Para identificar el repertorio de proteínas PR en yuca, en primera instancia, se llevó a cabo una búsqueda en la base de datos Uniprot empleando como motor de búsqueda palabras conteniendo los nombres de cada uno de los PR: "PR1", "PR2", hasta "PR17". También se emplearon palabras que abarcaran su función molecular tales como: proteínas relacionadas con patogénesis (pathogenesis-related protein) y la actividad asociada al tipo de familia.

A partir de las secuencias seleccionadas, se realizó un alineamiento tipo BLASTP de cada una contra el proteoma de yuca y se seleccionaron los cinco mejores resultados a condición de que tuvieran un porcentaje de similitud mayor al 60 % para cada uno de los PR de referencia de Uniprot. A partir de las secuencias codificantes (CDS, coding sequence) de los PR candidatos obtenidos de yuca, se diseñaron los cebadores empleando el programa Primer3 (Untergasse et al., 2012).

Plantas de las variedades cv.60444 y SG107-35 se crecieron durante dos meses en el invernadero de Biología de la Universidad Nacional de Colombia, bajo las siguientes condiciones: temperatura de 28°C/21°C (día/noche), humedad relativa de 80 %, con un fotoperiodo de 12 horas luz y 12 horas oscuridad.

Las bacterias se crecieron por agotamiento a partir del stock almacenado a -80 °C del cepario del laboratorio del grupo Manihot Biotec de la Universidad Nacional, en medio LPGA (5 g extracto de levadura, 5 g peptona, 5 g glucosa y 15 g agar por 1 L de agua destilada). Las bacterias se crecieron a 28 °C durante dos días. Tras obtener colonias aisladas, se tomó una de ellas y se realizó el cultivo en 3 mL de medio LPG a 28 °C a 250 rpm durante 12 h. Se centrifugó 1 mL del cultivo a 6000 rpm durante 4 min, se descartó el sobrenadante, y posteriormente se resuspendió el precipitado en 1 mL de MgCl. Se ajustó a una DO de 0,02 que corresponde a 10⁷ UFC/mL (unidades formadoras de colonia). La concentración de bacterias empleada se verificó por diluciones seriadas.

La inoculación se realizó en el tallo mediante punción entre la segunda y tercera hoja totalmente extendida con un palillo de madera estéril. El palillo fue removido y se reemplazó por una punta pequeña estéril con 10 uL de la solución bacteriana de Xam686. Para las plantas control se realizó el mismo procedimiento, pero con una solución de MgCl₂ 10 mM. Se tomó la región del tallo que comprendía 1.5 cm hacia arriba (ápice) y 1.5 cm hacia abajo desde el punto de inoculación. Para cada tratamiento se colectó el tallo en nitrógeno líquido. Los tiempos de toma de muestra fueron: 0 y 24 horas post-inoculación (hpi) y 3, 5 y 7 días post-inoculación (dpi). Se empleó un diseño completamente aleatorizado para la distribución de las plantas en el invernadero.

El material vegetal se maceró en un mortero utilizando nitrógeno líquido. El buffer de extracción utilizado contenía acetato de sodio 100 mM, EDTA pH 7.5 1 mM y SDS 4 % (pH 5,2). Posteriormente se purificó con fenol ácido (pH 4,5): cloroformo: alcohol isoamílico 24:24:1. La fenolización se repitió una vez y se realizó la extracción con cloroformo:alcohol isoamílico 24:1, dos veces. Finalmente, se precipitó con isopropanol. El ARN se lavó con etanol al 70 % y se resuspendió en agua ultra-pura (libre de nucleasas). A partir del ARN extraído manualmente, se realizó una purificación empleando el Invitrap ® Spin plant RNA minikit (STRATEC, Berlín, GER). La integridad del ARN se verificó en gel de agarosa al 1% y se cuantificó con el espectrofotómetro Nanodrop 2000c (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) mediante la medición de absorbancia a 260 y 280 nm. Una vez obtenido el ARN, se trató con DNase I (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) sobre 600 ng-1000 ng de ARN total, con el fin de remover el ADN genómico y así poder proceder con la síntesis de ADNc. Posteriormente se realizó un PCR del gen tubulina sobre el ARN tratado previamente con DNase I, como control. La síntesis de primera cadena de ADN se realizó con el kit First Strand cDNA Synthesis (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). Para verificar la síntesis correcta de ADNc se realizó un RT-PCR con cebadores diseñados a partir del gen tubulina, el cual se expresa constitutivamente (Tabla suplementaria 1).

Todas las reacciones de qRT-PCR se realizaron con el kit SsoAdvanced Universal Inhibitor SYBR Green Supermix (BioRad) en un termociclador LightCycler^® 96 System (Roche Diagnostics GmbH, Indianapolis, IN, USA). Las reacciones se realizaron en un volumen final de 10 uL (0,1 mM de cada primer, 0,1 mM de dNTPs) conteniendo 1 uL de ADNc. Las condiciones de amplificación fueron: denaturación inicial a 95 °C por 10 min, 45 ciclos de 95 °C por 20 s, 60 °C por 20 s y 72 °C por 20 s. Se realizaron las curvas de calibración de los cebadores utilizando cinco diluciones seriadas usando un factor de dilución de 1:10. Para la evaluación de los genes se utilizaron 3 réplicas biológicas por cada una de las dos variedades y tres tiempos evaluados para plantas con tratamiento de inoculación y mock. Los resultados se analizaron con el software LightCycler 96 SW 1.1 (Roche). Para el cálculo de la expresión relativa de los genes de interés se utilizó el gen HK2 (Manes06G114200.1 como gen de referencia (normalizador). Se realizaron dos análisis de expresión relativa empleando el método 2^{-M Ct} method (Livak and Schmittgen, 2001). Para el análisis de expresión en relación al tiempo 0 hpi, se empleó el modelo matemático de la siguiente manera: AC_t(60444/SG10735 inoculadas a 3 y 7 dpi) = C _t (target gene)-C(reference gene); AC_t(60444/ SG10735 inoculadas a 0 hpi) = C(target gene)-C (reference gene); AAC_t(60444/SG10735)= ' AC(60444/Sg10735 inoculadas a 3 y 7 dpi)-AC_t(60444/SG10735 inoculadas a 0 hpi). Por otro lado, para el análisis de expresión en relación a la herida con MgCl₂, se empleó el modelo matemático de la siguiente manera: AC_t(60444/SG10735 inoculadas a 0, 3 y 7 dpi) = C(target gene)-C _t (reference gene); AC_t(60444/ SG10735 herida con MgCl₂ a 0, 3 y 7 dpi) = C_t( target gene)-C _t (reference gene); AAC_t(60444/SG10735 de la inoculación en relación a la herida)= AC (60444/SG10735 inoculadas a 0, 3 y 7 dpi)-AC_t(60444/SG10735 herida con MgCl₂ a 0, 3 y 7 dpi).

Al realizar la búsqueda en la base de datos de Uniprot empleando como motor de búsqueda el término "PR", su nombre y la función molecular asociada a PRs, se seleccionaron 50 proteínas de este tipo (Tabla suplementaria 1). La mayor cantidad de proteínas PR reportadas provienen de tabaco (Nicotiana tabacum) con 20 secuencias, seguido de tomate (Solanum lycopersicum) con 11 y Arabidopsis thaliana con siete proteínas. Las demás especies tan sólo presentan una proteína reportada, como el caso de cebada (Hordeum vulgare) con el PR14 y la proteína de maíz (Zea mays) de la familia PR6. La familia con mayor número de proteínas reportadas es la PR1, con nueve proteínas, seguido de la familia PR5 con ocho proteínas reportadas y PR2 y PR4 con seis proteínas cada una. Las familias PR3 y PR10 presentaron cuatro proteínas seguido de PR-9 y PR-6. Las demás familias (PR7, 11, 14 y 17) presentaron tan sólo un reporte (Fig. 1).

Las secuencias de estas proteínas PR se descargaron y se procedió a realizar un BLASTP contra el proteoma de yuca v4.1 y así identificar los genes similares en el genoma de yuca. A partir de estos resultados se construyó una lista de los genes PRs por especie y su similar en yuca (Tabla suplementaria 1). Una vez creada la matriz de los diferentes PR reportados y los candidatos similares en yuca, se evaluó si las secuencias de dichos PR candidatos identificados estaban presentes en el microarreglo reportado previamente por López et al. (2005). Sin embargo, no se encontraron en esta colección de marcadores de secuencias expresadas (ESTs)). Se evaluó el nivel de expresión según los datos de RNAseq disponibles (Gomez et al. sometido) de las secuencias similares en yuca para cada una de las 50 proteínas PR reportadas. Para la selección de los genes se tuvo en cuenta aquellos que mostraran un mayor incremento en la expresión, fuese o no este significativo, con respecto al control (plantas no inoculadas) y que representaran miembros de diferentes familias de PRs.

Figura 1

En total, se sintetizaron 15 juegos de cebadores en dirección sentido-antisentido, tres para PR1 y PR4, dos cebadores para PR2, PR3, PR8 y PR10 y uno para PR9 (Tabla 1). Para verificar el correcto diseño de los cebadores y amplificación se realizó un PCR sobre ADN genómico de las variedades cv.60444 y SG107-35 y empleando una temperatura de anillamiento de 52 °C para todos ellos. De los 15 candidatos, 14 amplificaron en las dos variedades (Fig. 2). El único juego de cebadores que no amplificó fue el correspondiente a PR10b.

Tabla 1

PR	Familia	ID del gen en el genoma de yuca (v.6)
PR1a	Pfam:00188 Cysteine-rich secretory protein family	Manes.07G050700
PR1b	Pfam:00188 Cysteine-rich secretory protein family	Manes.07G050400
PR1c	Pfam:00188 Cysteine-rich secretory protein family	Manes.07G050300
MePR1	Pfam:00188 Cysteine-rich secretory protein family	Manes.06G026900.1
PR2a	Pfam:00332 Glycosyl hydrolases family 17	Manes.03G202900
PR2b	Pfam:00407 Pathogenesis-related protein Bet v I family	Manes.15G007900
PR3a	Pfam:00182 Chitinase class I	Manes.04G067900
PR3b	Pfam:00182 Chitinase class I	Manes.11G106100
PR4a	Pfam:00187 Chitin recognition protein	Manes.01G064200
PR4b	Pfam:00187 Chitin recognition protein	Manes.08G135100
PR4c	Pfam:00967 Barwin family	Manes.08G135200
PR8a	Pfam:00704 Glycosyl hydrolases family 18	Manes.06G155500
PR8b	Pfam:00704 Glycosyl hydrolases family 18	Manes.06G155400
PR9	Pfam:00141 Peroxidase	Manes.15G104200
PR10a	Pfam:00407 Pathogenesis-related protein Bet v I family	cassava4.1_022277m*
PR10b	Pfam:00407 Pathogenesis-related protein Bet v I family	Manes.15G008700

* Los genes se identificaron en la versión 4.1 del genoma de yuca y al buscar su correspondencia en la versión actual (v. 6.1) se observó que no lista como anotado (www.phytozome.net).

Figura 2

Una vez verificado que los cebadores podrían amplificar los genes respectivos sobre el ADN genómico de las dos variedades, se evaluó su expresión empleando el ADNc obtenido a partir de las plantas de yuca de las dos variedades y colectado a diferentes tiempos post-inoculación. A partir del ADNc sintetizado se realizó la amplificación del gen constitutivo tubulina (Manes.08G061700) con el fin de verificar la calidad del ADNc. En la figura 3, en el panel superior se observa la amplificación de dicho gen. Cada carril representa el ADNc obtenido de las dos variedades SG107-35 y cv.60444, tratadas con la solución control (MgCl₂ 10 mM) o con la bacteria (Xam686) y colectado a 0, 1, 3, 5 y 7 dpi. Después de realizar una curva de calibración modificando número de ciclos y cantidades de ADNc en cada muestra se logró obtener un amplicón para tubulina visualmente homogéneo en la mayoría de las muestras, aunque con una pequeña diferencia en algunos tiempos para la variedad susceptible (Fig. 3). Con esta misma cantidad de ADNc se llevaron a cabo las amplificaciones de los genes correspondientes a los PR seleccionados. Dado el gran volumen de trabajo se decidió evaluar inicialmente los genes PR1a, PR1b, PR8a y PR8b en las dos variedades. Además, se incluyó el gen que codifica para la Glutation-S- transferasa el cual ha sido previamente reportado como inducido en una variedad resistente en respuesta a Xam (Lopez et al., 2005). El gen PR8b no mostró expresión en ninguna de las dos variedades, mientras que el gen GST se expresó de manera constitutiva en las dos variedades, incluyendo tanto las plantas no inoculadas (NI) como en las que se trataron con solución de MgCl₂ (Fig. 3). Para los genes PR1a y PR1b se observa una leve inducción de la expresión a lo largo del tiempo, particularmente el PR1b muestra una inducción en la variedad resistente y al día 5 post inoculación. El gen PR8a (glicosil-hidrolasa) mostró una expresión desde el tiempo cero tanto en las plantas tratadas con la solución control como las infectadas con Xam en la variedad resistente SG107-35 (Fig. 3). En la variedad susceptible, cv.60444, el gen PR8a se expresa en todos los tratamientos, con una fuerte inducción en la planta inoculada con la solución control y colectada a los 7 dpi. De igual manera, se observó un incremento de la expresión en las plantas inoculadas con Xam y colectadas a los 5 y 7 dpi, siendo mayor en este último tiempo (Fig. 3). Sin embargo, al comparar el perfil de expresión obtenido en las plantas tratadas con MgCl₂ se observa también una expresión y/o inducción, sugiriendo que solo el proceso de punción y herida induce la expresión de estos genes, haciendo difícil determinar la contribución cuantitativa real de la inducción provocada por la bacteria misma.

Figura 3

La expresión de los genes PR2b, PR4c, PR10a y PR10b se evaluó solamente en la variedad resistente. El gen PR2b no mostró expresión a ningún tiempo ni en ninguna de las condiciones evaluadas. El gen PR4c se indujo tanto para las plantas tratadas con la solución control, como en las infectadas con Xam en todos los tiempos a partir de 1 dpi. Los genes PR10a y PR10b presentaron una amplificación sin una aparente tendencia, incluso hay una leve amplificación en el control absoluto (plantas de la misma edad a las que no se les realizó la inoculación ni con la solución control ni con Xam) (Fig. 3). De esta manera el perfil de los genes PR4c, PR10a y PR10b fue similar al descrito para los genes PR1a, PR1b y PR8, razón por la cual no se pudo determinar la contribución real de la inducción ocasionada por la bacteria misma.

Con el fin de lograr una determinación cuantitativa y no basada en la inspección visual de la intensidad de las bandas, se evaluó la expresión de algunos genes PR mediante qRT-PCR (quantitative reverse transcription-PCR). Para ello se determinó el nivel de expresión relativo de cada gen utilizando como gen de referencia Manes06G114200.1 tanto para las muestras provenientes de las plantas inoculadas con Xam como de las plantas tratadas con la solución de MgCl₂. De esta manera la relación entre estos dos valores permite determinar el efecto de la inoculación bacteriana sobre la expresión de los genes PR. Para este ensayo se realizó en primera instancia las curvas de eficiencia y la eficacia de los mismos cebadores para los ensayos de QRT. Los cebadores para los genes PR1c, PR3a, PR8b y PR10b, presentaron problemas, baja amplificación (valores de Ct muy altos), presencia de productos inespecíficos y no permitieron ser evaluados en las dos variedades (datos no mostrados). Los genes PR1b y PR2b no mostraron amplificación en ninguna de las dos variedades y en ninguno de los dos tiempos evaluados, confirmando los datos obtenidos mediante RT-PCR semicuantitativa. Los valores de expresión más relevantes se obtuvieron empleando los cebadores para PR1a y PR9. Adicionalmente se incluyó el gen candidato MePR1 (Manes.06G026900.1) recientemente reportado en la literatura (Yoodee et al., 2018). Si bien este gen fue identificado en el primer análisis utilizando la base de datos de Uniprot, no fue considerado inicialmente por no presentar uno de los mejores E- value (Tabla suplementaria 1). Dado el gran número de muestras se decidió evaluar la expresión de estos tres genes en las dos variedades a los tiempos 0, 3 y 7 dpi, tomando de esta forma un tiempo relativamente temprano (3 dpi) y otro tardío (7 dpi) con el objetivo de tener un amplio espectro del perfil de expresión.

Con el fin de evaluar la expresión relativa de PR1a, PR9 y MePR1 en respuesta a la inoculación con Xam, se comparó la expresión de cada gen a lo largo del tiempo en ambas variedades con respecto a 0 dpi. Los resultados indican que la expresión de PR1a mostró un perfil interesante donde se observa claramente una inducción a los 3 dpi exclusivamente en la variedad resistente, incrementando su expresión a los 7 dpi (Fig. 4a).

Figura 4

Correspondientemente, el perfil de expresión de PR9 es similar al de PR1a, sin embargo, los valores de expresión de PR9 en la variedad resistente son mucho más bajos comparados con la expresión de PR1a en esa misma variedad (Fig. 4b). Por otro lado, la expresión de MePR1 es inducida por la bacteria en la variedad resistente al compararla con la susceptible a los 3 dpi y no a los 7 dpi (Fig. 4c). De manera notable, estudios previos han mostrado que la herida que se genera al momento de la inoculación puede producir la inducción de genes de manera diferencial (Gomez et al. sometido). Por esta razón, se decidió evaluar la expresión relativa de PR1a, PR9 y MePR1 con respecto a la herida. Para esto, se realizó un nuevo cálculo de la expresión relativa de cada gen en las dos variedades inoculadas con Xam con respecto a la inoculación con MgCl₂. Los resultados de este análisis muestran que la expresión relativa de PR1a y PR9 es muy similar en la variedad resistente comparada con la susceptible para los tres tiempos evaluados (Fig. 5a, 5b). En particular, el gen PR1a mostró una baja expresión en las dos variedades a los 0 y 3 dpi. Aunque a los 7 dpi hay una inducción en la variedad susceptible, por problemas técnicos no se pudo evaluar la expresión en este tiempo para la variedad resistente (Fig. 5a). Por otro lado, y de manera interesante se encontró una baja expresión del gen MePR1 a 0 y 3 dpi en ambas variedades y una clara inducción a 7 dpi exclusivamente en la variedad resistente (Fig. 5c). En conjunto estos resultados sugieren que, si bien parece presentarse una inducción de los genes PR1a, PR9 y MePR1 en la variedad resistente inoculada con Xam a lo largo del tiempo (Fig. 4), esta inducción puede estar explicada en parte por la herida que se realiza durante el proceso de inoculación.

Figura 5