La inmovilización del péptido Ib-M1 en IONP@ se monitoreó por medio de la determinación de la absorbancia a 595 nm antes y después de realizar el lavado. Los resultados se muestran en la figura 1, en donde se observa una disminución en la absorbancia del sobrenadante proveniente de la centrifugación del IONP@Ib-M1, lo que indica que disminuyó la cantidad de péptido en solución y fue, por tanto, inmovilizado después de dos horas de agitación. El porcentaje de inmovilización del péptido Ib-M1 en las IONP@ fue de 45,23%.
Los efectos inhibitorios de Ib-M1 se han estudiado en varias ocasiones [7, 8] bajo diferentes condiciones de cultivo. Se ha encontrado que el grado de inhibición depende de diferentes parámetros como la concentración celular. Teniendo en cuenta lo anterior, y con el objetivo de determinar cómo se podría afectar la cinética de crecimiento y a partir de qué momento de incubación se podría realizar el análisis con base en su cambio drástico en crecimiento, se analizó la respuesta de crecimiento celular bajo tratamientos con Ib-M1, IONP@Ib-M1, IONPs y IONP@ usando el método de microdilución. En la figura 2 se muestran los resultados obtenidos de cinética de crecimiento de
De acuerdo con la figura 2A, el crecimiento de
Por otro lado, cuando
Para determinar los cambios a nivel de expresión de proteínas bajo los diferentes tratamientos transcurridas nueve horas de incubación, se realizó el análisis por medio de electroforesis bidimensional. Para esto, se utilizaron entre 1,2 y 2,6 mg de muestra de proteína. Se realizaron dos réplicas biológicas para el control positivo y para los tratamientos Ib-M1, IONP@Ib-M1, IONPs y IONP@. Posteriormente se efectuó el análisis como se menciona en el apartado de metodología. Se llevó a cabo la normalización de las intensidades de cada una de las manchas expresadas, utilizando la intensidad total del punto por gel, para compensar las variaciones entre las réplicas. En la figura 3 se muestra el resultado de la exposición de
Se obtuvo la expresión total de 39 puntos de proteínas; 15 se inhibieron con respecto al control, 15 se expresaron con respecto al control, 23 tuvieron una sobreexpresión ≥ 1,5 y siete una inhibición ≤ 1,5. De aquellas proteínas que estuvieron presentes tanto en el perfil de proteínas control como en el perfil de proteínas del tratamiento con Ib-M1, seis presentaron diferencias estadísticamente significativas (p ≤0,05), las cuales se muestran en la figura 4.
Después de identificar los patrones de expresión se realizó la aproximación a la identificación de las proteínas expresadas que presentaron diferencias estadísticamente significativas, aquellas que para nuestro conocimiento no han sido reportadas se indicaron con NR. La posible identificación de las proteínas se lista en la tabla 1.
* El p-valor resulta luego de hacer el Anova y test de Bonferroni. NR Proteínas no reportadas de acuerdo con peso molecular (MW) y punto isoeléctrico (pI).
0304
NR
NR
+1,5
0,036
4,1
22,3
0924
CheA [19]
Transmisión de señales sensoriales de los quimiorreceptores a los motores flagelares [20]
+1,5
0,001
4,0
86,6
3304
MoaB [19]
Biosíntesis de molibdopterina. Hexamerización de proteínas [20]
+1,5
0,000
5,6
21,6
3501
Bla [19]
Hidrólisis de enlace betalactámico en antibióticos [19] Respuesta a antimicrobiano [20]
+1,5
0,000
5,5
28,8
3601
TrxB [19]
Eliminación de radicales superóxido [20]
+1,5
0,025
5,5
34,0
4301
MdaB [19]
Actividad de NADPH deshidrogenasa (quinona), unión al dinucleótido de adenina flavina [20]
+1,5
0,029
5,9
21,8
De acuerdo con lo anterior, se observó la sobreexpresión de proteínas relacionadas con mecanismo de respuesta inmediata para contrarrestar los efectos del péptido Ib-M1 libre. Una de las proteínas con expresión diferencial podría corresponder a cheA (histidina quinasa), la cual es regulada por señales enviadas de quimio aceptores de metiloproteínas (MCP) en respuesta a cambios en el comportamiento flagelar a través de un movimiento conocido como quimiotaxis [21]. La expresión diferencial de la proteína identificada como moaB está involucrada en la biosíntesis del cofactor de molibdeno (MoCo) [22]. La falta MoCo en
En la figura 5 se muestra el resultado de la exposición de
Como resultado de la exposición de
Después de identificar los patrones de expresión se realizó la aproximación a la identificación de las proteínas expresadas y aquellas que presentaron diferencias estadísticamente significativas, aquellas que para nuestro conocimiento no han sido reportadas se indicaron con NR. La posible identificación de las proteínas se lista en la tabla 2.
* El p-valor resulta luego de hacer el Anova y test de Bonferroni. NR Proteínas no reportadas de acuerdo con peso molecular (MW) y punto isoeléctrico (pI).
1204
YhbS [19]
Transferencia de grupos acilo [20]
-1,5
0,009
4,5
18,5
3304
LolA [19]
Participa en la translocación de lipoproteínas de la membrana interna a la membrana externa [20]
+1,5
0,025
5,6
21,6
3501
Bla [19]
Hidrólisis de enlace betalactámico en antibióticos [19] Respuesta a antimicrobiano [20]
+1,5
0,004
5,5
28,8
4501
GpmA [19]
Glucogénesis [20]
+1,5
0,056
5,9
28,0
7501
YrbF [19]
Transportador hipotético ABC [19]
+1,5
0,007
6,3
28,1
7502
SuhB [19]
Actividad catalítica [20]
+1,5
0,035
6,5
29,6
Al igual que con el tratamiento con Ib-M1, se obtuvo la expresión significativa de la proteína identificada como Bla (β-lactamasa), la cual está asociada a la biosíntesis de molibdopterina, hexamerización de proteínas e hidrólisis de enlaces betalactámicos en antibióticos [24]. Así mismo, se obtuvo expresión significativa de LolA, la cual es una chaperona periplásmica que interviene en la síntesis de lipoproteínas de membrana externa, proceso que es dependiente de ATP [28]. La proteína identificada como GpmA hace parte de proteínas que participan en el transporte de aminoácidos y el metabolismo en respuesta a estrés de tetraciclina y hexabromociclododecano (HBCD) [29]. La proteína identificada como YrbF se conoce que está involucrada en la regulación de fosfolípidos en la membrana externa de bacterias Gram-negativas, con el objetivo de formar y expulsar vesículas al medio externo como factor de virulencia y, así mismo, intercambiar componentes de la superficie celular [30]. Igualmente, la proteína está relacionada con funciones como actividad catalítica, transportador hipotético ABC y respuesta a antimicrobiano [20]. Haciendo uso de la herramienta en línea STRING V11.0, no se obtuvo interacción entre las posibles proteínas identificadas, sin embargo, esto no necesariamente implica que no se trate de proteínas biológicamente significativas, solo que aún no se conocen otras interacciones.
En la figura 7 se muestra el resultado de la exposición de
Como resultado de la exposición de
Después de identificar los patrones de expresión se realizó la aproximación a la identificación de las proteínas expresadas y aquellas que presentaron diferencias estadísticamente significativas. La posible identificación de las proteínas se lista en la tabla 3.
* El p-valor resulta luego de hacer el Anova y test de Bonferroni. NR Proteínas no reportadas de acuerdo con peso molecular (MW) y punto isoeléctrico (pI).
601
Usg [19]
Proceso biosintético de aminoácidos celulares [20]
+1,5
0,057
4,0
29,2
2801
MalE [19]
Transporte de membrana de maltosa [19], quimiotaxis celular, respuesta celular a estímulo de daño ADN [20]
+1,5
0,015
5,2
40,8
3304
LolA [19]
Participa en la translocación de lipoproteínas de la membrana interna a la membrana externa [20]
+1,5
0,000
5,6
21,6
3501
Bla [19]
Hidrólisis de enlace betalactámico en antibióticos [19] Respuesta a antibiótico [20]
+1,5
0,004
5,5
28,8
3601
TrxB [19]
Eliminación de radicales superóxido [20]
+1,5
0,013
5,5
34,0
1503
NR
NR
+1,5
0,024
4,8
27,9
Una de las proteínas con expresión diferencial es Usg, esta hace parte del complejo acetil coenzima A carboxilasa (ACC), así mismo, está relacionada con el control de la traducción del ARNm uniéndose a una horquilla probable en el extremo 5' del ARNm, inhibiendo la traducción [20]. Además, se obtuvo la sobreexpresión de la proteína identificada como MalE, la cual es una proteína periplásmica de unión a maltosa (MalE o MBP) requerida en bacterias Gram-negativas para el transporte de maltosa y maltodextrinas y para quimiotaxis hacia estos sustratos, también se ha encontrado que esta se expresa a un alto nivel en consecuencia de
En la figura 9 se muestra el resultado de la exposición de
Como resultado de la exposición de E. coli O157:H7 bajo el tratamiento con IONP@, se obtuvo un total de 37 puntos de proteínas; 19 se inhibieron con respecto al control, 16 se expresaron en relación con el control, 9 tuvieron una sobreexpresión ≥ 1,5 y 2 una inhibición ≤ 1,5. De aquellas proteínas que estuvieron presentes tanto en el perfil de proteínas control como en el perfil de proteínas del tratamiento con IONP@, 4 presentaron diferencias estadísticamente significativas (p ≤0,05) como se muestra en la figura 10.
Después de identificar los patrones de expresión se realizó la aproximación a la identificación de las proteínas expresadas y aquellas que presentaron diferencias estadísticamente significativas. La posible identificación de las proteínas se lista en la tabla 4.
* El p-valor resulta luego de hacer el Anova y test de Bonferroni. NR Proteínas no reportadas de acuerdo con peso molecular (MW) y punto isoeléctrico (pI).
3501
Bla [19]
Hidrólisis de enlace betalactámico en antibióticos [19] Respuesta a antibiótico [20]
+1,5
0,000
5,5
28,8
3601
TrxB [19]
Eliminación de radicales superóxido [20]
+1,5
0,000
5,5
34,0
4501
GpmA [19]
Glucogénesis [20]
+1,5
0,001
5,9
28,0
8006
NR
NR
+1,5
0,004
6,7
11,0
Al igual que en el tratamiento con el Ib-M1, se obtuvo la sobreexpresión significativa de proteínas como Bla, TrxB y GpmA, cuyas funciones fueron mencionadas anteriormente. Haciendo uso de la herramienta en línea STRING V11.0, no se obtuvo interacción entre las posibles proteínas identificadas, sin embargo, esto no necesariamente indica que no se trate de proteínas biológicamente significativas, solo que aún no se conocen otras interacciones.