La contaminación microbiana en los productos farmacéuticos y cosméticos puede afectar significativamente la calidad y el rendimiento del producto debido a la alteración de las propiedades fisicoquímicas, de vida útil y funcionalidad ^[1]. Una amplia gama de preservantes son utilizados para contrarrestar este tipo de inestabilidades, los cuales evitan la descomposición de productos terminados al inhibir el crecimiento de bacterias y hongos ^[2].

El ácido benzoico (ver figura 1) es empleado como preservante de alimentos, cosméticos y productos farmacéuticos presentando una actividad antimicrobiana máxima en valores de pH entre 2,5 y 4,5. A pesar de ser considerado como una sustancia inocua, se han reportados posibles efectos toxicológicos como la generación de urticaria, eritema, escozor, asma e irritación cuando se aplica tópicamente ^[3], razón por la cual se deben evaluar estrategias que mejoren su perfil de seguridad. Una de las alternativas reportadas para optimizar las características funcionales y de seguridad de los preservantes de carácter ácido, como lo es el benzoico, es la formación de complejos polielectrolíticos, los cuales se generan por medio de las interacciones iónicas de las moléculas involucradas ^[4].

Figura 1

En el presente estudio se emplearon dos complejos polielectrolíticos con el ácido benzoico representados como: EuB ₇₅ Cl ₂₅ y EuB ₁₀₀ , donde Eu corresponde al polielectrolito Eudragit E100, B al ión benzoato y Cl al ión cloruro que actúan como contraiones. Los subíndices indican el porcentaje en el que cada contraión está neutralizando al polímero. El Eudragit El00 (Eu) es un polímero catiónico preparado por copolimerización de metacrilato de butilo, metacrilato de 2-dimetilaminoetilo y metacrilato de metilo con una relación molar de 1:2:1 (ver figura 2) ^[5]. Su peso molecular es de 47.000g/mol y es ampliamente utilizado en formulaciones tópicas y orales, donde generalmente se considera no tóxico, no irritante, y esencialmente seguro en humanos ^[6]. La formación de este tipo de complejos generan cambios en propiedades fisicoquímicas e incluso de actividad y seguridad, que como se mencionó pueden ofrecer ventajas frente a las propiedades de las moléculas precursoras. La evaluación de la seguridad de moléculas y productos de aplicación tópica y en este caso de los complejos, puede ser valorada por medio de ensayos in vitro en celdas de Franz, considerado como uno de los principales métodos para determinar la penetración transepitelial ^[7].

Figura 2

Las celdas de Franz tienen dos compartimentos separados por una membrana sintética o natural (piel), uno donor y otro receptor en el que se muestrea periódicamente para evaluar la cantidad de compuesto que ha penetrado a través del tejido en el tiempo ^[8]. La estructura de la piel difiere de una especie a otra, sin embargo, el reemplazo de la piel humana por piel animal es aceptable para estos estudios, ya que esta última se encuentra sujeta a consideraciones éticas nacionales e internacionales y no siempre es accesible ^[8]. La piel de cerdo es apropiada como reemplazo de la piel humana debido a similitudes morfológicas y funcionales, demostrando una correlación eficiente (r) de 0,88 (p <0,0001) como sustituto en los estudios de penetración in vitro, siendo la oreja de cerdo una de las partes más apropiadas como reemplazo al presentar espesores similares en las capas de la piel ^[9].

Se pueden preparar membranas de diferente espesor para experimentos in vitro, sin embargo, para cortes efectuados con dermatomo son utilizados valores entre 400-700 μm ^[10]. Como medio receptor se emplean soluciones salinas ajustadas a pH 7,4; simulando las condiciones del fluido biológico en términos de pH y fuerza iónica, debido a la temperatura superficial de la piel el medio receptor se debe mantener a 32 °C y, también, se debe garantizar que la cantidad máxima de la sustancia no exceda entre el 10 % y 20 % del valor de su solubilidad total en el medio (condiciones sink) ^[11].

Las metodologías analíticas, empleadas para la cuantificación de moléculas en estudios con muestras biológicas, pueden influir en la evaluación e interpretación de los datos obtenidos, por ello es esencial emplear métodos analíticos bien caracterizados y validados para obtener resultados fiables que se puede interpretar adecuadamente. En la literatura se han reportado diferentes metodologías analíticas para la determinación del ácido benzoico en productos farmacéuticos y muestras biológicas ^[14,15], sin embargo, a la fecha no existe una metodología específica para evaluar este compuesto, que se encuentra complejado y que entra en contacto con piel porcina.

Considerando lo anterior, en este trabajo se realizó la validación de una metodología analítica por HPLC-DAD para la cuantificación de ácido benzoico a partir de complejos polielectrolíticos, con el propósito de obtener resultados confiables y apropiados para la interpretación adecuada del perfil de permeación y seguridad del ácido benzoico incluido en los respectivos complejos (EuB ₇₅ Cl ₂₅ y EuB₁₀₀).

En el análisis cromatográfico para comprobar la idoneidad del sistema se consideraron los siguientes parámetros: factor de asimetría, número de platos teóricos, factor de capacidad y precisión en la inyección (% RSD); de acuerdo con la tabla 1 es posible afirmar que el sistema cumple con los criterios de aceptación y por lo tanto es adecuado para el análisis requerido. Ni la selectividad, ni la resolución fueron factores considerados pues estos parámetros se relacionan con la posición y separación de dos o más compuestos en una mezcla, debido a que las muestras a evaluar no son mezclas y en el cromatograma solo se evidencia un compuesto (ácido benzoico), la determinación de estos no se estableció ^[16].

Tabla 1

El ácido benzoico presentó un tiempo de retención de 3,84 +/- 0,02 min siendo apropiado para la realización de análisis rápidos y de bajo costo sin interferir con la señal de la matriz. Por medio del espectro de absorción molecular (ver figura 3) de una muestra del estándar del ácido benzoico a 6 μg/mL se determinó que la longitud de onda de máxima absorción (λ _max) era de 226 nm, utilizándose este valor para la realización del análisis de las muestras.

Figura 3

Por medio de la comparación de los tiempos de retención de los cromatogramas obtenidos de las muestras de los componentes de la fase móvil (ácido fosfórico al 1% y acetonitrilo), medio de almacenamiento para las orejas de cerdo (NaCl 1M), componentes de los complejos EuB ₇₅ Cl ₂₅ y EuB _m (EudragitE^® 100 y ácido clorhídrico 2,39 M) y de los blancos de matriz de piel porcina sin ácido benzoico, se determinó que no se presentaban interferentes en el tiempo de retención del ácido benzoico, puesto que no se identificó ninguna señal adicional como se observa en la figura 4. Adicionalmente, se verificó que ninguna de las muestras modificaba el EAM y la curva de similitud no se cruzara con la línea umbral, como es lo esperado. Esto indica que tras la comparación del espectro medio del pico con el resto de espectros, a medida que eluye el analito, no se presentan interferentes ya que la relación entre los mismos es 1 (índice de pureza de pico), como puede verse en la figura 5. Por lo tanto, la metodología analítica empleada garantiza la obtención de una señal inequívoca y específica del analito sin ningún interferente.

Figura 4

Figura 5

Por otro lado, en la figura 6 se observan las curvas de calibración para el rango de concentraciones del ácido benzoico para el sistema y método. El rango de concentraciones se seleccionó considerando la ley de Lambert y Beer que establece, con base en el coeficiente de absortividad, el rango de concentraciones en el cual se espera que la curva de calibración sea lineal ^[17]; de esta manera se empleó la mínima concentración posible para cuantificar pequeñas cantidades de ácido benzoico en los ensayos de absorción.

Figura 6

Para evaluar el intercepto, la pendiente y el coeficiente de correlación de las curvas de calibración del sistema y método se plantearon pruebas de hipótesis las cuales fueron analizadas por medio del estadístico t Student (ver tabla 2).

Tabla 2

De acuerdo con los datos obtenidos, se observa que con relación al intercepto se presenta un t estimado para el sistema y método menor al t tabulado, por lo que no se rechaza la hipótesis nula y en consecuencia se puede afirmar que el intercepto con el eje Y no es significativamente diferente de cero. Respecto a las pendientes y coeficientes de correlación para el sistema y método, el t estimado es mayor al t tabulado, por tanto no se acepta la hipótesis nula, obteniendo como resultado que las pendientes son significativamente diferentes de cero y que existe una correlación significativa entre los valores de la concentración de ácido benzoico (eje X) y las áreas obtenidas de los picos de absorción para las concentraciones dadas (eje Y).

Adicionalmente, para evaluar la regresión y la dispersión de los datos entre las réplicas para los diferentes niveles de concentración analizados se empleó el ANOVA y estadístico de Fisher (F) (ver tabla 3). Respecto a la regresión el F_estimado > F_tabulado, por lo tanto, la hipótesis nula (Ho) "la regresión no es significativa" se rechaza, demostrando que la regresión es significativa para el sistema y método. De manera análoga, estadísticamente no hay un desvío significativo de la linealidad ya que el F estimado < F tabulado, por lo tanto la Ho, "el desvío no es significativo", se acepta.

Tabla 3

Considerando los resultados obtenidos en los test realizados, y con base en los parámetros evaluados, es posible afirmar que la metodología analítica garantiza la linealidad del método y del sistema en el rango de concentraciones establecidas.

Como se indicó anteriormente, la repetibilidad (precisión intradía) fue evaluada a través del Test de Cochran (estadístico G); en la tabla 4 se observa que el G _xp < G _aab por lo que no hay diferencia significativa entre las varianzas de los niveles de concentración evaluados. De manera complementaria, los RSDp para la curva de calibración del sistema y del método son ≤ 5% y ≤ 15 %, respectivamente, cumpliendo con las especificaciones establecidas ^[14,15].

Tabla 4

La evaluación de la precisión intermedia (interdía) se determinó a través del ANOVA a tres niveles de concentración (2, 6, 10 (g/mL). Empleando el estadístico F se evidencia que para el sistema y el método el F estimado es menor al F tabulado (ver tabla 5), en todas las fuentes de variación esperadas (analista, día y réplicas), por lo que no existe variación significativa en los resultados obtenidos con analistas y días diferentes.

Tabla 5

Los resultados obtenidos permiten establecer que la metodología analítica es precisa para los diferentes niveles analizados (repetibilidad y precisión intermedia).

Considerando la ecuación de la curva de calibración del sistema, se determinó que el porcentaje de recuperación de la metodología analítica es 98,7%, por lo tanto, cumple con los criterios de aceptación requeridos para la exactitud.

Adicionalmente, el análisis realizado con el estadístico t de Student (ver tabla 6) evidencia que el t estimado < t tabulado, lo cual conlleva a aceptar la Ho y concluir que el porcentaje de recuperación no es significativamente diferente de 100, por lo tanto, la metodología analítica es exacta para la cuantificación del ácido benzoico en la matriz biológica empleada.

Tabla 6

El límite de cuantificación (LOQ) fue de 0,72 y 1,56 μg/mL para el sistema y método respectivamente, el valor del límite de detección (LOD) para el sistema fue de 0,23 μg/mL y de 0,51 μg/mL para el método, por lo que todos los niveles de concentración de la curva de calibración del sistema y método pueden ser cuantificados con exactitud y precisión (ver tabla 7).

Tabla 7

La metodología analítica validada permitió determinar el flujo y el coeficiente de permeación del ácido benzoico, evaluados a través de piel de cerdo en condiciones de dosis infinitas, empleando las celdas de Franz. De manera similar, fue posible cuantificar al ácido benzoico, sólo y complejado, en concentraciones normales de uso (dosis finita), para evaluar si los complejos ofrecen ventaja en términos de seguridad frente al ácido benzoico. Las concentraciones estudiadas estuvieron comprendidas en el rango de concentraciones evaluadas a lo largo de la validación, siendo posible cuantificarlo con precisión, exactitud y especificidad en valores comprendidos alrededor del límite de cuantificación.

Se implementó una metodología analítica por HPLC-DAD para evaluar la permeación in vitro de ácido benzoico a partir de complejos polielectrolíticos a través de piel porcina. Dicha metodología resultó específica, lineal en el rango de concentraciones de 2 a 10 μg/mL, precisa (RSDp ≤ 5 % y ≤ 15% para el sistema y método), exacta con un porcentaje de recuperación de 98,7%, con LOD de 0,23 (g/mL (sistema) y de 0,51 (g/mL (método) y con LOQ de 0,72 y de 1,56 (g/mL para el sistema y método respectivamente.