Revisión de tema: Pichia pastoris, una alternativa para la producción de glicoproteínas humanas de uso terapéutico. Estrategias de fermentación

Review: Pichia pastoris represents an alternative for human glycoprotein production for therapeutic use. Fermentation strategies

La producción de proteínas humanas en células de organismos inferiores, mediante tecnología recombinante es una muy prometedora aproximación al tratamiento de muchas enfermedades producidas por la deficiencia de una proteína en particular, entre ellas cerca de 40 enfermedades de almacenamiento lisosomal. Aunque Escherichia coli (E. coli) fue el primer hospedero empleado con éxito para expresar proteínas humanas recombinantes, tiene algunas limitaciones, causadas principalmente por su inhabilidad para hacer algunas modificaciones postraduccionales, como la glicosilación. Debido a esto, la levadura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) fue consi­derada y usada al comienzo para tales propósitos. Sin embargo, S. cerevisiae glicosila proteínas de manera muy diferente a las células humanas y produce proteínas bastante antigénicas; por este motivo algunas otras levaduras no-convencionales, como Pichia pastoris (P. pastoris), han sido usadas recientemente. En este sistema, la expresión de proteínas humanas no está asociada al crecimiento; puede crecer a altas densidades celulares, aumentando la productividad y el rendimiento de la proteína heteróloga; tiene un promotor muy eficiente, inducible por adición de metanol, el cual puede ser usado como única fuente de carbono y energía. Las modificaciones postraduccionales, parecen más semejantes a las células humanas que a las de otros sistemas no mamíferos usados para la producción de glicoproteínas humanas y no secretan considerables cantidades de proteínas endógenas, lo cual simplifica la purificación de la proteína expresada. En esta revisión se presentan estrategias para la producción de proteínas heterólogas en cultivos de alta densidad, empleando P. pastoris como sistema de expresión. Palabras clave: estrategias de fermentación; glicoproteínas humanas; P. pastoris; proteínas recombinantes; fermentation strategies; human glycoprotein; P. pastoris; recombinant protein

Producing human proteins in lower organisms' cells using recombinant technology represents a very promising approach for treating many diseases produced by a particular protein deficiency, including close to 40 lysosomal storage diseases. Although E. coli has been the first host successfully employed in expressing human recombinant proteins, it has some limitations owing to its inability to perform some post-traductional steps such as glycosylation. The yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) has thusbeen initially considered and used. However, S. cerevisiae glycosylates proteins in a very different way to human cells producing highly antigenic proteins and thus some other non-conventional yeasts such as Pichia pastoris have been used recently. Human protein expression is not assodated with growth in this system; growth may occur at high cell concentrations, increasing heterologous protein productivity and yield. The system employs a very efficient, methanol-induced promoter which may be used as sole carbon and energy source. Post-traductional modifications seem more similar to human cells than those produced by other non-mammalian systems used in producing human glycoproteins; they do not secrete large amounts of endogenous proteins, simplifying expressed protein purification. This review presents some strategies for producing heterologous proteins in high density cultures using P. pastoris as an expression system.

	REVISIÓN DE TEMA Pichia pastoris, una alternativa para la producción de glicoproteínas humanas de uso terapéutico. Estrategias de fermentación Review: Pichia pastoris represents an alternative for human glycoprotein production for therapeutic use. Fermentation strategies Henry Córdoba Ruiz*, Néstor Algecira Encizo**, Raúl Poutou Piñales***, Luis Alejandro Barrera Avellaneda**** RESUMEN La producción de proteínas humanas en células de organismos inferiores, mediante tecnología recombinante es una muy prometedora aproximación al tratamiento de muchas enfermedades producidas por la deficiencia de una proteína en particular, entre ellas cerca de 40 enfermedades de almacenamiento lisosomal. Aunque Escherichia coli (E. coli) fue el primer hospedero empleado con éxito para expresar proteínas humanas recombinantes, tiene algunas limitaciones, causadas principalmente por su inhabilidad para hacer algunas modificaciones postraduccionales, como la glicosilación. Debido a esto, la levadura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) fue consi­derada y usada al comienzo para tales propósitos. Sin embargo, S. cerevisiae glicosila proteínas de manera muy diferente a las células humanas y produce proteínas bastante antigénicas; por este motivo algunas otras levaduras no-convencionales, como Pichia pastoris (P. pastoris), han sido usadas recientemente. En este sistema, la expresión de proteínas humanas no está asociada al crecimiento; puede crecer a altas densidades celulares, aumentando la productividad y el rendimiento de la proteína heteróloga; tiene un promotor muy eficiente, inducible por adición de metanol, el cual puede ser usado como única fuente de carbono y energía. Las modificaciones postraduccionales, parecen más semejantes a las células humanas que a las de otros sistemas no mamíferos usados para la producción de glicoproteínas humanas y no secretan considerables cantidades de proteínas endógenas, lo cual simplifica la purificación de la proteína expresada. En esta revisión se presentan estrategias para la producción de proteínas heterólogas en cultivos de alta densidad, empleando P. pastoris como sistema de expresión. Palabras clave: estrategias de fermentación, glicoproteínas humanas, P. pastoris, proteínas recombinantes ABSTRACT Producing human proteins in lower organisms' cells using recombinant technology represents a very promising approach for treating many diseases produced by a particular protein deficiency, including close to 40 lysosomal storage diseases. Although E. coli has been the first host successfully employed in expressing human recombinant proteins, it has some limitations owing to its inability to perform some post-traductional steps such as
	* Ingeniero Químico. Profesor Departamento de Química, Pontificia Universidad Javeriana. Estudiante Maestría en Inge­niería Química, Universidad Nacional de Colombia. Teléfono 320-8320 Ext. 4034. e-mail: hcordoba@javeriana.edu.co ** Magíster en Ingeniería Química. Profesor Departamento de Ingeniería Química , Universidad Nacional de Colombia. Ciudad Universitaria, Facultad de Ingeniería. Teléfono 316-5000 Ext. 14101. e-mail: nalgecira@ing.unal.edu.co *** Magíster en Microbiología. Instituto de Errores Innatos del Metabolismo. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Teléfono 320-8320 Ext. 4024. e-mail: rp000274 @ javeriana.edu.co **** Doctor en Bioquímca. Director Instituto de Errores Innatos del Metabolismo. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Teléfono 320-8320 Ext. 4099. abarrera@javeriana.edu.co Recibido: Febrero 10 de 2003. Aceptado: Julio 30 de 2003.
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	glycosylation. The yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) has thusbeen initially considered and used. However, S. cerevisiae glycosylates proteins in a very different way to human cells producing highly antigenic proteins and thus some other non-conventional yeasts such as Pichia pastoris have been used recently. Human protein expression is not assodated with growth in this system; growth may occur at high cell concentrations, increasing heterologous protein productivity and yield. The system employs a very efficient, methanol-induced promoter which may be used as sole carbon and energy source. Post-traductional modifications seem more similar to human cells than those produced by other non-mammalian systems used in producing human glycoproteins; they do not secrete large amounts of endogenous proteins, simplifying expressed protein purification. This review presents some strategies for producing heterologous proteins in high density cultures using P. pastoris as an expression system. Key words: fermentation strategies, human glycoprotein, P. pastoris, recombinant protein
	INTRODUCCIÓN Desde el descubrimiento del modelo del ADN por Watson y Crick en el año 1953 se ha avanzado mu­cho en su manipulación y las aplicaciones. Numero­sas investigaciones han permitido comprender me­jor cómo portan y transmiten el ADN y otras moléculas la información genética. Desde comienzos del siglo pasado se sabe que algunas enfermedades ocurren debido a fallas metabólicas, por deficiencia en una enzima, proteína ausente o menos activa que la pro­teína normal. Lo anterior se debe a mutaciones en los genes que codifican la síntesis de esas proteí­nas. Este conocimiento ha estimulado a muchos in­vestigadores en la búsqueda de alternativas para el tratamiento de enfermedades genéticas empleando la terapia de reemplazo enzimático. Hasta el momento se ha usado exitosamente la terapia de reemplazo enzimático para las enfermedades de Gaucher, Fabry y se está en las etapas finales de investigación y apro­bación para varias enfermedades más, entre las cua­les se encuentran el síndrome de Hurler, la enferme­dad de Hunter, la de Pompe, la de Morquio A y la de inmunodeficiencia adquirida. El síndrome de Gaucher es una enfermedad lisosomal caracterizada por la acumulación de glucosilceramidas, en concordancia con el hecho de que la glicoproteína glucocerebrosidasa no hidroliza eficientemente esta sustancia a ceramidas y gluco­sa. La disminución de la actividad se debe a una mu­tación del gen q21, que codifica su síntesis y está presente en el cromosoma 1. La terapia para esta enfermedad se aplica con muy buenos resultados, suministrando exógenamente la enzima. La produc­ción industrial a gran escala de la glucocerebrosidasa se efectuó al principio extrayendo la enzima de placenta humana para modificar sus cadenas glicosiladas (alglucerasa). Más tarde se fabricó me-	diante la expresión del ADNc humano en células de ovario de hámster. Esto último hizo posible producir suficiente enzima para el tratamiento permanente de cerca de 4000 personas, con un costo aproximado de US 380.000 por año para una persona de 70 kg (Scriver et al., 1996). Por muchas razones, E. coli fue el organismo seleccionado inicialmente para elaborar proteínas recombinantes humanas, como la insulina. En efec­to, es un organismo unicelular cuya reproducción es asexual, en la mayoría de los casos. Su simplicidad y el conocimiento de su fisiología y genética facilitan la expresión y bajan los costos de producción, me­diante el uso de una fuente de alimento común y es­trategias simples para crecer y mantener el microor­ganismo. El bajo tiempo de replicación de E. coli permite su duplicación en menos de una hora. Se ha presentado, en la literatura, un modelo estructurado que predice simultáneamente su morfología, creci­miento, rendimiento, composición celular, distribu­ción de la ARN polimerasa y la iniciación de la tra­ducción (Paretti etal., 1986). Al igual que otras bacterias, E. colipuede poseer ADN circular y tener uno o varios segmentos adicio­nales, pequeños, de ADN dentro del citoplasma. Es­tos segmentos, llamados plásmidos, son complemen­tos del genoma, los cuales pueden ser aislados y manipulados con facilidad. También pueden ser cons­truidos por ingeniería genética, para contener un gen deseado, y transformar con ellos el microorganismo que produce la proteína foránea, como si ésta fuera nativa. La manera en que el plásmido, un vector de expresión, usa toda la maquinaria de expresión de un organismo se entendió a partir de la comprensión de cómo los bacteriófagos reproducen una bacteria (Sawers etal., 1996).
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	Las proteínas que se pueden expresar en E. coli pueden provenir de bacterias, hongos o de cé­lulas eucariotas. Sin embargo, para que la proteína se produzca, el promotor del gen debe proceder del hospedero o ser funcional en él. Un promotor es un segmento de ADN localizado corriente arriba del gen. El promotor regula cuándo, en qué cantidad y con qué frecuencia se transcribe un gen o conjunto de genes (Sawers et al., 1996). E. coli tiene sus desventajas para la producción de proteínas huma­nas, en razón de que es un procariota y no dispone de mecanismos para la glicosilación de las proteí­nas luego de la traducción. Esta modificación, que forma parte de las llamadas modificaciones postraduccionales, se lleva a cabo en más del 90% de las proteínas de mamíferos (Creeg et al., 1987; Sreekrishna et al., 1989). En eucariotes una proteína es frecuentemente modificada después de su producción inicial. Algu­nas de estas modificaciones pueden ocurrir en dife­rentes organelos, como el retículo endoplasmático o el aparato de Golgi. Estas modificaciones, en mu­chos casos, son necesarias para el plegamiento o para la actividad de la proteína. En efecto, por la comprensión de los biólogos moleculares de la fi­siología y genética de S. cerevisiae, ésta se usó para producir muchas proteínas de mamíferos y aun cuando tiene muchas limitaciones, es uno de los sis­temas de expresión más promisorios para tal efecto (Tschopp et al., 1987; Lin Cereghino et al., 1999; Cregg et al., 1993). Los O-oligosacáridos están compuestos de una variedad de azúcares unidos a las proteínas, entre las que se hallan galactosa, manosa, N-acetilglucosamina y, posiblemente, glucosa, con terminaciones de L-fucosa, N-acetilgalactosamina, ácido siálico y sulfatos. Estas modificaciones pueden afectar su función o el reconocimiento de la proteína para dirigirla a un sitio específico. Así, la adición de un grupo fosfato al cen­tro de nitrógeno, dirige las hidrolasas al lisosoma (Drickamer et al., 1998). En toda célula eucariota la N-glicosilación se inicia en el retículo endoplasmático con la transfe­rencia de una unidad de enlace lipídico-oligosacárido de residuos de manosa y N-acetilglucosamina. Dado que E. coli no glicosila las proteínas en la expresión de proteínas eucarióticas, se han estudiado otros modelos: células de mamíferos, insectos y levadu­ras. De estos tres, las células de levadura son las	más empleadas, puesto que combinan característi­cas de fácil manipulación genética y rápido creci­miento, propio de los organismos procariota, con una maquinaria subcelular que realiza la modificación postraduccional de las proteínas en forma similar a los mamíferos (Lin Cereghino etal., 2002) La estructura de oligosacáridos de la invertasa producida en S. cerevisiae y P. pastoris fue deter­minada y comparada con la estructura de oligo­sacáridos de mamíferos (Tschopp et al., 1987). P. pastoris tiene los mecanismos para adicionar O- N-oligosacáridos a las proteínas secretadas. Los glicanos de la invertasa secretada por P. pastoris no tienen el residuo de oc-1 -3 manosa característica en S. Cerevisiae, el cual produce la alta naturaleza antigénica de las glicoproteínas secretadas por esta última levadura y, por tanto, las hace no aptas para producir sustancias de uso terapéutico. Respecto a los N-oligosascáridos, la ventaja de P. pastoris so­bre S. cerevisiae está en la glicosilación que reali­za, pues ésta se parece más a la que hacen las células humanas. Usando técnicas de perfiles para oligosacáridos, se ha demostrado que las cadenas típicas de proteínas secretadas por P. pastoris son Man8 GlcNAc2 (típica de eucariota superior) y Man9 GlcNAc2 (GlcNAc2= N-actilglucosamina). Se demos­tró que el contenido de carbohidratos para las ca­denas N-oligosacárido parece ser de ocho residuos de manosa por cadena, lo cual hace que la glicosilación sea semejante, al menos en tamaño, a los oligosacáridos de los organismos superiores (Lin Cereghino et al., 2000). Sin embargo, Cregg et al. (1993) advierten en su trabajo que la mayoría de las estructuras de oligosacáridos de la invertasa producida por P. pastoris son diferentes de la de los mamíferos y que es necesario determinar su antigenicidad y la veloci­dad a la cual es eliminada de la circulación. EXPRESIÓN EN CÉLULAS EUCARIOTA Hace treinta y tres años se describió la habilidad de ciertas especies de levaduras para utilizar metanol como única fuente de carbono y energía. Estas leva­duras, llamadas metilotróficas, han llegado a ser los hospederos preferidos para la expresión de genes foráneos (Gellissen, 2000). Una de las especies al­ternativas observada es P. pastoris (Romanos, 1995) (tabla 5).
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	Este microorganismo es capaz de generar mo­dificaciones postraduccionales muy similares a las modificaciones que ocurren en las células humanas. Además, en grandes fermentadores, P. pastoris cre­ce en un medio que consiste en una fuente pura de carbono (glicerol o metanol), biotina, sales, trazas de elementos, agua y no secreta alta cantidad de pro­teínas endógenas; por consiguiente las proteínas foráneas secretadas por el cultivo son relativamente puras, lo que facilita su separación (Lin Cereghino et al., 2000). Uno de los inconvenientes con S. cerevisiae es que no tiene un promotor fuertemente inducible por metanol, del cual sí dispone P. pastoris por ser una levadura metilotrófica. El primer paso metabólico de este organismo en la utilización del metanol es su oxi­dación a formaldehído y peróxido de hidrógeno. Este paso es catalizado por la enzima alcohol oxidasa, AOX. El sitio del gen AOX en el genoma del microorganis­mo es empleado para insertar por homología o por entrecruzamiento un plásmido de levadura, por ejem­plo el pPIC9. Este plásmido contiene el gen de AOX, sobre el cual se hace la inserción del gen que codifica la proteína de interés, como también, un marcador de selección: el gen de histidina deshidrogenasa (HIS4), y la señal de secreción, factor a-MF de S. cerevisiae (Cregg et al., 1985; Cregg et al., 1987; Hollenberg et al., 1997). La expresión de una proteína foránea requiere la inserción del gen en un vector de expresión, para introducirlo en el genoma de una cepa de P. pastoris y, finalmente, identificar mediante el marcador de selección la efectividad de la transformación. En el genoma de P. pastoris existen dos genes alcohol oxidasa, denominados AOX1 y AOX2. Esto hace que se pueda obtener por recombinación cepas con dife­rentes fenotipos: las que tienen un crecimiento rápi­do en metanol MUT +, crecimiento lento en MUTs y las que no crecen en metanol MUT- Cuando la leva­dura crece en glucosa, glicerol o etanol, no se detec­ta la alcohol oxidasa en la célula (Boze et al., 2001; Chauhan et al., 1999; Chiruvolu etal., 1997; Clare et al., 1991; Cregg et al., 1987; Cregg etal., 1989; Cregg et al., 1993; Sreekrishna et al., 1989; Wolf, 1996). Sin embargo, cuando la levadura crece en metanol, esta enzima llega a ser el 35% del total de la proteína celular. El control de la cantidad de alco­hol oxidasa es, en gran parte transcripcional, ya que ningún ARNm de los dos genes es detectable cuan-	do la levadura crece en glicerol (Cregg etal., 1985). Excepto por la cantidad de ARNm presente, mucho más alto ARNm de AOX1 que el de AOX2, los dos genes parecen estar regulados de la misma mane­ra (Cregg et al., 1989). La producción de proteínas foráneas puede ser reprimida hasta cuando el culti­vo esté saturado de células, y la producción de la proteína foránea pueda iniciarse con la inducción del gen (Lin Cereghino etal., 2001). Muchas proteínas foráneas secretadas por S. cerevisiae han mostrado ser antigénicas cuando se introducen en mamíferos, de manera que se ha evi­tado el uso de glicoproteínas sintetizadas a partir de esta levadura con propósito terapéutico. Por el con­trario, las modificaciones postraduccionales efectua­das por P. pastoris son más parecidas a las realiza­das en las células humanas; además, es posible regular la producción de la proteína. Una compara­ción de proteínas foráneas, secretadas por estas dos levaduras, ha mostrado claras diferencias entre la es­tructura del enlace N-oligosacárido adicionado a la proteína (Romanos et al., 1992). En los años ochenta fue desarrollada una cepa de P. pastoris que crece en altas densidades (Phillips Petroleum Co.) (Wegner, 1983). Desde 1988 muchas compañías farmacéuticas y biotecnológicas han obtenido la licencia de la tecnología de P Pastoris (Cregg et al., 1993; Lin Cereghino et al., 2000; Gellissen, 2000). Desde 1990 esta compañía ofrece esta tecnología sin ningún costo para la in­vestigación y uso en universidades y organizacio­nes sin ánimo de lucro, a través de acuerdos de transferencia. Recientemente el modelo, la cepa GS115®, que no expresa la proteína histinidol deshidrogenasa (His) ni el plásmido pPIC9 ®, pue­de obtenerse rápidamente mediante una retribución nominal (Invitrogen Co, en San Diego, USA). Para propósitos comerciales se puede obtener la licencia de esta técnica (Research Corporation Technologies, en Tucson, Arizona) (Wolf, 1996). REVISIÓN DE LAS ESTRATEGIAS DE FERMENTACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS FORÁNEAS EN Pichia pastoris P. pastoris crece bien en medios líquidos y sóli­dos, en una amplia variedad de fuentes de carbo­no. El tiempo de duplicación depende de la fuente de carbono usada: en glucosa es 90 minutos y,
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	aproximadamente, 6 horas en metanol (Wolf, 1996). La productividad de P. pastoris en matraces agitados es típicamente más baja y mejora bas­tante en cultivos efectuados en fermentador. La primera razón de este comportamiento se funda­menta en que sólo en el medio ambiente controla­do de un fermentador, es posible producir el orga­nismo a altas densidades celulares. La segunda razón se soporta en que el nivel de trascripción iniciada por el promotor de A0X1 es superior en células de P. pastoris alimentadas con metanol, a velocidades de crecimiento tales que el cultivo se desarrolle en condiciones controladas de alimen­tación (Wagner et al., 1997; Crowley et al., 2000; Almuzara et al., 2002). El crecimiento a bajos pH, los cuales reducen el riesgo de contaminación microbiana, es considerado una de las ventajas de esta levadura para la produc­ción de proteína celular, con el riego de proteólisis del producto (Wolf, 1996). P. pastoris crece bien en un amplio rango de pH, desde 3 hasta 7, con un mí­nimo efecto sobre la velocidad de crecimiento. Sin embargo, se ha demostrado un efecto significativo sobre las proteínas recombinantes secretadas debi­do a la actividad de las proteasas en el caldo de fer­mentación (Cregg etal., 1993; Inan etal., 1999; Files etal., 2001). El pH se ajusta mediante la adición de hidróxido de amonio, útil como fuente de nitrógeno. Se recomienda que la inducción de la IDS-hr (Iduronato 2-sulfato sulfatasa) se haga a pH de 6, similar al del medio natural donde actúa esta enzi­ma, para no afectar la actividad del producto (Tomatsu, 2002). En el caso de producción intracelular del antígeno de superficie de la Hepatitis B, la adición de trazas de metales (Kl, NaMoO4.2H2O, CoCI2.6H2O a 0.8, 0.2 y 0.5 g/l, respectivamente) puede facilitar la tolerancia de los microorganismos a mayores tiem­pos de retención en el fermentador (Wolf, 1996). Se han hecho estudios acerca de los efectos de la temperatura en la expresión de proteínas foráneas. La temperatura óptima para la producción de un péptido anticoagulante está entre 26 y 30 °C (Inan et al., 1999). Altas concentraciones de glicerol inhiben la ex­presión de proteínas recombinantes en P. pastoris, disminuyendo su productividad o la actividad (Boze et al., 2001; Files et al., 2001). Por tanto, es muy im-	portante el desarrollo de estrategias metodológicas para la fermentación. Estas mejoras incluyen modos de alimentación del sustrato para la producción de la enzima recombinante y el suministro de oxígeno que permita muy altas densidades celulares sin limitacio­nes (d'Anjou etal., 1997). La fermentación se puede llevar a cabo de dos modos: en matraces agitados o en fermentadores. El primer modo de fermentación emplea por lo ge­neral medios mínimos o definidos, la fermentación en matraz agitado se lleva a cabo en dos fases. La primera fase consiste en producir el organismo en glucosa o glicerol con temperatura y agitación con­troladas (tabla 1). La segunda corresponde a la in­ducción de la AOX y producción de la proteína foránea (tabla 2). El segundo modo de fermenta­ción se puede efectuar en forma continua en un quimiostato, así como en lote o lote alimentado. Se encuentran composiciones de medios para el fermentador en la literatura citada y en las diferen­tes tablas presentadas en este artículo. En general las estrategias de fermentación del segundo modo consideran las siguientes fases: una primera fase de crecimiento en glicerol en lote hasta lograr la concentración establecida previamente. Aquí interesa alcanzar con rapidez una alta concentración celular y rendimiento máximo en biomasa; igualmen­te, se mantienen condiciones de cultivo no limitado por oxígeno, ya que P. Pastoris, en estas condicio­nes, puede acumular etanol o acetato en el medio de cultivo, metabolitos que resultan ser fuertes represores de la AOX (Chiruvolu et a/., 1997; Inan et al., 2001; Zhang et al., 2000) (tabla 3). La concentración inicial de sustrato establece la velocidad específica de crecimiento, \x. (h-1), una productividad definida (g de producto /g de biomasa h) y un rendimiento biomasa- sustrato, Yx/s (g de biomasa / g de sustrato). Concentraciones superio­res a aquella que provoca la máxima velocidad de crecimiento, y^^, disminuyen el rendimiento, la velo­cidad específica y, por limitaciones en la transferen­cia de oxígeno, se corre el riesgo de acumular metabolitos producto de la degradación anaerobia. Se inicia una segunda fase de adaptación en lote ali­mentado con la fuente de carbono, utilizada en la fase anterior, para aumentar la productividad al disminuir el tiempo de adaptación a metanol (Chiruvolu et al., 1997; Files etal., 2001) (tabla 4).
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	Se ha mostrado que la concentración del pro­ducto es aproximadamente proporcional a la concen­tración de células en el cultivo. Por tanto, se preten­de trabajar en cultivos de alta densidad. Una vez se alcanza la densidad celular establecida, se inicia la tercera fase, período previo a la inducción, en la cual se hace la inducción del promotor de AOX1 median­te la adición de metanol o mezclas de metanol y la fuente empleada para la fase de crecimiento. Esta fase se realiza en lote alimentado. Un aspecto positi-	vo del comportamiento de P. pastoris en un fermentador está en que los niveles de transcripción del gen de AOX es 3 a 5 veces mayor en células producidas a una velocidad limitada por metanol que en aquellas producidas con exceso de metanol (Un Cereghino et al., 2000). En esta tercera fase se puede decir que existen dos estrategias: inducir por "shock" con metanol, esto es, adicionar una cantidad determinada de metanol
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	al cultivo y esperar a que éste comience a utilizarlo. Esto último se puede observar en la demanda de oxígeno. Finalmente, en la cuarta fase o de produc­ción, se alimenta metanol en flujo continuo o en pul­sos exponenciales (tabla 6). En estas dos últimas fases se debe controlar la concentración de metanol en el medio de acuerdo con los fenotipos emplea­dos, por su diferencia a la tolerancia de este sustrato. El monitoreo de oxígeno permite definir en qué momento se efectúa la inducción, puesto que una vez se agota la fuente de carbono primaria, la con-	centración de oxígeno aumenta abruptamente. Como el metabolismo del metanol emplea oxígeno a altas velocidades, la expresión de genes foráneos es afec­tada de modo positivo por el suministro de oxígeno. De la misma manera, cuando comienza a ser utiliza­do el metanol como fuente de carbono, se puede observar una disminución en el oxígeno disuelto. El evento de inducción es crítico, ya que si la inducción se hace en un momento inapropiado (antes de ago­tarse la fuente primaria de carbono o mucho después), o si el suministro de metanol es excesivo o muy limi­tado, la respuesta puede ser muy lenta, lo que afecta
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	el desarrollo del cultivo y la expresión de la proteína foránea (Rodríguez el al., 1997). Por otro lado, modificando la estrategia de ali­mentación de los sustratos, el sistema de producción de P. pastoris permite obtener mayores valores en pro­ductividad y actividad de las proteínas foráneas ex­presadas. Esto se consigue iniciando la fermentación en lote hasta el agotamiento de la fuente de carbono más usada, el glicerol. Luego, continúa el crecimiento celular, alimentando glicerol a una velocidad limitada por el sustrato, para consumir metabolitos como acetato y etanol que inhiben la expresión del gen. Estas dos estrategias permiten aumentar la den­sidad celular, puesto que se requiere alcanzar los más altos valores de masa celular para incrementar la pro­ductividad (tabla 5). En una segunda fase de producción, se debe lograr la mayor expresión del gen de AOX. Esto se puede conseguir con alimentación previa del nuevo sustrato, metanol, en una rampa decreciente, hasta cuando el consumo de oxígeno se incremente. Esta estrategia permite disminuir los tiempos de adapta-	ción de la levadura al nuevo sustrato y, con ello, au­mentar la productividad. Ahora se debe inducir el gen, alimentando metanol a una velocidad tal que su con­centración en el caldo de fermentación sea constan­te. Hace falta estudiar cómo afecta la productividad y la actividad de una proteína específica la forma de alimentar el metanol: continua o en pulsos (Lin Cereghino et al., 2002; Chiruvolu etal., 1997;Files et al., 2001; Rodríguez et al,. 1997; Zhang etal.,2000). Por lo general todos los estudios referidos indi­can que la biomasa alcanzada antes de la inducción de la proteína recombinante está cerca de 52 gra­mos de células por litro. Cuanto mayor sea la canti­dad de células que deban adaptarse al nuevo sustrato, metanol, y por tanto que inician la transcrip­ción del gen AOX, mayor será la producción de la proteína recombinante. Sin embargo, este mecanis­mo tiene una limitante: la demanda de oxígeno, la cual se incrementa con la densidad celular y conlle­va exigencias para la transferencia de oxígeno desde el gas burbujeado, generalmente aire o éste mismo enriquecido con oxígeno, al caldo de fermentación. La transferencia se puede mejorar, para un fermentador ya diseñado, incrementando el flujo de aire y la agita-

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	ción, lo cual produce mayor espuma y la necesaria incorporación de antiespumantes aprobados por la FDA o normas similares para tal efecto (Jahic et al., 2002). Esta levadura crece bien con otros sustratos como monosacáridos, alcoholes y aminoácidos (Wolf, 1996). El empleo de medios no definidos y de bajo costo, como melazas, además de exigir la hidrólisis previa de disacáridos, incrementa los costos de puri­ficación del producto. En la producción de enzimas humanas, por su alto valor agregado, se justifica el empleo de medios mínimos como los encontrados en la literatura (Lin Cereghino et al., 2000). CONCLUSIONES A partir de esta revisión se concluye que las mejores condiciones para producir una proteína recombinante, en el modelo de expresión P. pastoris, con un fermentador agitado son: temperatura 30 °C, pH para la fase de inducción cercano al valor que tiene en el medio natural en el cual actúa la enzima, menor a 7.0 y concentración de oxígeno disuelto mayor de 20%. Asimismo, se consideran cuatros fases para la fermentación: una primera fase, de crecimiento en lote durante 24 horas, y una previa a la inducción, en lote alimentado con flujo de alimentación exponencial, durante una hora, en glicerol y solución básica de sales, hasta conseguir densidades cercanas a 50 gramos en peso seco de células por litro. La tercera fase, de adaptación, en lote alimentado con flujo exponencial, durante dos horas, con metanol y una solución básica de sales. Finalmente, una cuarta fase de producción, en lote alimentado durante 72 horas con el mismo alimento de la fase anterior, emplean­do diferentes estrategias, por ejemplo, flujo constan­te o incrementado en pulsos. P. pastoris es un buen sistema para expresar glicoproteínas humanas de uso terapéutico. Sin em­bargo, una vez obtenida la proteína recombinante, es necesario iniciar ensayos de laboratorio y prue­bas clínicas para estudiar la glicosilación del produc­to y su direccionamiento a las células blanco. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a Elizabeth López, Ph.D., pro­fesora del Departamento de Química de la Universi­dad Nacional de Colombia por sus orientaciones y comentarios y a Alfonso López, M.S.c. estudiante de	Doctorado del IBT, Universidad Nacional Autónoma de México, por sus indicaciones. BIBLIOGRAFÍA Almuzara, C; Cos, O.; Baeza, M.; Gabriel, D.: Valero, F. 2002. Metanol determination in Pichia pastoris cultures by flow injection análisis. Biotechnology letters, 24:413-417. Boze, H.; Celine, L; Patrick, Ch.; Fabien, R.; Christine, V.; Yves C: Guy, M. 2001. High-level secretory production of recombinant porcine follicle-stimulating hormone by Pichia pastoris. Process Biochemistry, 36: 907-913. Chauhan, A.K.; Arora, D.; Khanna, N. 1999. A novel feeding strategy for enhanced protein production by fed-batch fermentation in recombinant Pichia pastoris. Proc. Biochem. 34: 139-145. Chiruvolu, V.; Cregg, J.M.; Meagher, M.M. 1997. 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