 y 85.0 mm de diámetro respectivamente y 173.33 mg de biomasa. Investigaciones realizadas por Rolim et al. (2014), indican que las cepas brasileñas de G. lucidum en PDA no mostró variaciones en el crecimiento micelial en rangos de pH 4.0 a 8.0, no obstante, si requiere una temperatura de 28 °C. En cuanto a Singh et al. (2015), al evaluar el efecto de la temperatura y pH de G. lucidum en medio PDA a 12 días de incubación, encontraron que el máximo crecimiento micelial fue de 4.5 cm de diámetro con pH 5.5 y temperatura de 30 °C. No obstante, Joshi y Sagar (2016) encontraron que el mejor medio cultivo fue extracto de malta agar (EMA) con crecimiento de 81.0 mm de diámetro a 25 °C, en comparación con otros medios de cultivo comerciales. Shilpi Rawat (2018) evaluó diferentes factores para el crecimiento micelial óptimo de G. lucidum y obtuvo como resultado que el medio de cultivo favorable fue EMA y PDA con 7.64 y 5.64 cm, temperatura de 25 y 20 °C con 8.72 y 7.34 cm y pH 5.0 y 6.0 con 7.45 y 7.75 cm de diámetro respectivamente. Ian et al. (2019), se basaron en identificar una cepa fúngica eficaz y versátil para la bioingeniería de micelios, lo cual obtuvieron para G. lucidum que a 22 °C en medio de cultivo PDA fue 9.03 cm de diámetro y en medios PDA y SDA a temperaturas de 30 y 37 °C los crecimientos miceliales fueron solo de 1 cm de diámetro, concluyendo que el efecto temperatura influyó en el crecimiento micelial. Nguyen et al. (2019), investigaron las condiciones óptimas del crecimiento micelial y obtención de cuerpos fructíferos de la cepa GA3 Ling Zhi de G. lucidum, obteniendo el mejor crecimiento micelial de 83.68 mm y tasa de crecimiento de 9.29 mm/día con el tratamiento PGA suplementado con extracto de salvado de arroz, la temperatura óptima fue 30 °C con 90.0 mm y conforme disminuía el crecimiento micelial también, en cuanto al pH no generó efecto al crecimiento micelial siendo superiores a 80.0 mm en el rango 4 hasta 12 durante los 9 días de incubación. Cortina-Escribano et al. (2020), evaluaron el efecto del crecimiento micelial de cepas de G. lucidum sobre diferentes sustratos maderables y medios de cultivo y obtuvieron que en los medios de cultivo EMA y PDA presentaron los mejores crecimientos miceliales con 8.5 cm de diámetro a 25 °C después de 24 días. Los estudios previos realizados a nivel mundial con cepas de G. lucidum, indican diferentes comportamientos de crecimiento micelial bajo condiciones similares de pH, temperatura y medio de cultivo. Es este contexto, la cepa mexicana CP-145 de G. lucidum, han reportado que su cuerpo fructífero tiene gran potencial en la salud humana por los metabolitos secundarios generados, los efectos prebióticos, la acción hipercolesterolemia y ha sido utilizado como primer caso clínico en México con una paciente diabética tipo 2 (Meneses et al., 2016; Martínez-Carrera et al., 2016). Es por ello, que la presente investigación planteó como objetivo evaluar el efecto de la temperatura y medio de cultivo sobre el crecimiento micelial en diferentes rangos de pH de una cepa mexicana de G. lucidum.

MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico

La cepa Ganoderma lucidum fue aislada por el Colegio de Postgraduados, Campus Puebla, México por tejido de un basidioma colectado en un árbol muerto en el estado de Morelos, México a 2300 m de altitud. La cepa evaluada en el presente estudio, se encuentra depositada en el Cepario de Hongos del Colegio de Postgraduados, Campus Puebla, México, con el registro CP-145 (Meneses et al., 2016). Ésta se mantuvo en medio papa dextrosa agar (PDA) (Bioxon®) a 28 °C por 7 días.

 Medios de cultivo

Para determinar el crecimiento micelial de G. lucidum, se cortó con un horadador de corcho 5 mm de diámetro de micelio de las cajas Petri mantenidas en medio PDA a 28 °C por 7 días. Primero se colocaron 25 mL de medio PDA o extracto de malta agar (EMA) (Difco ®) fundido en cada caja Petri estéril de 9 cm de diámetro. Los medios PDA y EMA previamente fueron ajustados a pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 y 6.5 con la adición de HCl o NaOH a 1M (Amin et al., 2011). Una vez solidificado los medios en condiciones de esterilidad, se inocularon colocando al centro de cada caja Petri los implantes de 5 mm de diámetro (Jayasingue et al., 2008). Las cajas inoculadas fueron incubadas a 25 o 28 °C por 12 días en condiciones de oscuridad. Se realizaron 3 réplicas por temperatura, a diferentes niveles de pH y medio de cultivo. Durante el período de incubación, se midió el diámetro de crecimiento micelial (cm) cada tres días; para ello se trazaron 2 ejes cartesianos sobre la tapa de la caja Petri, tomando como inserción el centro del implante (Gaitán-Hernández, 2005). Se determinó el diámetro micelial (cm) y la tasa de crecimiento micelial (cm/día) se determinó de acuerdo a Nguyen et al. (2019), empleando el diseño experimental completamente al azar, analizados con REPEATED MEASURE y el efecto tiempo con PROC MIXED de SAS.

 RESULTADOS Y DISCUSIÓN <bold>Crecimiento micelial óptimo de <italic>G. lucidum</italic> </bold>

El crecimiento micelial óptimo por la cepa mexicana de G. lucidum en los diferentes medios de cultivo, temperaturas y niveles de pH a los 12 días de incubación presentaron diferencias significativas (P≤0.05) y se muestran en el Cuadro 1 y 2. El efecto del pH de la cepa mexicana si influye, siendo específico en 4.0 y 4.5, el cual difiere con el resto de las cepas de estudio. En cuanto al efecto del medio de cultivo para la cepa CP-145 de G. lucidum mostró que en EMA con pH 4.0 y 4.5 fueron los crecimientos miceliales óptimos con 8.325 y 8.267 cm respectivamente a los 12 días. Por lo tanto, los resultados obtenidos por Veena y Pandey (2011), Pooja-Kapoor y Sharma (2014), Shilpi Rawat (2018) concuerda con lo obtenido por la cepa mexicana siendo el efecto del medio de cultivo favorable para el crecimiento micelial.

Efecto de los medios de cultivo en los diferentes niveles de pH sobre el crecimiento micelial (diámetro en cm) y tasa de crecimiento (cm/día) de <italic>G. lucidum</italic> en medio PDA y EMA.
Días
pH Medios de cultivo 3 6 9 12 Tasa de crecimiento
4.0 PDA

1.421uv

1.605u

3.448pqr

4.590no

5.197jkl

7.314bc

6.955cd

8.325a

0.551
EMA 0.701
4.5 PDA

1.445uv

1.513uv

3.780p

3.757p

5.147jkl

6.804def

6.855def

8.267a

0.563
EMA 0.643
5.0 PDA

1.285uv

1.406uv

3.491pq

3.470pqr

4.698mno

5.497ij

6.333gh

7.640b

0.515
EMA 0.573
5.5 PDA

1.285uv

1.540uv

3.100rst

3.185qrs

4.439o

5.584i

6.490fg

6.889de

0.494
EMA 0.559
6.0 PDA

1.198v

1.379uv

3.142qrs

2.742t

4.836lmn

5.322ijk

6.033h

6.362gh

0.490
EMA 0.509
6.5 PDA

1.244uv

1.512uv

3.299qr

2.849st

5.002klm

4.762mno

6.057h

6.532efg

0.503
EMA 0.513

Error estándar 0.0364

Medias con diferente literal son significativamente diferentes (P ≤ 0.05)

PDA = Papa dextrosa agar; EMA = Extracto de malta agar.

2. Efecto de la temperatura en los diferentes niveles de pH sobre el crecimiento micelial (diámetro en cm) y tasa de crecimiento (cm/día) de <italic>G. lucidum</italic> en medio PDA y EMA.
Días
pH Temperatura 3 6 9 12 Tasa de crecimiento
4.0 25 °C

1.549rs

1.477rs

4.575kl

3.462no

7.422b

5.090ij

8.129a

7.151bcd

0.695
28 °C 0.557
4.5 25 °C

1.494rs

1.464rs

3.737mn

3.801mn

6.761e

5.190hij

8.034a

7.087bcde

0.635
28 °C 0.572
5.0 25 °C

1.367rst

1.324rst

3.675mn

3.286o

5.292ghi

4.904jk

7.052bcde

6.921de

0.561
28 °C 0.527
5.5 25 °C

1.222st

1.603r

2.579p

3.706mn

4.935ijk

5.087ij

6.332f

7.046cde

0.478
28 °C 0.576
6.0 25 °C

1.087t

1.490rs

2.179q

3.705mn

4.510l

5.649g

5.004ij

7.391bc

0.410
28 °C 0.589
6.5 25 °C

1.228st

1.528rs

2.294pq

3.854m

4.264l

5.500gh

5.466gh

7.124bcde

0.430
28 °C 0.589

Error estándar 0.0364

Medias con diferente literal son significativamente diferentes (P ≤ 0.05)

En cuanto al efecto de la temperatura, el crecimiento micelial óptimo de la cepa CP-145 de G. lucidum, fue a 25 °C en los pH 4.0 y 4.5 con 8.129 y 8.034 cm y tasas de crecimiento micelial de 0.695 y 0.635 cm respectivamente. Con base en los resultados de temperatura a 25 °C de la cepa mexicana, concuerda con los autores Jayasinghe et al. (2008), Joshi y Sagar (2016), Shilpi Rawat (2018) y Cortina-Escribano et al. (2020), pero bajo otras condiciones establecidas.

 CONCLUSIONES

Se concluye que la cepa mexicana CP-145 de G. lucidum se estableció bajo las condiciones de pH 4.0 y 4.5, temperatura de 25 °C y medio de cultivo EMA para su crecimiento micelial. Por lo tanto, la tasa de crecimiento micelial obtenida es inferior a los reportado por otros autores. Por lo tanto, se recomienda establecer medios de cultivo suplementados con pH ácidos para obtener crecimientos miceliales óptimos y similares a otras cepas G. lucidum.

 Agradecimientos

Los autores agradecen al Centro de Recursos Genéticos de Hongos Comestibles, Funcionales y Medicinales (CREGEN-HCFM) del Colegio de Postgraduados Campus Puebla, México por la donación de la cepa 145 de Ganoderma lucidum.

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