La síntesis g-CN fue realizada mediante el método de condensación térmica, de acuerdo con lo reportado por Bao et al. y Fang et al. [30, 31]. Se utilizaron como precursores melamina (1,3,5-triazina-2,4,6-triamina) y urea, ambos al 99% de pureza (MERCK). La síntesis del nitruro de carbono a partir de la urea (CN-bulk_u) se llevó a cabo en una mufla donde se sometió a un calentamiento graduado, teniendo como rango de temperatura de 250 y 350 °C hasta que llegó a los 550 °C con una rampa de 2 °C min^-1 por 5 h, esto con la finalidad de asegurar la polimerización. De forma similar la síntesis del nitruro de carbono (CN) a partir de la melamina (CN-bulk_m) se calcinó a 550 °C con una rampa de 3 °C min^-1 por 3 h. Luego de la calcinación, el polvo amarillo que corresponde al nitruro de carbono se lavó con una solución de HNO₃ al 0,1% en peso y agua destilada para eliminar residuos alcalinos provenientes de la pirólisis de, por ejemplo, el amoniaco, tal como Yang et al. lo mencionan [29]. A continuación, podemos mostrar un esquema donde se evidencia lo expresado líneas arriba.

Figura 1

Tabla 1

Sustrato	Temperatura (°C)	Tiempo(h)	Rampa de calentamiento (°C min-1)
Melamina	550	4	3
Urea	250	1	2
	350	2
	500	2

Finalmente, la obtención del material g-CN se llevó a cabo mediante un tratamiento alcalino de acuerdo con lo reportado por Yao et al., donde se utilizó un sistema de reflujo [32]. Para ello, se adicionaron 2 g de CN suspendidos en 100 mL de solución acuosa de NaOH a 0,2 mol L^-1 y la solución se llevó a una temperatura de 100 °C por 11 h. Después de enfriar a temperatura ambiente se lavó con agua ultrapura y se centrifugó a 8000 rpm durante 10 min para retirar el bulk de nitruro que no reaccionó. Los productos coloidales obtenidos se denominan g-CN_u y g-CN_m obtenidas de los CN de bulk_u y bulk_m, respectivamente.

La formación del material en mención se llevó a cabo utilizando relaciones en peso CF/g-CN de 1/1 y 1/5, identificadas como 1CF1g-CN_m y 1CF5g-CN_m, respectivamente. Para la obtención de 1CF1g-CN_m se siguió el método acuoso previamente reportado, con algunas modificaciones [33]. Se disolvieron en agua cantidades adecuadas de FeCl₂.4H₂O y Co(NO₃)₂.6H₂O, se mezclaron y se completaron hasta un volumen final de 250 mL para obtener concentraciones molares de 0,32 y 0,16 mol L-1, respectivamente. Se prepararon 250 mL de solución de KNO3 1,6 mol L^-1, la cual se transfirió a un matraz de 1 L y se añadieron 2,9 g de g-CN_m. El sistema se sonicó en 3 ciclos de 10 min al 30% de potencia. Ambas soluciones se mezclaron en un matraz de tres bocas durante 5 min burbujeando nitrógeno constantemente. Posteriormente se adicionó gota a gota solución de KOH 2 mol L^-1 hasta obtener un pH de 12. El matraz se cerró herméticamente y se realizó un proceso térmico por 24 h a 95 °C. Las partículas se enjuagaron ocho veces con agua destilada utilizando un imán de hierro para separar las partículas. Finalmente, se secó en un horno de convección a 40 °C durante 24 h.

Para la síntesis de 1CF5g-CN_m se realizó el mismo proceso; pero se redujeron a la quinta parte las cantidades de FeCl₂.4H₂O, Co(NO₃)₂.6H₂O y KNO₃, manteniendo la misma masa de g-CN_m, y se redujo, también, la concentración de KOH a 1 mol L^-1. Se toma el producto 1CF5g-CN_m como material para la obtención del compósito final.

Figura 2

Para la formación de las perlas de quitosano se dispersaron 0,2 g de 1CF5g-CN_m en 100 mL de una solución al 2% de quitosano previamente disuelto en ácido acético al 1% (v/v), luego se utilizó un baño ultrasónico por 15 min para la homogenización. Esta dispersión coloidal se adicionó con goteo constante a 500 mL de una solución de NaOH 2 mol L^-1 para la formación de las perlas, las cuales fueron separadas de la solución básica por filtración. Posteriormente, las perlas obtenidas fueron sumergidas en una solución acetona:agua (2:1) que contenía 1 mL de glutaraldehído, con la finalidad de entrecruzar el material polimérico y conferirle mejores propiedades mecánicas.

Para las pruebas de degradación se utilizó una fuente de radiación que consta de dos leds de 10 W (marca CHANZON) con longitud de onda próxima a 420 nm. En cada experimento se tomaron 0,2 g del fotocatalizador y se mezclaron con 250 mL de solución acuosa de 15 ppm de ibuprofeno. Después de agitar durante 30 min hasta alcanzar el equilibrio de adsorción, la solución se irradió bajo luz visible para la degradación fotocatalítica. Durante este proceso, cada hora se tomaron 3 mL de solución hasta culminar las 4 h, y se usó un filtro de membrana de 0,45 щп para obtener una solución clarificada, para luego analizarlo con un espectrofotómetro UV- VIS (UV-1280, SHIMADZU) en la región de longitud de onda de 190320 nm.

Para la evaluación de las propiedades antibacterianas del nanocom-pósito sintetizado, se cultivaron bacterias de E. coli en medio de crecimiento, en un caldo de cultivo (100 mL) a 37 °C durante 16 h con agitación y se recogieron mediante centrifugación (4000 rpm durante 10 min). Después del lavado con una solución de NaCl al 0,9%, las células de E. coli se resuspendieron en una solución salina de NaCl (0,9%) y se obtuvo una densidad celular inicial de 10⁶ UFC mL^-1. Luego se añadieron 0,001 g del fotocatalizador a 10 mL de solución de bacterias (10⁶ UFC mL^-1). La solución mixta se agitó a temperatura ambiente bajo la irradiación de luz visible (420 nm) mediante una lámpara LED. Después de 0, 15, 30, 45 y 60 min de irradiación, se extrajo 0,1 mL de la solución, seguido de dilución en serie con la solución de NaCl (0,9%). Luego, la muestra diluida se diseminó uniformemente en placas Petri con un agar nutritivo y, después de incubar a 37 °C durante 18 h, se determinó el recuento de células viables mediante conteo visual. Todos los experimentos de desinfección fotocatalítica se realizaron por triplicado.

Caracterización de los materiales sintetizados

Para el análisis de DRX se utilizó un difractómetro de rayos X Bruker (Bruker-8Advance, Alemania, 2017). Las condiciones de trabajo del DRX fueron: configuración del generador en 10 mA y 30 kV; tipo de difractómetro: Theta/Theta; material del ánodo: Cu, K-Alpha1 1,54060 Å; y por un lapso de 0,500 s de escaneo.

Se utilizó un espectrofotómetro Perkin Elmer, modelo Alpha, por el método de reflectancia total atenuada (ATR). Por medio de esta caracterización se observaron las bandas características del g-CN para la comparación de los dos precursores (melamina y urea). A su vez, realizamos una comparación del quitosano y el nanocompósito quitosano/1CF5g-CN_m para determinar las interacciones que se forman.

Se utilizó un Microscopio Electrónico de Barrido de Emisión de Campo Hitachi Su8230 (HITACHI, Japón, 2017). Las imágenes se observaron a 3 kV utilizando un WD = 3,3 mm. Se dispersó aproximadamente 1 mg de CF en 25 mL de agua pura utilizando un ultra-sonicador Branson, Ultrasonic Water Bath (EEUU), a 50 Hz durante 10 min. Después de eso, una gota de las partículas dispersas se colocó sobre una cinta de carbón adherida al soporte de aluminio y se dejó secar en un desecador durante 1 h a temperatura ambiente.

En la figura 3 se muestran los difractogramas de CN bulk sintetizado a partir de dos diferentes precursores: melamina y urea (bulk-M y bulk-U respectivamente). En ambos difractogramas (figura 3A) se evidencian los planos de crecimiento (002) y (100) bajo los ángulos de 27,6 y 13,01° respectivamente, que corresponden a planos cristalino-hexagonales [34]. Según Tong et al., los picos con 13 y 27,5° corresponden a unidades de triazina y al apilamiento aromático entre capas respectivamente [34]. En la figura 3B se muestran los difractogramas de g-CN en comparación con el CN bulk_m, de igual forma se evidencia los planos (002) y (100). El pico que corresponde al plano (002), con ángulo de 27,3°, es un reflejo de apilamiento de las capas característico de sistemas aromáticos [29]; además, en la figura 3B se evidencia una disminución en la intensidad del pico en g-CN frente a Bulk-M, lo que demuestra claramente que la exfoliación fue exitosa, hecho que se puede comprobar en la figura 5A, que corresponde a la micrografía SEM.

Figura 3

El difractograma de rayos X del material 1CF5g-CN_m muestra los picos cristalinos de la estructura cúbica centrada en las caras (FCC) de espinela inversa (PDF Card 22-1086). Los principales picos 2θ son: 30,1° (220), 35,4° (311), 43,1° (400), 53,4 (422), 56,9° (511) y 62,5° (440). De acuerdo con la ecuación Debye-Sccherrer el tamaño promedio de la cristalita es de 15 nm, este valor es calculado a partir de la amplitud de la mitad del pico más intenso (311), concordante con el ensanchamiento de la amplitud de los picos cristalinos resultantes, en virtud de que un pico de difracción fino se relaciona a tamaños más grandes de las nanopartículas.

En el espectro de CN sintetizados a partir de melamina y urea (bulk_m y bulk_u) se identificaron bandas entre 1650 a 800 cm^-1 que corresponden a las vibraciones de estiramiento de los enlaces C=N y C-N pertenecientes a anillos heterocíclicos, así como una banda a 804 cm^-1 que se atribuye al modo de vibración de las unidades de triazina que conforman al CN [35, 36]. Aleatoriamente, utilizamos el CN sintetizado a partir de melamina (CN bulk_m) porque presentó las mismas características espectroscópicas que el CN sintetizado a partir de urea (CN bulk_u). Por lo tanto, no existen diferencias entre las nanohojas sintetizadas a partir de melamina y urea.

En la figura 4B se presenta el análisis espectroscópico para el compósito quitosano/CF/CN en comparación al quitosano puro. El pico alrededor de 3445 cm^-1 se atribuye a la vibración de estiramiento de los grupos amino (-NH₂) e hidroxilos (-OH) presentes en el quito-sano. La disminución en la intensidad de este pico, en el nanocompósito quitosano/1CF5g-CN_m, se debe a la reacción de los grupos amino (-NH₂) del quitosano con el grupo carbonilo del glutaraldehído (figura 6B), hacia la formación de enlaces imina (N=C) presentes alrededor de 1640 cm^-1 [37]. El pico en 2877cm^-1 corresponde al enlace C-H presente en el biopolímero. Los picos alrededor de 1591 y 1654 cm^-1 se atribuyen a los grupos amino del quitosano. Finalmente, en 1067 cm^-1 se atribuye a la vibración de estiramiento del grupo C-O-C [20, 38].

Figura 4

Por otro lado, el análisis espectroscópico del compósito muestra un mayor predominio de los picos de intensidad correspondientes al nitruro de carbono [39]. Los dos picos alrededor de 1232 y 1430 cm-1 al estiramiento de los grupos C-N presentes en los anillos aromáticos, mientras que a 808 cm^-1 pertenece al modo anillo de la triazina que corresponde al heterociclo condensado de CN [40].

La figura 5 muestra las imágenes SEM de los materiales formados.

En la figura 5A se observan las nanohojas de g-CN_m en forma de escamas que previamente se exfoliaron con NaOH. La figura 5B focaliza las nanopartículas esféricas de la ferrita de cobalto (CF) (las cuales están soportadas sobre las nano hojas de g-CN_m) con un tamaño promedio de 94,5 ± 10 nm. Finalmente, en las figuras 5C y 5D se muestra la morfología del material 1CF5g-CN_m en dos magnificaciones diferentes y se evidencia la presencia de los dos materiales con eficiente interacción entre ellos.

Figura 5

La figura 6A muestra las perlas formadas del fotocatalizador propiamente dicho, el nanocompósito final: quitosano/1CF5g-CN_m, en comparación con las de quitosano puro. La formación de las perlas se da por la capacidad de entrecruzamiento del quitosano en presencia de glutaraldehído, mediante la formación de enlaces iminas o también llamados base de Schiff entre una amina primaria, presente en el quitosano, y un grupo aldehído proveniente del glutaraldehído (figura 6B) [41,42]. Esta formación permite que las cadenas poliméricas se entrecrucen y formen armazones esféricos (perlas) que permiten la retención de materiales en su interior y en la superficie. Esta capacidad fue utilizada para poder incorporar a la mezcla el material 1CF5g-CN_m.

Figura 6

La actividad fotocatalítica se realizó por fotodegradación del ibuprofeno. La figura 7A muestra la fotólisis del ibuprofeno para verificar la posible degradación debida a la radiación visible (a partir de 400 nm). Se observa una leve disminución de los picos de absorción que sugieren una degradación casi despreciable. Esto hace inferir que el ibuprofeno puede considerarse bastante estable bajo la luz visible (420 nm). De manera similar al sistema anterior, se probó la fotocatálisis (figura 7B), donde se muestra la fotodegradación del ibuprofeno empleando las nanohojas de g-CN_m, se observa un aumento ligero en la degradación del fármaco, pero aún resulta poco significativa. Esto puede deberse a que, a pesar de que el nitruro de carbono puede absorber luz en el rango visible (a partir de 400 nm), también presenta algunas desventajas, tales como la recombinación del par electrón-hueco fotogenerados, además de presentar un band gap (2,7 eV) estrecho [28].

Figura 7

De manera similar al sistema anterior, se probó con el nanocompósito fotocatalizador quitosano/1CF5g-CN_m irradiando con luz visible (420 nm) donde se muestra las absorbancias en la figura 7C, alcanzando un valor de hasta 51% de degradación del contaminante emergente. El significante porcentaje de degradación se debe a la mejora en la separación del par electrón-hueco que se da en la inter-faz de g-CN_m y CF. Esto permite, además, que los electrones y huecos generados puedan ser transferidos en ambos materiales, aumentando la eficiencia de los radicales generados (OH y O₂-) [28, 43, 44].

Para determinar el porcentaje de mineralización se realizaron medidas del carbono orgánico total (TOC) con un analizador TOC-LCPH/ CPN (Shimadzu). El porcentaje de mineralización se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:

Donde [COT] ₀ (mg L^-1) es el carbono orgánico total de la solución inicial y [COT ] _t (mg L^-1) es la concentración de carbono orgánico al tiempo t de reacción.

En la figura 8 se puede mostrar la comparación del porcentaje de degradación del ibuprofeno empleando la técnica espectroscópica UV-Vis con las medidas del carbono orgánico total (TOC).

Figura 8

A diferencia de lo reportado por Wang et al., que solo alcanza a degradar un 20% después de 4 h de irradiación UV-Vis, empleando solo como fotocatalizador al nitruro de carbono (CN) bulk [46], en la figura 8 se puede evidenciar que la degradación del ibuprofeno alcanza un 50% donde se empleó el nanocompósito fotocatalizador quitosano/1CF5g-CN_m. Según lo reportado por Chen et al. esta amplia diferencia en la degradación se debe a que las nanohojas de nitruro de carbono (CN) presentan una mayor área superficial específica que el nitruro de carbono (CN) bulk, lo que genera un aumento de los sitios activos y, a su vez, exhibe una mayor transferencia de carga permitiendo una mejor eficiencia en la degradación del fármaco acorde con lo reportado [45]. Además, en otro estudio realizado por Wang et al., logran una heterounión de nitruro de carbono con nanohojas de Bi₂WO₆, logrando degradar ibuprofeno alrededor del 95% por 1 h [46]. El fotocatalizador sintetizado a base de quitosano/1CF5g-CN_m mostró un efecto positivo en la mejora de la degradación comparado al nitruro de carbono bulk.

Los resultados del recuento de UFC en placas de agar, después de 18 h de incubación y 60 min de iluminación, muestran que el número total de bacterias sobrevivientes en las muestras tratadas se reduce notablemente a aproximadamente dos órdenes de magnitud (figura 9). En comparación con el estado inicial, el porcentaje de células viables disminuye gradualmente tras la iluminación durante 30, 45 y 60 min, lo que da como resultado un 21% al final del proceso. La tendencia puede mejorar a lo largo del tiempo, aun usando la lámpara LED de baja intensidad con potencia de 50 W y longitud de onda cercana a 420 nm.

Figura 9

Según la literatura, los compósitos utilizados pueden producir una serie de especies reactivas para inactivar bacterias como electrones, huecos y especies reactivas del oxígeno (ROS) que incluyen O₂-, OH y H₂O₂ a través de la transformación de O₂ en una vía reductora en condiciones aeróbicas [47, 48]. Esto explicaría la eficiencia en la inactivación de E. coli y degradación fotocatalítica oxidativa de ibuprofeno. Adicionalmente a las actividades de CF en la separación del par electrón-hueco mencionados anterioremente, se ha informado específicamente que los nanomateriales g-CN pueden presentar especies que afectan la degradación de acuerdo al siguiente orden de especies oxidativas: huecos > aniones superóxidos > electrones [49, 50, 51].