La síntesis se realizó mediante el método de precipitación ( 16 ): se preparon soluciones acuosas de 0,02 M a partir de sales precursoras de acetato de cobre monohidratado (Cu(CH₃COO)₂∙H₂O) de grado químicamente puro, Merck Millipore, Alemania y sulfato de cobre pentahidratado (CuSO₂∙5H₂O) de grado técnico suministrado por la empresa J.A. Elmer, Perú. Luego cada solución de sal precursora preparada se vertió en un reactor piloto de acero inoxidable (33” de altura, 15” de diámetro, motor de 1720 revoluciones por minuto (rpm) y 0,37 kW de potencia, calentador por inmersión Rotkappe® de marca MAZURCZAK) tal como se muestra en la Figura 1. La reacción se inició en 100 °C con agitación vigorosa de 500 rpm, luego se agregó una solución de 0,1 M de hidróxido de sodio (NaOH) con 99,0% de pureza de la marca Merck Millipore, Alemania. Inmediatamente, se observó la formación de un precipitado marrón y para completar la reacción se mantuvo el sistema en agitación por 5 min. Posteriormente, el reactor fue vaciado y las NPs de CuO fueron lavadas 3 veces con agua destilada y secadas a 80 °C. Las NPs de CuO obtenidas a partir de las sales precursoras de Cu(CH₃COO)₂∙H₂O y CuSO₂∙5H₂O fueron denominadas de CuO-Acet y CuO-Sulf, respectivamente.

El estudio estructural de las NPS de CuO se realizó por difracción de rayos X empleando un difractómetro PANalytical X'Pert Pro con una radiación CuK α (λ = 1,5406 Å), equipado con un contador de centelleo y un monocromador de grafito a la salida del haz difractado. Los datos se recolectaron en un rango de 20 ° £ 2q £ 120 º con 0,02 ° de ancho de paso y una tasa de conteo no menor de 15 s por paso. El ajuste del difractograma se realizó por el método de Rietveld, utilizando el programa FullProf ( 22 ).

La caracterización morfológica de las NPS de CuO se realizó por microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FEGSEM por sus siglas en inglés), utilizando el microscopio electrónico Zeiss LEO 982 GEMINI, operado a 3 kV. Del mismo modo, se utilizó microscopía electrónica de barrido y transmisión (STEM/TEM) empleando un microscopio electrónico de emisión de campo de alta resolución JEOL JEM-2200FS operado a 200 kV con corrector de aberración esférica en modo STEM.

Otra caracterización de vibración molecular de las NPs de CuO se llevó a cabo por espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR), empleando un espectrofotómetro IR Prestige-21 Shimadzu utilizando la técnica de reflectancia atenuada total (ATR) con rango de análisis de 4000 a 400 cm^-1.

Para la evaluación de la actividad antimicrobiana se realizó el muestreo de 432 superficies correspondientes a tres áreas de UCI: Emergencia (12 muestras), Quirúrgico (12 muestras) y Neonatología (12 muestras). En cada unidad se realizó el hisopado de tres superficies diferentes tomando cuatro ejemplares de cada una de ellas (manijas, barandas, incubadoras e historias clínicas). Las muestras obtenidas fueron sembradas en medios de cultivo Agar Tripticasa de Soya (TSA) y Agar MacConkey e incubadas a 37 °C por 24 h. Finalmente, se realizó el recuento bacteriano en Unidades Formadoras de Colonias (UFC) y cada una de las colonias diferentes fue repicada (acción de trasplantar de un medio de cultivo a otro) en TSA para su posterior identificación.

La identificación de los microorganismos se realizó por pruebas bioquímicas convencionales. Para la identificación de las bacterias Gram positivas se realizó la búsqueda de las enzimas oxidasa, catalasa, coagulasa y DNasa, tipos de hemolisis, fermentación del manitol, susceptibilidad a la bacitracina (0,04 UI – Unidad Internacional) y optoquina (clorhidrato de etilhidrocupreína) 5 µg, logrando determinar el género bacteriano.

En el caso de las bacterias Gram negativas se realizaron pruebas para determinar el tipo de fermentación a los carbohidratos como glucosa, lactosa y sacarosa a través del medio bioquímico Agar Triple Azúcar Hierro (TSI), presencia de la enzima lisina descarboxilasa (LIA), presencia de motilidad y producción de indol (medio SIM), utilización de citrato como única fuente de carbono y presencia de acetil-metil-carbinol (acetoína) e hidrolisis de la urea ( 23 ).

Finalmente se aplicó el sistema de identificación multipruebas Analytical Profile Index (API) de la empresa Biomérieux: API Staph, API Strep para identificar bacterias Gram positivos, API 20E para la Familia Enterobacteriaceae y API NE para las bacterias no fermentadoras ( 24 ).

Para determinar la actividad antimicrobiana de las NPs de CuO se utilizó el método de difusión en placa empleado en el Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI por sus siglas en inglés,) ( 25 ). Este método es una modificación del método cilindro placa de cultivo de la Farmacopea Americana USP 32 ( 26 ), donde la inhibición bacteriana, mediante la difusión del principio activo de la muestra a probar en un medio de cultivo sólido, es evidenciada con la formación de halos de inhibición ( 25 , 27 ). Se utiliza, además, un cilindro de acero de 6 mm de diámetro que se ubica al centro de la placa, y dentro del cual se vierte un peso determinado de las nanopartículas (para este trabajo fue 20 mg), permitiendo que estas se distribuyan únicamente en el diámetro del cilindro ( 28 ).

Para cada una de las cepas intrahospitalarias aisladas e identificadas (Staphylococcus epidermidis, Aerococcus viridans, Ochrobactrum anthropi y Micrococcus lylae), se preparó un inóculo con una turbidez equivalente a 0,5 de la escala de Mac Farland ( 29 ) (1,5x10⁸ UFC/ml) y se sembró por duplicado sobre la superficie del medio de cultivo TSA, con ayuda de un hisopo estéril. Posteriormente, en el centro de la placa con TSA se colocó el cilindro de acero para inmediatamente añadir 0,02 g de NPs de CuO. Al finalizar, las placas se dejaron incubar a 37 °C por 24 h.

Aquellas cepas que presentaron halos de inhibición fueron medidas en mm con ayuda de un Vernier de marca Stanley Hardened. Se realizó el mismo procedimiento con los controles: como control positivo se tenían discos impregnados con 100 µL de desinfectante a base de amonio cuaternario (dilución 1/30), utilizado actualmente en el sector salud; como control negativo, se emplearon discos impregnados con 100 µL de agua destilada estéril. Todas las siembras fueron realizadas por duplicado para cada uno de los controles.

La Figura 2 muestra los patrones de difracción de rayos X de las NPs CuO-Acet y CuO-Sulf. CuO-Acet solamente muestra los picos de difracción correspondiente al CuO, mientras que CuO-Sulf, muestra una segunda fase, identificada como Cu₄SO₄(HO)₆ (16%). La fase de CuO en ambas muestras presentó una ligera orientación preferencial del plano (001), cuya intensidad es mayor que la que corresponde a una muestra de CuO sin orientación preferencial.

Los parámetros de red a, b, c y β de la celda monoclínica del CuO fueron determinados por el refinamiento Rietveld de los datos, usando el modelo y estructura inicial según Åsbrink y Norrby ( 30 ). Se tuvo en cuenta la contribución de los efectos del tamaño y la tensión interna al ensanchamiento del pico de difracción; ambos parámetros fueron refinados empleando un modelo isotrópico. Los parámetros estructurales y microestructurales obtenidos del refinamiento Rietveld son mostrados en la Tabla 1.

	a (Å)	b (Å)	c (Å)	β (°)	D nm	e *
CuO-Acet	4,6902 (1)	3,4282(1)	5,1384(1)	99,34 (1)	15,76 (1)	50,53(4)
CuO-Sulf	4,6944 (1)	3,4247(1)	5,1431(1)	99,40 (1)	19,20 (1)	64,41(4)

Estos picos, indexados respecto al sistema cristalino monoclínico (grupo espacial C2/c ), archivo N° 45 – 0937 de la base de datos del International Centre for Diffraction Data (ICDD, por sus siglas en inglés), son característicos de las NPs de CuO ( 8 ). La medida del tamaño del cristalito fue estimado del refinamiento de Rietveld y la fórmula de Scherrer, con valores de 15 y 19 nm para las NPs de CuO-Acet y CuO-Sulf, respectivamente.

En la Figura 3 se muestra la caracterización morfológica por SEM de las NPs sintetizadas a partir de dos tipos de sales precursoras. En las Figuras 3a y 3b se muestran imágenes a baja (200 kX) y alta (400 kX) magnificación, obtenidas con electrones secundarios de las NPs de CuO-Acet, donde se observan conglomerados de partículas cristalinas de apariencia redondeada con tamaños relativamente heterogéneos que varían entre 20 y 100 nm. Las micrografías de las Figuras 3c y 3d muestran la morfología de las NPs de CuO-Sulf. Estos cristales forman conglomerados laminares, cada uno de ellos tiene partículas alargadas de varios tamaños que van entre 10 y 110 nm.

Las imágenes de la Figura 3 muestras dos morfologías que diferencian las NPs de CuO-Acet y CuO-Sulf. Con la primera sal precursora los aglomerados de CuO son más redondeados que con las obtenidas por la segunda, y presentan aglomerados laminares de CuO alargados (forma de varillas).

Para determinar con mayor detalle las formas y la cristalinidad de las partículas que conforman los conglomerados, se estudiaron las muestras mediante STEM. Las imágenes se adquirieron en modo de campo claro y contraste Z. La Figura 4 muestra las NPs de CuO-Acet, las imágenes en campo claro (Figura 4a) y contraste Z (Figura 4b) muestran la forma de las partículas que conforman los aglomerados de tamaño uniforme, en forma prismática, cuyo ancho es ~15 nm y largo de ~20 nm.

La imagen de la Figura 4c muestra a mayor magnificación la cristalinidad de las partículas. En esta imagen se ven distancias interplanares que corresponden al CuO, cuyos valores están marcados en la imagen. El patrón de difracción de electrones (Figura 4d) corrobora la cristalinidad de las partículas, cuyas intensidades indexan con CuO. Se indican los índices de Miller en la imagen. Esta información es concordante con lo encontrado por XRD.

La Figura 5 muestra en detalle la morfología y la cristalinidad de las NPs de CuO-Sulf; también la imagen en campo claro (Figura 5a) y contraste Z (Figura 5b) muestran el crecimiento alargado de las partículas de CuO-Sulf, con diámetro de ~10 nm y longitud de ~80 nm. Del mismo modo, la Figura 5c muestra las distancias interplanares de las partículas, cuyos planos cristalinos pertenecen al CuO. El patrón de difracción de electrones muestra intensidades semi-continuas a lo largo del círculo que muestran un crecimiento textural de las NPs, debido a la monocristalinidad de cada una de las partículas alargadas.

Además de estas partículas, la Figura 6 muestra la imagen de una partícula laminar que no fue encontrada en las imágenes por SEM. La imagen de campo claro (Figura 6a) y campo oscuro (Figura 6b) muestran que se encuentra con las partículas alargadas; la intensidad uniforme en la partícula laminar muestra que tiene un espesor uniforme. En el patrón de difracción de electrones (Figura 6c) se observan intensidades puntuales bien marcadas, las cuales corresponden a la fase de CuSO₄·H₂O, cuyos índices de Miller están en color verde; las otras intensidades provienen de las partículas alargadas.

A partir de estas imágenes por microscopia electrónica de transmisión, puede observarse que la síntesis de NPs prismáticas se forma con el precursor acetato y, en el caso de las partículas alargadas y laminares monocristalinas, con el precursor sulfato. Usando diferentes tipos de precursores fue posible obtener partículas con morfologías diferentes.

En la Figura 7 se observa el espectro de transmisión de las NPs (a) CuO-Acet y (b) CuO-Sulf. Tanto para las Figuras 7a y 7b las bandas formadas entre 2500 a 4000 cm^-1 son principalmente atribuidas al modo stretching del enlace O-H^- en la superficie de las NPs de CuO. Además de ello, para ambos espectros la banda formada alrededor de 1640 cm^-1 es correspondiente al modo bending del agua ( 12 , 31 ). En la Figura 7a las bandas en 1550 cm^-1 y 1410 cm^-1se pueden atribuir al modo stretching del –COO y modo bending del –CH₃ respectivamente ( 12 , 31 ). Las bandas entre 800 a 1250 cm^-1, específicamente en 1122 cm^-1 y 1085 cm^-1 de la Figura 7b pueden ser correspondientes a los modos de vibración del CuSO₄·H₂O remanente sin reaccionar ( 32 ). Las bandas de absorción infrarroja en valores menores que 700 cm^-1 muestran los modos de vibración característicos de las NPs de CuO. Las bandas en 473 cm^-1 y 597 cm^-1 de la Figura 7a y las bandas en 477 cm^-1 y 592 cm^-1 de la Figura 7b corresponden al modo de vibración stretching del enlace Cu-O ( 12 , 33 ).

De la evaluación de la actividad antimicrobiana, se observó que los halos de inhibición para el control positivo para Staphylococcus epidermidis, Aerococcus viridans, Ochrobactrum anthropi y Micrococcus lylae fueron de 21, 18, 7 y 19 mm, respectivamente, mientras que para el control negativo fue de 6 mm para todas las bacterias estudiadas. En la Figura 8 se muestra la formación de halos de inhibición (delimitados por líneas punteadas de color rojo) para las nanopartículas de CuO-Acet para bacterias: (a) Staphylococcus epidermidis (12 mm), (b) Aerococcus viridans (10 mm), (c) Ochrobactrum anthropi (16 mm) y (d) Micrococcus lylae (14 mm). Las nanopartículas de CuO-Sulf presentaron los siguientes halos de inhibición: (e) Staphylococcus epidermidis (17 mm), (f) Aerococcus viridans (13 mm), (g) Ochrobactrum anthropi (16 mm) y (h) Micrococcus lylae (16 mm); la Tabla 2 muestra un resumen de estos datos.

También se visualiza claramente la presencia de un color azulado oscuro alrededor de las NPs, lo que indica un proceso de formación de complejos de Cu²⁺ en el medio agar. Los iones del Cu²⁺ para el caso de las NPs CuO-Acet, probablemente corresponden a un proceso de disolución de los átomos externos de las NPs. Para el caso de las NPs CuO-Sulf, se puede esperar que los Cu²⁺ provengan también de la fase Cu₄SO₄(HO)6.

Cepa intrahospitalaria	CuO-Acet (mm)	CuO-Sulf (mm)	Control positivo (mm)	Control negativo (mm)
Staphylococcus epidermidis	12	17	21	6
Aerococcus viridans	10	13	18	6
Ochrobactrum anthropi	16	16	7	6
Micrococcus lylae	14	16	19	6

Una posible explicación a la inhibición bacteriana por parte de las nanopartículas de CuO podría ser la interacción directa que se estaría dando con la superficie de la membrana externa de la bacteria. En este contexto, estudios realizados con óxidos metálicos sugieren que la actividad antimicrobiana estaría dándose por las especies reactivas del oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) producidas por la presencia de estos óxidos. Allí, las especies de oxígeno estarían interactuando con la membrana celular de la bacteria y permitiendo el ingreso de las nanopartículas a la célula ( 34 ). Otros estudios realizados observan que el efecto antimicrobiano de estas nanopartículas aumenta con la concentración utilizada, por lo que probablemente esta inhibición se deba al aumento de interrupciones generadas por las nanopartículas de CuO en la superficie de la membrana de la célula generando así un mal funcionamiento de los componentes de la célula tales como el ADN, lípidos, peptidoglicanos y proteínas ( 34 , 35 ).

Muchos investigadores afirman que el mecanismo esencial para la citotoxicidad que generan las nanopartículas es la liberación de iones Cu²⁺ que reaccionan con los grupos tiol (SH) de las proteínas presentes en la superficie de la membrana de la célula bacteriana. Estas proteínas sobresalen de la membrana celular, permitiendo el transporte de nutrientes a través de la pared celular. Las nanopartículas estarían inactivando estas proteínas, reduciendo la permeabilidad de la membrana y llevando a la célula a la muerte ( 36 , 37 ).

En este trabajo, la liberación de los iones Cu²⁺ podría proceder más fácilmente de las NPs de CuO-Sulf, dado que en ellas se encuentra también una pequeña cantidad de Cu₄SO₄(HO)₆ el cual, por su forma hidratada, interactúa más fácilmente con el medio agar, a diferencia de las NPs de CuO-Acet.

Otros trabajos de investigación han demostrado que las células bacterianas, luego de la fijación inicial a una superficie, se mantienen unidas por un polímero extracelular y forman una biopelícula. Entonces, suprimir la formación de la biopelícula es una forma de prevenir o evitar el crecimiento de las bacterias ( 38 ). Así, se ha observado que recubrimientos delgados de ZnO que tienen una superficie compuesta de agujas de tamaño nanométrico, pueden penetrar en la membrana celular cuando están en contacto. Además, tales características de la estructura superficial de la película de ZnO afecta la última etapa del desarrollo de la biopelícula. Por lo anterior, el efecto combinado de las características nanoscópicas de la aguja y las propiedades antibacterianas del ZnO son los responsables del menor número de bacterias en una superficie ( 39 , 40 ).

Se puede decir entonces, de manera análoga, que la morfología alargada y laminar de las NPs de CuO-Sulf favorece la interacción de estas con la membrana celular de las bacterias a diferencia de las NPs de CuO-Acet que presentaron forma globular.