Colombia es un país que posee una gran diversidad de ecosistemas y microclimas, lo cual hace que su vegetación sea muy variada, enriquecida con especies endémicas y diversidad genética muy alta. Algunas de las plantas que se pueden encontrar poseen aceites esenciales con principios activos que han demostrado actividad biológica o industrial, con amplias perspectivas para llevar a cabo la investigación y el desarrollo de nuevos productos ^1-4.

El término "aceite esencial" (AE) es utilizado para referirse a sustancias líquidas, volátiles, de carácter lipofílico y con propiedades aromáticas. Estas sustancias son sintetizadas por las plantas como metabolitos secundarios y pueden ser extraídas mediante métodos físicos como la destilación a vapor o hidrodestilación ^5-7. Los AE tienen un papel importante en la protección de las plantas, pues actúan como agentes antibacterianos, antivirales, antifúngicos e insecticidas ^8-17. Poseen una composición química compleja que consiste en una mezcla de sustancias orgánicas como hidrocarburos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, etc. ^12,18. Algunos aceites esenciales se extraen de las células localizadas en el flavedo (parte externa coloreada de la cáscara) de los frutos cítricos ^{3,12,13,19-24}.

Los cítricos pertenecen a la clase Angiospermae, a la subclase dicotiledónea, a la orden rutae, a la familia rutaceae, cuyos frutos o frutas poseen un alto contenido en vitamina C y ácido cítrico y al género Citrus, y dentro de ellos se conocen las siguientes especies: naranja (Citrus sinensis), mandarina (Citrus reticulata), limón (Citrus aurantifolia), pomelo (Citrusparadisi) ^12,13,14-19. El origen del género Citrus se sitúa en el sureste de Asia y el centro de China, Filipinas y el archipiélago indomalayo hasta Nueva Guinea. Las primeras variedades e híbridos de cítricos son el resultado de un largo proceso de identificación, colecta y reproducción de plantas silvestres ^19-24.

Los cítricos son cultivos permanentes y, en general, tienen alta adaptabilidad a diversas condiciones climáticas, facilitando su cultivo en un gran número de países, aunque las regiones productoras por excelencia han sido localizadas en el continente americano y en el occidente del continente europeo ^3,12,13. En especial, la naranja es la fruta más común del género Citrus spp., y la más conocida en el ámbito mundial ^19-23.

El género Citrus, cuyo término común es cítrico, designa las especies de grandes arbustos o arbolillos perennes (entre 5 m y 15 m) de la familia de las rutáceas cuyos frutos poseen un alto contenido en vitamina C y ácido cítrico, el cual les proporciona ese sabor ácido tan característico ^18,25.

En este trabajo, se obtuvieron AE, mediante hidrodestilación (HD) e hidrodestilación asistida por la radiación con microondas (MWHD), de las especies vegetales naranja (Citrus sinensis), limón (Citrus aurantifolia), mandarina (Citrus reticulata), pomelo (Citrusparadisi), cultivadas en el norte del departamento de Bolívar (Colombia); y se determinó la composición química, la sensibilidad antibacteriana y la concentración mínima inhibitoria (CMI) in vitro de los AE frente a cepas ATCC de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli.

Los reactivos y otros materiales se adquirieron a entidades reconocidas. El dimetilsulfóxido (DMSO) se adquirió de JT Baker (Phillipsburg, EEUU). El Caldo Müeller Hinton (caldo MH) y el agar Müeller Hinton (agar MH), se obtuvieron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). La gentamicina sulfato de Biopex SAC (Estándar Secundario Lote: 10C256). Las cepas bacterianas provinieron de la American Type Culture Collection (ATCC): Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Pseudomonasaeruginosa (ATCC 27853) y Escherichia coli (ATCC 25922).

Recolección del material vegetal

El pericarpio de las frutas de naranja (C. sinensis), limón (C. aurantifolia), mandarina (C. reticulata), pomelo (C. paradisi) se recolectó en la ciudad de Cartagena, ubicada en el norte del departamento de Bolívar (10°25'25"N 75°31'31"O), Colombia.

Se tomaron 1000 g de pericarpio por semana, en el período comprendido de abril a mayo del 2016 bajo la supervisión del ingeniero agrónomo Antonio Carlos Bustillo, quien realizó la identificación taxonómica de la especie.

Procesamiento del material vegetal

El pericarpio de las frutas colectadas se lavó con agua desionizada, y se seleccionó las que se encontraban frescas, enteras, sin señales de deterioro. En seguida se trocearon, pesaron y procesaron inmediatamente ⁶.

Procedimientos de extracción del AE

La obtención del AE por HD, se efectuó en un equipo de hidrodestilación del tipo Clevenger 500 g del material vegetal, se introdujeron en el balón de extracción, el cual contenía 500 mL de agua destilada. El tiempo de extracción fue de 3 h.

Por el método MWHD, la obtención se llevó a cabo en un equipo de destilación tipo Clevenger con un reservorio de destilación Dean Stark adaptado a un sistema de calentamiento por radiación de microondas, un horno microondas convencional marca (Samsumg, Estados Unidos), con una potencia del 70%, dentro del cual se colocó un balón de extracción de 4 L con 500 mL de agua destilada y 500 g del material vegetal. El tiempo de extracción fue de 3 h ^4,5.

En ambos casos, los aceites esenciales obtenidos se separaron por decantación e inmediatamente se almacenaron en viales ámbar a 4 °C hasta la realización de los respectivos análisis. Los rendimientos en la extracción se evaluaron por triplicado a tiempos de 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 y 180 min, operando siempre bajo las mismas condiciones ^4,5,26,27, según la ecuación (1):

Donde, W_AE es el peso (g) obtenido del aceite esencial y W_MV corresponde al peso en gramos (g) del material vegetal fresco.

Análisis del AE por cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM)

Se empleó un equipo CG/EM 7890A/5975C Agilent (Estados Unidos) en interfase con un detector selectivo de masas HP5973 Network conectado en línea con un sistema HP-MS ChemStation y la base de datos NIST-2008. Las condiciones de operación fueron las siguientes: columna capilar HP-5MS (5% phenyl methyl silox, 30 m x 250 µm x 0,25 µm), temperatura inicial 45 °C, temperatura de la línea de transferencia de 280 °C y volumen de inyección 1,0 µL en modo split (20:1), con temperatura del inyector de 250 °C ⁵. La detección de los compuestos se realizó por comparación del espectro de masas, en cada tiempo de retención, con los reportados en la base de datos NIST-2008 ^4,6.

Actividad antibacteriana in vitro

Los inóculos bacterianos se prepararon de acuerdo con las indicaciones establecidas por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI, por sus siglas en inglés) ²⁸, se tomaron entre 3 y 4 colonias bien diferenciadas y morfológicamente similares de las bacterias previamente sembradas en placas de Petri con agar MH, luego aquellas se suspendieron en tubos de ensayo con caldo MH estéril, se incubaron a 35 ± 2 °C y se verificó constantemente la densidad óptica (DO) a 620 nm en lector de microplacas (Multiscan EX Thermo^®), hasta que la suspensión bacteriana alcanzó una DO₆₂₀ entre 0,08 - 0,1 unidades, lo que equivale a 0,5 en la escala de McFarland (1 x 10⁸ UFC/mL), la cual fue diluida a in de obtener una suspensión de trabajo de 5 x 10⁵ UFC/mL en los ensayos biológicos ^29-33. A fin de determinar la fase de crecimiento exponencial de las bacterias y, de manera consecuente, el tiempo de incubación de estas, se realizaron curvas de crecimiento de las cepas en estudio. Para ello, 0,1 mL del inóculo diluido se adicionó a 9,9 mL de caldo MH e incubado a 35 ± 2 °C y se verificó la DO₆₂₀ de la suspensión bacteriana en un lector de microplacas ³³. Se utilizó dimetilsulfóxido al 1% (DMSO) para disolver el extracto obtenido; este se emplea con frecuencia en estudios microbiológicos ^9,34,35. Posteriormente, el DMSO al 1% y el extracto disuelto se incubaron en placas de 96 pocillos a 35 ± 2 °C por el tiempo definido para cada bacteria en las curvas de crecimiento; transcurrido este tiempo, se determinó los porcentajes de viabilidad frente al blanco de máximo crecimiento (caldo con inóculo). Para la evaluación de la actividad antibacteriana, se prepararon soluciones concentradas de 1000 µg/mL de los aceites esenciales, según el criterio de autores que consideran como promisorios aquellos extractos vegetales que presenten valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) inferior a 1000 µg/mL ¹⁰. Esta solución se incubó con las suspensiones bacterianas durante el tiempo definido para cada bacteria en las curvas de crecimiento, a 35 ± 2 °C, utilizando gentamicina sulfato (0,016 mg/mL) como control positivo de actividad antibacteriana. Transcurrido este tiempo, las placas se agitaron durante 5 min a 100 rpm, se determinó la DO₆₂₀ en lector de microplacas y se estimó la viabilidad por comparación frente al blanco de máximo crecimiento.

Concentración mínima inhibitoria (CMI)

Se determinó la CMI de aquellos aceites esenciales que presentaron porcentajes de inhibición superiores al 90%, siguiendo lo establecido por el CLSI con algunas modificaciones. Brevemente, 50 µL de las suspensiones de las cepas bacterianas en estudio se incubaron, por el período de tiempo definido para cada bacteria en las curvas de crecimiento bacteriano, a 35 ± 2 °C, en placas de 96 pocillos, con 50 µL de concentraciones seriadas entre 50 y 1000 µg/mL del extracto evaluado. Las placas se sellaron durante el período de incubación para reducir la evaporación; al finalizar este tiempo, se agitaron a 100 rpm durante 5 min y se determinó la DO620 en lector de microplacas. La CMI se calculó como la mínima concentración del extracto o fracción que inhibe completamente el crecimiento bacteriano y se expresó en µg/mL ^29-32.

Concentración mínima bactericida (CMB)

Para determinar la concentración del aceite esencial que mostró completa inhibición del crecimiento bacteriano, en el ensayo de determinación de la CMI, se tomó un inóculo con un asa estéril y se hizo un subcultivo en placas de Petri con agar MH. Las placas inoculadas se incubaron a 35 ± 2 °C durante el tiempo adecuado para cada bacteria, luego del cual se evaluó si había crecimiento de colonias bacterianas. La CMB se calculó como la mínima concentración del compuesto que no permite el crecimiento visible de colonias en la placa de Petri. En caso de observarse crecimiento, se concluye que esa concentración del extracto o fracción produce un efecto bacteriostático ¹¹.

Análisis estadístico

Los resultados correspondientes a tres ensayos independientes se expresaron como el promedio ± el error estándar de la media (ESM). Para la organización de los datos se empleó la hoja de cálculo MS Excel 2010, y para los análisis estadísticos el paquete GraphPad Prism V5.00 para Windows.

La eficiencia de la extracción de los aceites esenciales de C. sinensis, C. aurantifolia, C. reticulata, C. paradisi se presenta en la figura 1.

Figura 1

La identificación de los componentes, los tiempos de retención y los porcentajes de abundancia son reportados en la tabla 1. Los monoterpenos son los metabolitos volátiles con mayor abundancia en los AE. El compuesto mayoritario encontrado es el limoneno para ambos métodos "HD y MWHD" en todas las muestras evaluadas.

Tabla 1

* Tiempo de retención (t_R) y abundancia relativa (%) de los aceites esenciales, identificados por comparación con espectro de masas de referencia de la base de datos NIST - 2008. ** Todos los resultados presentaron diferencias estadísticas significativas a un nivel de confianza (P < 0,05).

Los ensayos de crecimiento revelaron que las cepas de S. aureus, S. epidermidis, K. pneumoniae, P. aeruginosa y E. coli alcanzaron la mayor DO620 a las 20 h; por tanto, estos fueron los tiempos de punto final de incubación en los bioensayos de actividad antibacteriana. Para disolver los aceites esenciales evaluados en DMSO al 1%, primero se evaluó el crecimiento bacteriano y se demostró que este disolvente no inhibió la viabilidad de ninguna de las cepas; por consiguiente, se eligió utilizar un sistema caldo: DMSO en proporción 99:1. Los resultados de la evaluación de la sensibilidad antibacteriana de los aceites esenciales de C. sinensis, C. paradisi, C. aurantifolia y C. reticulata obtenidos por el método de hidrodestilación por arrastre de vapor (HD) e hidrodestilación asistida por microondas (MWHD) (tabla 1), permitieron identificar los extractos capaces de inhibir el crecimiento de las cepas bacterianas, tomando como criterio de selección, aquellos que fueron capaces de inhibir en más de 90% a las tres cepas (tabla 2). Por tanto, se le determinó la CMI y CMB.

Tabla 2

*Aceites esenciales que inhibieron más de 90% a las cinco cepas. Los valores corresponden a la media de tres ensayos independientes ± desviación estándar.

La CMI se determina con la utilización de caldo inoculado y estandarizado, al que se le adicionan soluciones del aceite esencial a diferentes concentraciones, provocando una dilución. Los valores se presentan en la tabla 3.

Tabla 3

Por su parte, los resultados de la CMB para los aceites esenciales sugieren que a esas concentraciones su actividad se debe a efectos de tipo bacteriostático y no bactericida (tabla 3).

Las plantas aromáticas son fuente de aceites esenciales, productos de alto valor agregado, empleados diariamente como aditivos alimenticios y fragancias, entre otros ^2-5. El uso de estas plantas, a lo largo de la historia, ha conducido a la búsqueda de métodos de extracción de aceites esenciales que ofrezcan ventajas tanto en la eficiencia de extracción como en la calidad del aceite obtenido ^6,8-11. Teniendo en cuenta que la composición química está influenciada por diversos factores, como la temperatura, altitud, condiciones de cultivo, suelo origen y edad de la planta, así como por cambios de tipo genético ⁶.

Los rendimientos de AE más altos se alcanzaron en las especies de pomelo y mandarina caracterizado por el alto contenido de limoneno. Se encontraron diferencias estadísticas significativas para el rendimiento según el método de extracción empleado. Estos resultados indican que la técnica MWHD mostró ser el método más efectivo en la extracción de los aceites esenciales ^36,37. Esto es debido a la acción de las microondas sobre las paredes glandulares que contiene el aceite esencial, lo cual hace que el material vegetal se rompa más rápido y eficientemente ²⁶. La hidrodestilación asistida por microondas utiliza tres formas de transferencia de calor dentro de la muestra: la irradiación, conducción y convección. Como resultado, produce calor con mayor rapidez dentro y fuera de las glándulas. Con la HD esta transferencia de calor solo puede ocurrir por conducción y convección, lo que la hace menos efectiva ^6,37.

De igual manera, la técnica de MWHD presenta ventajas destacables en comparación con HD en cuanto a disminución de tiempo y uso de solvente (agua), calentamiento efectivo y tamaño de equipo reducido. Sin embargo, la HD es un método sencillo, reproducible, económico y, sobre todo, ampliamente utilizado en la industria ^{6,26,27,36,37}.

En los aceites estudiados, la fracción monoterpénica es la más abundante. El limoneno es el monoterpeno presente en mayor proporción (72,11% y 93,55%, abundancia relativa, tabla 1). El AE de C. reticulata mostró un mayor porcentaje, seguido de C. sinensis y C. paradisi; estos resultados son comparables con los reportados entre 76% y 96% para los AE cítricos ^19-24. Entre los monoterpenos detectados en mayor proporción que le siguen al limoneno son el /β-mirceno y el linalool, los cuales se encuentran dentro de lo reportado por la literatura para aceites esenciales de cítricos ²².

Cabe resaltar que los aceites esenciales mostraron un mayor efecto inhibitorio frente a cepas Gram-negativas. Este comportamiento particular frente a un grupo de cepas, probablemente se debe a que la pared celular de las bacterias Gram-positivas estudiadas está compuesta básicamente por peptidoglicano que representa hasta el 90% de la pared, ácidos teicoicos que también suelen estar presentes en pequeñas cantidades y polisacáridos; mientras que la pared celular de las Gram-negativas está constituida solo por el 10% del peptidoglicano, además posee tres polímeros que se encuentran fuera de su envoltura: lipoproteína, membrana externa y lipopolisacáridos, este último con un contenido de lípido A que pudiera favorecer la entrada, por disolución de los aceites esenciales debido a su carácter hidrofóbico y provocar la muerte celular por desestabilización de la membrana externa y la membrana plasmática. Este lípido A no está presente en las bacterias Gram-positivas y esta sería una causa probable del efecto del aceite en los diferentes grupos bacterianos, donde las bacterias Gram-negativas son relativamente más sensibles ²². El carácter hidrofóbico de los AE le permite atravesar la pared celular de bacterias Gram-negativas a través de canales compuestos por unas proteínas llamadas porinas, las cuales se encuentran en la membrana externa y facilitan el transporte de nutrientes y sustancias de bajo peso molecular dentro de la célula, incluyendo agentes antimicrobianos ^12,19,22.

Los componentes de los aceites esenciales podrían ejercer actividad antibacteriana por interferir en la bicapa de fosfolípidos de la membrana celular causando el incremento de su permeabilidad y pérdida de los constituyentes celulares, dado que destruye el sistema de enzimas incluyendo las que implican la producción de energía celular (fuerza motriz de protones) y de respiración bacteriana, cuando se trata de concentraciones bajas de los aceites esenciales; mientras que a altas concentraciones provocarían daños severos de los componentes estructurales de la célula bacteriana, como la pérdida de homeóstasis o inactivando o destruyendo el material genético, dando lugar a la muerte celular. En el mecanismo de acción de los aceites esenciales como agentes antibacterianos, se debe considerar el gran número de compuestos químicos que se encuentran presentes en estos, cuyas actividades antibacterianas no presentan un mecanismo específico ^12,19,22.

En función a los resultados obtenidos, concluimos que las diferentes especies del género Citrus son consideradas como promisorias para el control del componente bacteriano. El rendimiento de los aceites esenciales es dependiente del método de extracción utilizado para su obtención. Desde el punto de vista de la química, los aceites esenciales contienen mayoritariamente monoterpenos, siendo el limoneno el que se encuentra con un mayor porcentaje de abundancia relativa. Se destaca que el proceso de hidrodestilación asistida por radiación con microondas es considerado un método rápido, eficiente, verde y relativamente económico en comparación con la hidrodestilación convencional.