Publicado

2011-07-01

Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae)

Palabras clave:

Culture medium, explants, genotype, plant growth regulators, regeneration, Explante, genotipo, medio de cultivo, regeneración, reguladores de crecimiento (es)

Autores/as

  • María Viñas Docente
  • Víctor M. Jiménez Docente

Título en ingles: Factors affecting in vitro somatic embryogenesis of palms (Arecaceae)

Resumen

La embriogénesis somática (ES) es una vía de desarrollo in vitro que presenta una serie de ventajas sobre otras técnicas utilizadas para la regeneración de palmas. Esta técnica tiene gran potencial para superar las limitaciones observadas al tratar de propagar clonalmente estas plantas utilizando yemas basales. A pesar de la conocida recalcitrancia que presentan las palmas al cultivo in vitro, si se utilizan los reguladores de crecimiento apropiados, el tipo y el estado de desarrollo del explante adecuados, así como genotipos con buena respuesta, es muy probable que se obtengan buenos resultados. Esto ha sido demostrado parcialmente en Phoenix dactylifera (palma dátil), Elaeis guineensis (palma aceitera), Bactris gasipaes (pejibaye) y Cocos nucifera (coco). También se ha logrado generar protocolos eficientes en otras palmas menos estudiadas, como Geonoma gamiova (una palma ornamental), Euterpe edulis (palmito dulce) y Areca catechu (palma de betel). La inducción de ES se ha conseguido principalmente con el uso de auxinas. De ellas, la que se ha utilizado con más frecuencia es el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), aunque en algunos casos (como en pejibaye y palma aceitera) se ha usado picloram y dicamba, también con buenos resultados. Los explantes más utilizados han sido inflorescencias, ápices y segmentos basales de hojas, todos con un estado de desarrollo incipiente. También se ha visto que el tamaño del explante y el medio de cultivo juegan un papel importante en la respuesta. En este trabajo se presenta una recopilación de los trabajos más importantes sobre ES en esta familia de plantas y del efecto de varios factores sobre su establecimiento y desarrollo.

Palabras clave: Explante; genotipo; medio de cultivo; regeneración; reguladores de crecimiento

Abstract

Somatic embryogenesis (SE) is an in vitro developmental pathway that exhibits a number of advantages over other techniques for regeneration of palms. This technique has great potential to overcome the limitations observed when trying to propagate these plants clonally using basal buds. Despite the known recalcitrance of palms for in vitro culture, good results can be obtained by using the appropriate growth regulators, explant type and developmental stage, as well as responsive genotypes. This has been partially observed in Phoenix dactylifera (date palm), Elaeis guineensis (African oil palm), Bactris gasipaes (peach palm) and Cocos nucifera (coconut). Efficient protocols have been also generated in less-studied palms, such as Geonoma gamiova (an ornamental palm), Euterpe edulis (Assai palm) and Areca catechu (areca palm). Induction of  SE has been achieved mainly through the use of auxins. Of these, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) has been used most frequently, although in some cases (such as in peach palm and African oil palm) picloram and dicamba have been employed also with good results. The most commonly used explants are young inflorescences, apical buds and leaf-basal segments. Explant size and culture medium also play an important role in obtaining good results. This review presents a compilation of the most important publications on SE in this plant family and the effect of various factors on induction and development of this pathway.

Key words: Culture medium; explants; genotype; plant growth regulators; regeneration

ARTÍCULO DE REVISIÓN

Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae)

Factors affecting in vitro somatic embryogenesis of palms (Arecaceae)

María Viñas1 , Víctor M. Jiménez2

1M.Sc., CIGRAS, Universidad de Costa Rica e-mail: maria.vinas@ucr.ac.cr
2Ph.D., CIGRAS, Universidad de Costa Rica e-mail: victor.jimenez@ucr.ac.cr

Recibido: abril 13 de 2011 Aprobado: noviembre 24 de 2011

Resumen

La embriogénesis somática (ES) es una vía de desarrollo in vitro que presenta una serie de ventajas sobre otras técnicas utilizadas para la regeneración de palmas. Esta técnica tiene gran potencial para superar las limitaciones observadas al tratar de propagar clonalmente estas plantas utilizando yemas basales. A pesar de la conocida recalcitrancia que presentan las palmas al cultivo in vitro, si se utilizan los reguladores de crecimiento apropiados, el tipo y el estado de desarrollo del explante adecuados, así como genotipos con buena respuesta, es muy probable que se obtengan buenos resultados. Esto ha sido demostrado parcialmente en Phoenix dactylifera (palma dátil), Elaeis guineensis (palma aceitera), Bactris gasipaes (pejibaye) y Cocos nucifera (coco). También se ha logrado generar protocolos eficientes en otras palmas menos estudiadas, como Geonoma gamiova (una palma ornamental), Euterpe edulis (palmito dulce) y Areca catechu (palma de betel). La inducción de ES se ha conseguido principalmente con el uso de auxinas. De ellas, la que se ha utilizado con más frecuencia es el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), aunque en algunos casos (como en pejibaye y palma aceitera) se ha usado picloram y dicamba, también con buenos resultados. Los explantes más utilizados han sido inflorescencias, ápices y segmentos basales de hojas, todos con un estado de desarrollo incipiente. También se ha visto que el tamaño del explante y el medio de cultivo juegan un papel importante en la respuesta. En este trabajo se presenta una recopilación de los trabajos más importantes sobre ES en esta familia de plantas y del efecto de varios factores sobre su establecimiento y desarrollo.

Palabras clave: Explante, genotipo, medio de cultivo, regeneración, reguladores de crecimiento

Abstract

Somatic embryogenesis (SE) is an in vitro developmental pathway that exhibits a number of advantages over other techniques for regeneration of palms. This technique has great potential to overcome the limitations observed when trying to propagate these plants clonally using basal buds. Despite the known recalcitrance of palms for in vitro culture, good results can be obtained by using the appropriate growth regulators, explant type and developmental stage, as well as responsive genotypes. This has been partially observed in Phoenix dactylifera (date palm), Elaeis guineensis (African oil palm), Bactris gasipaes (peach palm) and Cocos nucifera (coconut). Efficient protocols have been also generated in less-studied palms, such as Geonoma gamiova (an ornamental palm), Euterpe edulis (Assai palm) and Areca catechu (areca palm). Induction of SE has been achieved mainly through the use of auxins. Of these, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) has been used most frequently, although in some cases (such as in peach palm and African oil palm) picloram and dicamba have been employed also with good results. The most commonly used explants are young inflorescences, apical buds and leaf-basal segments. Explant size and culture medium also play an important role in obtaining good results. This review presents a compilation of the most important publications on SE in this plant family and the effect of various factors on induction and development of this pathway.

Key words: Culture medium, explant, genotype, plant growth regulators, regeneration.


Introducción

La embriogénesis somática (ES) es un proceso que implica la formación de embriones a partir de células somáticas vegetales (Von Arnold et al., 2002). Estos embriones poseen, al igual que los embriones cigóticos, una estructura bipolar con ápices de tallo y de raíz (Lelu et al., 1993). Algunos autores indican que los embriones somáticos tienen un origen unicelular (Carman, 1990; Terzi and Lo Schiavo, 1990), mientras que otros proponen orígenes tanto unicelular como multicelular (Perera et al., 2007, Gahan and George, 2008).

Para que ocurra la reprogramación en una célula somática y esta comience a diferenciar un embrión, su patrón de expresión génica debe cambiar (Dodeman et al., 1997; Low et al., 2008). Es probable que esta regulación génica se deba a factores epigenéticos como la metilación del ADN (Von Arnold, 2008) y compactaciones o descompactaciones en la disposición de la cromatina (Fehér et al., 2003). Según Von Arnold et al. (2002), los reguladores de crecimiento, principalmente las auxinas, juegan un papel muy importante en la transducción de señales para desencadenar un patrón de expresión génica determinado. De todas las auxinas, el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), utilizado en la mayoría de los casos para la inducción de ES, es el que promueve la hipermetilación del ADN con mayor facilidad (Terzi and Lo Shiavo, 1990; Causevic et al., 2005).

Los embriones somáticos in vitro pueden provenir de células que pasaron por un proceso de desdiferenciación, como en callos o suspensiones celulares, en lo que se conoce como ES indirecta o, sin pasar por ese proceso de desdiferenciación, en lo que se denomina ES directa (Von Arnold, 2008).

Las palmas, con cerca de 3500 especies, constituyen un grupo particular de plantas tropicales y subtropicales, con crecimiento exclusivamente primario (Tomlinson, 2006). Su importancia económica las sitúa únicamente detrás de las gramíneas entre todos los grupos de plantas. Se utilizan como fuente de alimento, abrigo, tejidos y combustible, principalmente en los trópicos (Glimn-Lacy and Kaufman, 2006). En palmas, la mayoría de los estudios mencionan la ocurrencia de ES indirecta, que permite la producción de una progenie más numerosa, tal y como se ha observado en palma dátil ( Phoenix dactylifera ), palma aceitera (Elaeis guineensis ), palma de betel (Areca catechu ) y coco (Cocos nucifera ) (Rajesh et al., 2003; Konan et al., 2006; Pérez-Núñez et al., 2006; Te-chato and Hilae, 2007; Wang et al., 2010). Según Gueye et al. (2009), la formación de callo es un prerrequisito indispensable en palma dátil para la inducción de ES. Sin embargo, debido a este paso previo, muchas veces las plantas resultantes presentan cierto grado de variación somaclonal. Según Jaligot et al., (2000) y Lucia et al., (2011), esa variación es ocasionada por factores epigenéticos en palma aceitera y se manifiesta principalmente como deformaciones durante el desarrollo floral. En esta especie, sin embargo, Sanputawong and Te-chato (2011) no observaron variación somaclonal en las plantas propagadas mediante ES indirecta, utilizando marcadores moleculares SSR (Repeticiones de Secuencia Simple).

Al igual que en muchas otras especies, en palmas el proceso de regeneración de plantas mediante ES se divide en varias etapas. En cada una existen variaciones en cuanto a las condiciones de cultivo, los reguladores de crecimiento, los medios de cultivo utilizados, entre otras (Von Arnold et al., 2002). Las cuatro etapas generales de la ES indirecta (la más común en palmas, como se mencionó anteriormente) son:

• Callo proembriogénico (CP): donde se establece el estímulo celular para que inicie la ES y se forme la masa de células proembriogénicas. La etapa de CP implica una división asimétrica de las células en respuesta a reguladores de crecimiento, usualmente auxinas. Además, se caracteriza por una acidificación del citoplasma y de la pared celular en las células con capacidad embriogénica.

• Desarrollo proembriogénico (DP): se fomenta el crecimiento de la masa proembriogénica formada anteriormente.

• Maduración de proembriones (MP): se estimula la conversión de proembriones a embriones. Durante esta etapa los embriones somáticos comienzan a acumular productos de reserva. En muchos casos la maduración del embrión requiere la deshidratación previa.

• Desarrollo de embriones (DE): se estimula el crecimiento de los embriones, que pasan por las etapas características de su desarrollo (globular, escutelar y coleoptilar) hasta que se convierten en pequeñas plantas completas (germinación de embriones).

La capacidad para producir embriones somáticos está genéticamente predeterminada (Von Arnold et al., 2002), por lo que la respuesta ante tratamientos varía según la especie con la cual se esté trabajando. En palmas la inducción de embriones es difícil mientras que en otras especies, como Daucus carota , la ES ocurre fácilmente cuando los tejidos se colocan en el medio de cultivo adecuado (Von Arnold, 2008).

La multiplicación de palmas por medio de ES puede ser importante, ya que muchas de estas monocotile-dóneas perennes producen muy pocos hijos basales y estos son difíciles de enraizar (Eke et al., 2005; Asemota et al., 2007; Othmani et al., 2009). Asemota et al. (2007) afirman que incluso algunos genotipos de palma dátil nunca producen hijos basales.

La recalcitrancia que presentan las palmas al cultivo in vitro es ampliamente conocida. Aun así, muchos autores mencionan haber desarrollado protocolos eficientes para la inducción de ES in vitro en palmas, como en el caso de palma dátil (Eke et al., 2005; Al-Khayri, 2005; Asemota et al., 2007), palma aceitera (Rajesh et al., 2003; Konan et al., 2006; Konan et al., 2007), Bactris gasipaes -pejibaye (De Almeida and Vieira, 2006; Steinmacher, 2007abc) y coco (Verdeil et al., 1994; Chan et al., 1998). Otras palmas menos estudiadas son: Geonoma gamiova (una palma ornamental) (Dias et al., 1994), Euterpe edulis (palmito dulce) (Guerra and Handro, 1988; Guerra and Handro, 1998) y palma de betel (Wang et al., 2003; Karun et al., 2004; Wang et al., 2006).

Los aspectos que más influyen sobre la ES en palmas, así como en otras especies vegetales, en orden de importancia, son: los reguladores de crecimiento, el tipo de explante, el genotipo, el estado de desarrollo del explante, el medio de cultivo y el tamaño del explante (Badawy et al., 2005; Asemota et al., 2007; Steinmacher et al., 2007a; Gueye et al., 2009; Perera et al., 2009). A continuación se presentará un resumen de los principales estudios en palmas realizados hasta el momento para determinar la influencia que ejercen cada uno de estos factores sobre la ES.

Factores que influyen sobre la ES en palmas

Reguladores de crecimiento

En todas las familias de plantas, incluyendo la Arecaceae, el aspecto más importante para combatir la recalcitrancia durante el cultivo in vitro es la selección adecuada de los reguladores de crecimiento que se incorporan en el medio de cultivo (Benson, 2000). Al respecto, es muy importante tener en cuenta que los explantes se encuentran bajo el control de reguladores de crecimiento tanto endógenos como exógenos y que el balance de estos es el que determina el resultado final (Jiménez, 2005). Por ejemplo, Jiménez et al. (2005) mostraron la participación de las hormonas endógenas en la respuesta embriogénica en zanahoria, mientras que, en palma dátil, Othmani et al. (2009) determinaron que la aplicación exógena de reguladores de crecimiento es indispensable para la producción de callo embriogénico. Esa interacción entre reguladores de crecimiento exógenos y hormonas endógenas ha sido estudiada previamente en varias especies (Jiménez, 2005).

Tanto en palmas como en otras familias de plantas, las auxinas son los reguladores de crecimiento más ampliamente utilizados para inducir callo con potencial embriogénico. De las auxinas disponibles, la más utilizada es el 2,4-D (Fehér et al., 2003; Phillips, 2004). A continuación se detallarán los reguladores de crecimiento más utilizados en palmas durante cada una de las etapas de la ES descritas anteriormente:

Etapa CP : en palmas, la auxina utilizada con más frecuencia para esta etapa es el 2,4-D (Verdeil et al., 1994; Ledo et al., 2002; Eke et al., 2005; Saldanha et al., 2006; Gueye et al., 2009), aunque picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico) y/o dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico) se han utilizado tam- bién en pejibaye (Steinmacher et al., 2007abc, Maciel et al., 2010, Steinmacher et al., 2011), Areca catechu (Karun et al., 2004; Wang et al., 2010) y palma aceitera (Kramut and Te-chato, 2010; Scherwinski-Pereira et al., 2010; Thuzar et al., 2011; Sanputawong and Techato, 2011) con buenos resultados. Recientemente se ha observado la expresión diferencial de transcritos en suspensiones celulares de palma aceitera de acuerdo con el tipo y concentración de auxina utilizada en esta etapa (Roowi et al., 2010). Aunque en la mayoría de los casos se han utilizado concentraciones altas de 2,4- D durante esta etapa (>100 µM), Thi-Lan et al. (1999) observaron que concentraciones mayores a 90,5 µM de este regulador de crecimiento inhibieron por completo la inducción de callo embriogénico en Phoenix canariensis "Canary Island". En palma aceitera el uso de bajas concentraciones de 2,4-D (5 µM), junto con Picloram (1 µM), produjo la mejor respuesta en cuanto a inducción de callo embriogénico utilizando hojas inmaduras como explante (Yusnita, 2011).

Algunos autores han utilizado, además de auxina, citoquininas como la BAP (6-bencilaminopurina) (22,2 µM) (Zouine and El Hadrami, 2007) y la 2ip (N6 -(2-iso- penteniladenina)) en bajas concentraciones (15 µM) (Veramendi and Navarro, 1997; Al-Khayri, 2001; Badawy et al., 2005; Eke et al., 2005; Eshraghi et al., 2005) o bien tidiazurón (9 - 90 µM), también con buenos resultados (Perera et al., 2009; Sidky and Zaid, 2011). El uso solo de esta última citoquinina en altas concen- traciones provocó la inducción de embriogénesis directa sin previa producción de callo en palma aceitera (Sidky and Zaid, 2011). Es importante tener en cuenta que el uso de citoquininas en altas concentraciones podría aumentar la acumulación de compuestos fenólicos y por tanto, afectar negativamente la inducción y el crecimiento de los embriones somáticos en palmas (Abohatem et al., 2011)

Azpeitia et al. (2003), con la utilización de explantes de plúmula de coco, mostraron que el uso del brasinoesteroide brassinolide antes de la etapa CP (3 a 7 días), ayuda a aumentar la respuesta ante el 2,4-D, actuando de forma sinergística con otras auxinas, como se ha observado en diversas plantas (Nakamura et al., 2003).

Etapa DP : en esta etapa generalmente se elimina por completo del medio de cultivo la auxina utilizada durante la etapa CP, o bien se reduce su concentración (Thomas and Rao, 1985; Valverde et al., 1989; Verdeil et al., 1994; Fki et al., 2003; Othmani et al., 2009; Perera et al., 2009). Al respecto, es importante destacar que subcultivos sucesivos en medio de cultivo con altas concentraciones de auxinas durante la etapa DP pueden provocar que, posteriormente durante la etapa DE, se inhiba el desarrollo de los embriones. Esto fue observado por Aberlenc-Bertossi et al. (1999) y Guerra y Handro (1998) en palma aceitera y Euterpe edulis , respectivamente. Por otro lado, en Areca ca-techu , subcultivos sucesivos en medio suplementado con dicamba llevaron a la formación de embriones somáticos anormales (Wang et al., 2010).

Al-Khayri (2001) utilizó altas concentraciones de 2ip (148 µM) y bajas concentraciones de ANA (ácido naftalenacético) (54 µM) en palma dátil, mientras que Pérez-Núñez et al. (2006) redujeron la concentración de 2,4-D de 600 µM a 6 µM y adicionaron 300 µM de BAP en coco. Con este último procedimiento, los autores generaron altas cantidades de embriones (9,8 millones de embriones/100 plúmulas). En Phoenix ca-nariensis la mejor combinación de reguladores de crecimiento para esta etapa fue 2,26 µM de 2,4-D, 0,83 µM de kinetina (6-furfurilaminopurina) y 2 µM de ABA (ácido abscísico) (Thi-Lan et al., 1999).

Etapa MP : A diferencia lo que se realiza comúnmente con otras especies, en las cuales durante esta etapa se eliminan completamente los reguladores de crecimiento del medio de cultivo (Dudits et al., 1991; Komamine et al., 1992; Von Arnold et al., 2002), en palmas, luego de su formación, los proembriones se subcultivan directamente en un medio de cultivo con los reguladores de crecimiento utilizados para la etapa DE (Eshraghi et al., 2005; Steinmacher et al., 2007c; Othmani et al., 2009). Sin embargo, en contraste con lo anterior, Konan et al. (2010) lograron conservar embriones somáticos de palma aceitera por al menos 20 años en medio desprovisto de reguladores de crecimiento. También obtuvieron porcentajes de regeneración de alrededor de 30% en varios genotipos.

Etapa DE: en el caso de las palmas, como se mencionó anteriormente, la maduración del embrión, es decir, su conversión hacia plantas completas, requiere, en la mayoría de los casos, del uso de reguladores de crecimiento. No existe ningún regulador de crecimiento utilizado con mayor frecuencia, aunque el ABA (1 mg/L) ha mostrado ser efectivo en coco (Fernando and Gamage, 2000; Perera et al., 2007), palma dátil (Zouine et al., 2005; Othmani et al., 2009; Sghaier et al., 2009) y Phoenix canariensis (Huong et al., 1999; Thi-Lan et al., 1999). Sghaier-Hammami et al. (2010) mostraron que la adición de ABA en el medio de cultivo incrementa significativamente el contenido de proteína dentro de los tejidos, principalmente proteínas abundantes durante la embriogénesis tardía (LEA) implicadas en la protección del embrión a la desecación. Thi Lan et al. (1999) mostraron, además, que el medio de cultivo adicionado solamente con BAP, kinetina o 2ip inhibió por completo el desarrollo de los embriones, mientras que Yusnita (2011) utilizó BAP durante esta etapa en palma aceitera logrando un buen desarrollo de los embriones

Perera et al. (2009) utilizaron BAP (5 µM), en conjunto con 2ip (5 µM), en el medio de cultivo durante esta etapa y lograron aproximadamente un 85% de conversión de embriones de coco. Estos autores mostraron, además, que la inclusión de ácido giberélico (AG3) (0,45 µM) al medio de cultivo fomentó considerablemente la maduración de embriones de esta planta, mientras que la adición de ABA no favoreció la maduración. El efecto positivo del AG3 en la formación y germinación de embriones somáticos también fue observado por Montero-Córtes et al. (2010) en esta misma especie.

Además, otros autores han utilizado auxinas en esta etapa con buenos resultados (Al-Khayri, 2003; Othmani et al., 2009). Al-Khayri (2003) utilizó ácido indol- 3-butírico (AIB) (0,98-1,97 µM) y obtuvo entre un 80 y un 90% de germinación de embriones somáticos de palma dátil, comparado con la misma concentración de ANA, con la cual se lograron apenas entre un 40 y 60% en la germinación de los embriones.

Una excepción a lo anterior es el caso de palma aceitera, en la cual Scherwinski-Pereira et al. (2010) lograron la conversión a plantas completas eliminando en su totalidad los reguladores de crecimiento del medio de cultivo.

Tipo de explante

Existen algunos tejidos que responden mejor a los tratamientos para inducción de ES que otros. Para lograr la regeneración de embriones somáticos en plantas monocotiledóneas es muy importante la selección de explantes que contengan regiones meristemáticas (Benson, 2000). Es por ello que en palmas comúnmente se utiliza tejido somático inmaduro, como es el caso de inflorescencias, ápices y secciones basales de hojas. En algunos casos también se ha reportado el uso de raíces, como por ejemplo las provenientes de plantas de Areca catechu en cultivo in vitro (Wang et al., 2006). Estos autores encontraron mayor formación de callo embriogénico en raíces que en hojas y tallos.

Se ha observado que la respuesta embriogénica puede variar, aun en una misma especie de palma, según e tipo de tejido utilizado. Por ejemplo, en algunas es pecies la mejor respuesta se logra con inflorescencias mientras que en otras, se logra con el uso de hojas Thuc et al. (2011) encontraron, en palma aceitera, un posible marcador molecular (el transcripto Eg707) que permite identificar estadios tempranos de ES en los ex plantes, ya que se expresa mayoritariamente en tejido con potencial embriogénico. Esto permitiría descartar explantes sin esperar hasta que ocurra una respuesta visible, ahorrando de esta forma tiempo y recursos.

Los embriones cigóticos responden muy bien a varios tratamientos para inducir ES, tal y como lo mostraron Huong et al. (1999) y Thi-Lan et al. (1999) en Phoenix canariensis y Teixeira et al. (1993) en palma aceitera. Al comparar la respuesta entre embriones cigóticos y ápices, los primeros presentaron significativamente mayor potencial para la formación de callo embriogénico. Sin embargo, en muchos casos la aplicación de la metodología desarrollada para un explante, en este caso embriones cigóticos, no lleva a los mismos resultados en otros tejidos (Chan et al., 1998).

Chan et al. (1998) y Azpeitia et al. (2003) utilizaron plúmulas provenientes de embriones en frutos de coco y obtuvieron buenos rendimientos (>50%) en la formación de embriones. Los cambios morfológicos e histológicos que ocurren durante este proceso fueron descritos y caracterizados posteriormente (Sáenz et al., 2006). En palma aceitera, Thomas and Rao (1985) utilizaron solamente la sección basal de la hoja para la inducción de ES, logrando que un 50% de los explantes produjeran callo embriogénico.

En pejibaye y coco se ha reportado el uso de inflorescencias, ya que en estas dos especies la ES a partir de ápices y hojas no es sencilla (Valverde et al., 1989; Verdeil et al., 1994; Steinmacher et al., 2007a). En coco, además se han utilizado ovarios no fertilizados para la inducción de ES con buenos resultados (Perera et al., 2007; Perera et al., 2009). En este último caso, el callo embriogénico se formó a partir del carpelo del ovario, por lo que las plantas obtenidas fueron diploides. El uso de plántulas de Hyophorbe lagenicaulis, palma en peligro de extinción, con tres semanas de edad, seccionadas de forma longitudinal y cultivadas en medio MS (Murashige and Skoog, 1962), con 3 mg/l 2,4-D indujo la formación de embriones somáticos de forma directa; sin embargo, no fue posible aclimatarlos en el suelo (Sarasan et al., 2002).

Badawy et al. (2005) utilizaron ápices, yemas axilares y hojas de palma dátil, aplicaron los mismos tratamientos en todos los tipos de explante, y encontraron que el explante que mejor respondió ante los tratamientos fue el ápice, seguido de la yema axilar. En esta especie no es común el uso de inflorescencias como explante para la inducción de ES. También en palma dátil, Veramendi and Navarro (1997) utilizaron diferentes explantes para la inducción de callo embriogénico (tejido subapical, ápices y yemas de la planta, además de ápices, bases y fragmentos de las hojas) y observaron que los ápices y las yemas de la planta así como las bases de las hojas produjeron la mayor cantidad de callo, donde los dos primeros tuvieron rendimientos de entre 96 y 100% en la formación de callo.

Teixeira et al. (1994) utilizaron inflorescencias inmaduras de palma aceitera y lograron la inducción de callo embriogénico luego de 81 semanas de cultivo. Sin embargo, la mayoría de los explantes se oxidaron. Es probable que por ello los tejidos más utilizados en esta especie sean las hojas jóvenes provenientes de plantas adultas (Schwendiman et al., 1988; De Touchet et al., 1991; Lucia et al., 2011; Thuc et al., 2011). Guerra y Handro (1998) utilizaron embriones, inflorescencias y hojas para la producción de embriones somáticos en Euterpe edulisx ; sin embargo, solamente con los dos primeros lograron producción de plantas completas. También se han utilizado anteras de coco para inducir callo embriogénico, embriones somáticos y, posteriormente, regeneración de plantas, aunque con una frecuencia de únicamente 7% (Perera et al., 2008).

El cuadro 1 resume la composición de reguladores de crecimiento en algunos de los casos más exitosos reportados hasta el momento en palmas durante cada etapa, excepto la MP, en la cual, como se detalló anteriormente, no hay variaciones en el medio de cultivo ya que los explantes son subcultivados directamente a medio de cultivo suplementado con los reguladores de crecimiento característicos de la etapa DE. Además, se indica el tipo de explante utilizado, ya que, como se mencionó anteriormente, es el segundo factor más importante para la inducción de ES en palmas.

Genotipo

En la familia Arecaceae se ha observado la influencia del genotipo sobre la respuesta embriogénica en las especies más estudiadas: pejibaye, coco, palma dátil y palma aceitera. En pejibaye, por ejemplo, inflorescencias de varios genotipos presentaron respuestas significativamente diferentes a los mismos tratamientos durante la inducción de ES (Steinmacher et al., 2007a). En palma dátil el número de embriones somáticos formados fue significativamente diferente en dos cultivares expuestos a los mismos tratamientos de concentraciones y tipos de reguladores de crecimiento (Zouine and El Hadrami, 2007). En coco, Verdeil et al. (1994) encontraron respuesta diferencial al 2,4-D durante la etapa CP en los tres genotipos utilizados.

En palma dátil la etapa CP depende en gran medida del genotipo (Gueye et al. 2009). Esta sería la principal limitante para la propagación de genotipos importantes de esta especie. Eshraghi et al., (2005) demostraron que dos cultivares iraníes de palma dátil respondieron de diferente manera en todas las etapas. En ese caso solamente uno de los cultivares (Khanizi) logró alcanzar la etapa MP. Sumado a esto, Al-Khayri and AlBahrany (2004) reportaron diferencias en la respuesta ante diferentes concentraciones de AgNO3 durante la etapa DP en diferentes genotipos de palma dátil. El AgNO3 se ha utilizado para favorecer la ES en especies como maíz (Songstad et al., 1991) gracias a su acción como inhibidor de la actividad del etileno (Kumar et al., 1998). Se ha reportado que el etileno también puede inhibir la respuesta morfogénica in vitro en Passiflora edulis (Kumar et al., 2009) y zanahoria (Tisserat and Murashige, 1977). Por otro lado, Zouine and El Hadrami (2004) mostraron que dos genotipos de palma dátil respondieron de forma significativamente diferente ante distintas dosis de sacarosa durante la etapa DP. Mientras que Aslam et al. (2011) y Al-Khayri (2011a) mostraron que la respuesta durante todas las etapas de la ES fue diferente entre los genotipos de palma dátil evaluados.

En palma aceitera también se ha reportado influencia del genotipo en la maduración de los embriones durante la etapa MP con el uso de BAP. En este caso, solamente algunos clones respondieron positivamente al tratamiento con diferentes concentraciones de esta citoquinina (Aberlenc-Bertossi et al., 1999).

El efecto tan determinante del genotipo en la respuesta embriogénica ha impedido definir un protocolo particular que se pueda aplicar en forma general para una misma especie de palmas. Lo anterior probablemente está relacionado con la alta diversidad genética presente en los miembros de esta familia de plantas, que se ve acentuada por el hecho de que la propagación por semilla, producto muchas veces de un proceso de polinización abierta, predomina sobre la propagación vegetativa (Elshibli and Korpelainen, 2008). Solo se conocen protocolos para la embriogénesis somática de variedades específicas en el caso de palma dátil (Fki et al., 2003; Eke et al., 2005; Eshraghi et al., 2005).

Estado de desarrollo del explante

La capacidad que posee una célula o grupo de células para convertirse en embriogénica también depende de su estado fisiológico y de diferenciación (Gueye et al., 2009). Los tejidos maduros, por ejemplo, presentan un mayor grado de metilación del ADN, lo que provo- ca una baja capacidad de desdiferenciación (Terzi and Lo Schiavo, 1990).

En el caso de palma dátil, Gueye et al. (2009) realizaron un estudio histológico de diferentes secciones de hoja y determinaron que en el segmento basal existe una zona de división celular, seguida de una zona de elongación celular (segmento intermedio), para terminar en una zona de maduración (segmento distal). De esa forma los autores encontraron que únicamente los segmentos intermedios de las hojas, donde se ubica la zona de elongación celular, fueron los que respondieron ante el tratamiento con 2,4-D para lograr la inducción de callo embriogénico.

En el caso de las inflorescencias, los resultados obtenidos al utilizar diferentes estados de desarrollo varían de acuerdo con la especie. En el caso de coco, Verdeil et al. (1994) mostraron que las inflorescencias con mayor respuesta embriogénica fueron aquellas con un mayor desarrollo (tamaño de espata = 45 cm); mientras que en pejibaye fueron las inflorescencias con menor desarrollo (tamaño de espata = 5-8 cm) (Steinmacher et al., 2007a), lo cual refuerza lo dicho anteriormente sobre el papel del genotipo en la respuesta embriogénica.

Perera et al. (2007) utilizaron ovarios sin fertilizar de coco en diferentes estados de desarrollo para inducir ES. Estos fueron numerados desde 0 a -6, donde 0 co- rrespondió al estado de desarrollo maduro (inflorescencia que abrió primero) y -6 al estado de desarrollo más inmaduro (inflorescencia que abrió aproximadamente seis meses después). Sin embargo, no encontraron resultados consistentes en cuanto a la influencia del estado de desarrollo del ovario sobre la inducción de callo embriogénico en los diferentes tratamientos utilizados. Los ovarios con estado de desarrollo más avanzado respondieron mejor cuando las concentraciones de auxina fueron mayores (100-200 µM de 2,4-D), mientras que los estados con menor desarrollo respondieron mejor ante concentraciones menores de auxina (50 µM de 2,4-D).

Samosir et al. (1998) encontraron que la mayor cantidad de embriones cigóticos de coco que produjeron callo embriogénico fueron los inmaduros (> 40%) con 10 meses de edad, mientras que solamente un 10% de los embriones maduros con 12 meses de edad produjeron callo embriogénico.

Medios de cultivo

Tipos de medios de cultivo

En la mayoría de los casos se ha utilizado medio de cultivo sólido durante todas las etapas descritas anteriormente; sin embargo, el uso de suspensiones celulares durante la etapa DE ha fomentado la obtención de embriones somáticos, tanto en palma aceitera (De Touchet et al., 1991, Aberlenc-Bertossi et al., 1999) como en palma dátil (Bhaskaran and Smith, 1992; Veramendi and Navarro, 1996; Fki et al., 2003; Zouine et al., 2005; Badawy et al., 2009). El cultivo de células de palma aceitera en biorreactor también ha sido reportado con anterioridad; sin embargo, sin indicar si estas eran embriogénicas (Gorret et al., 2004). Recientemente, Steinmacher et al. (2011) observaron mayor formación de embriones somáticos de pejibaye y mayor crecimiento de las plántulas formadas al utilizar un sistema de inmersión temporal que cuando se utilizó medio sólido. Sin embargo, la sobrevivencia al momento de realizar la aclimatación fue mayor en las plantas cultivadas en medio sólido. Khawnium y Te-chato (2011) mostraron que es posible la criopreservación por medio de vitrificación de tejido embriogénico friable proveniente de hojas jóvenes de palma aceitera, logrando más de 65% de formación de embriones somáticos.

Para una misma especie, la literatura reporta generalmente el uso de un mismo medio de cultivo basal para todo el proceso, en algunos casos con ciertas variaciones. Paranjothy y Othman (1982) afirman que en palma aceitera el uso de un medio de cultivo con una formulación estándar de nutrientes como el MS es suficiente para la inducción de callo. Además, en esta misma especie, Da Silva Guedes et al. (2011) observaron una mayor formación de callo embriogénico en los explantes cultivados en medio de cultivo MS que en los cultivados en medio de cultivo Y3 (Eeuwens 1976). También Thuzar et al. (2011) mostraron que, en comparación con el MS, una mayor cantidad de los explantes de esta misma especie, cultivados en el medio N6 (Chu et al., 1975), produjeron callo embriogénico.

En el caso de palma dátil, el medio de cultivo más utilizado incluye las sales y vitaminas de MS (Al-Khayri, 2001; Fki et al., 2003; Eke et al., 2005; Othmani et al., 2009; Eshraghi et al., 2005). Sin embargo, en algunos casos se ha utilizado el MS adicionado con las vitaminas de Morel y Wetmore (1951) (Sané et al., 2006). Recientemente, en esta especie Al-Khayri (2011b) indicó que es importante realizar variaciones en el medio de cultivo según la etapa de ES, ya que se observó que un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de callo embriogénico no necesariamente coincide con el medio de cultivo óptimo para la regeneración de los embriones.

En el caso de coco (Gupta et al., 1984; Verdeil et al., 1994, Adkins et al., 1998) y Acrocomia aculeata (Ferreira et al., 2009), se ha utilizado preferencialmente el medio de cultivo Y3. En pejibaye se ha preferido el MS adicionado con las vitaminas de Morel y Wetmore (1951) (Steinmacher et al., 2007ab). El medio de cultivo CRI 72 (Karunaratne y Periyapperuma, 1989) fue utilizado con éxito en embriones inmaduros y ovarios de coco (Karunaratne y Periyapperuma, 1989; Perera et al., 2009).

Sin embargo, también existen informes de que cambiar el medio de cultivo a lo largo del desarrollo del proceso embriogénico puede ser beneficioso. Así, Verdeil et al. (1994) utilizaron inflorescencias de coco cultivadas en el medio de cultivo Y3 adicionado con las vitaminas de Morel y Wetmore (1951) durante la etapa CP. Posteriormente, para las siguientes tres etapas (DP, MP y DE), utilizaron la sales y vitaminas del medio de cultivo MS pero con las concentraciones aumenta- das al doble. Para una aproximación más precisa, Dussert et al. (1995) analizaron la absorción de nutrientes específicos durante el inicio de la ES en coco, y encontraron que nitrato, calcio, magnesio y sacarosa fueron los requeridos en mayor cantidad.

Debido a que la maduración del embrión (etapa MP) requiere la deshidratación previa, en algunas ocasiones es posible utilizar medios de cultivo con mayor concentración de solutos, utilizando diversos agentes osmóticos, como azúcares y polietilenglicol (Von Arnold et al., 2002).

Uso de antioxidantes

En palmas, la oxidación de los tejidos en cultivo in vitro es un problema recurrente (Sugimura and Salvaña, 1989; Teixeira et al., 1994; Al-Khayri, 2005; Steinmacher et al., 2007c; Sáenz et al., 2010). Este podría ser uno de los motivos más determinantes para la reduci-da regeneración vegetativa in vitro de esta familia de plantas.

El carbón activado es utilizado comúnmente para disminuir los problemas de oxidación durante el proceso de ES en palmas. Sin embargo, este compuesto puede adsorber ciertos componentes importantes del medio de cultivo, como los reguladores de crecimiento y otros compuestos orgánicos, lo que podría afectar la respuesta morfogénica (Pan and van Staden, 1998). La adsorción de reguladores de crecimiento por parte del carbón activado fue demostrada por Ebert and Taylor (1990). Estos autores encontraron que el 2,4-D es adsorbido por el carbón activado en forma dependiente de la consistencia del medio de cultivo. Cuando se agregó una concentración intermedia de 2,4-D (100 µM) y 2,5 g/l de carbón activado, un día después de preparado el medio de cultivo, la cantidad de 2,4-D disponible en el medio de cultivo líquido fue de 3,6%, mientras que en medio de cultivo semisólido, la cantidad disponible de 2,4-D fue de 5-6%.

Huong et al. (1999) y Thi-Lan et al. (1999) reportaron que la adición de carbón activado durante la etapa CP inhibió completamente la formación de callo embriogénico en Phoenix canariensis. Por el contrario, Sáenz et al. (2010) afirman que el carbón activado también actúa positivamente sobre la ES en coco por razones que aún se desconocen y Samosir et al. (1998) encontraron que la presencia de carbón activado en el medio de cultivo es necesaria para promover la ES en coco.

Según Sáenz et al. (2010), la capacidad de adsorción del carbón activado depende también de la marca comercial. Ellos observaron que la formación de callo embriogénico en coco varió significativamente dependiendo de la marca de carbón activado que se utilizó.

En la mayoría de los trabajos publicados en palmas, el carbón activado es eliminado durante las etapas finales de la ES (Verdeil et al., 1994; Fki et al., 2003; Steinmacher et al., 2007c). En otros casos se utiliza durante todas las etapas de la ES (Eshraghi et al., 2005; Steinmacher et al., 2007a) y en pocos casos, no se usa del todo (Badawy et al., 2005; Wang et al., 2006). Sugimura y Salvaña (1989) y Samosir et al. (1998) reportaron que, en los casos en los cuales no se agregó carbón activado al medio de cultivo, se observó oxidación en todos los explantes de inflorescencias de coco.

El uso de PVP (polivinilpirrolidona) no es comúnmente reportado en la literatura sobre ES en palmas. Da Silva Guedes et al. (2011) observaron que este compuesto no influyó sobre la respuesta embriogénica en inflorescencias de palma aceitera, lo cual sí sucedió cuando se utilizó carbón activado.

Otros aditivos

Algunos autores mencionan los beneficios del uso de otros componentes en el medio de cultivo durante las diferentes etapas de la ES en palma, tales como vitaminas, aminoácidos, diferentes concentraciones y tipos de fuentes de carbono, entre otros. La adición de biotina y tiamina durante la etapa DP ayudó a aumentar significativamente el peso de los callos embriogénicos y el tamaño y número de embriones obtenidos en palma dátil (Al-Khayri, 2001). También en esta especie, la adición de glutamina (0,67 mM) favoreció significativamente el número de embriones somáticos producidos (Zouine and El Hadrami, 2007), mientras que el uso de AgNO3, junto con 2ip, ha resultado favorable para el crecimiento de los callos embriogénicos, pero también para la elongación de los embriones durante la etapa DE (Al-Khayri and Al-Bahrany, 2001).

En coco, Adkins et al. (1998) mostraron que la adición de poliaminas (espermidina-0,5 µM y putrescina-7,5 µM) en el medio de cultivo redujo la producción de etileno y, con ello, lograron un aumento significativo en la producción de embriones somáticos. Mientras que en palma dátil, Al-Khayri (2010) mostró que la adición de 10-15% de agua de coco al medio de cultivo durante todas las etapas, hasta la germinación de los embriones, influyó positivamente en el crecimiento del callo embriogénico y en el número de embriones somáticos obtenidos. La caseína hidrolizada también favoreció el crecimiento de los callos embriogénicos y la producción de embriones somáticos en palma dátil (Al-Khayri, 2011a).

Badawy et al. (2009), por su parte, evaluaron el uso de diferentes concentraciones de varias vitaminas para aumentar el grado de globuralización de los embriones somáticos durante la etapa DE en palma dátil. Ellos mostraron que este parámetro se favorece cuando se agrega tiamina-HCl, piridoxina y ácido nicotínico al medio de cultivo, mientras que la adición de biotina no mostró ser efectiva. De ellas, la vitamina que más influyó positivamente sobre el número de embriones somáticos obtenidos fue la tiamina (7,4 µM).

Veramendi and Navarro (1996) y Badawy et al. (2005) encontraron que la concentración óptima de sacarosa para la formación de embriones somáticos en palma dátil fue de 30 g/l. Cuando se redujo la concentración a 15-20 g/l o se aumentó a 40-60 g/l, el número de embriones obtenidos se redujo considerablemente. De la misma forma y también en palma dátil, Zoudine and El Hadrami (2004) mostraron que existe un aumento significativo de la masa proembrionaria durante la etapa DP cuando se utiliza una concentración de sacarosa de 30 g/l, comparado con concentraciones de 15 y 60 g/l. También en esa especie y similar a los resultados anteriores, Asemota et al. (2007) mostraron que una concentración de sacarosa de 30 g/l era suficiente para una inducción adecuada de callo embriogénico. Además de la sacarosa como fuente de carbono, Kramut y Techato (2010) utilizaron 0,2 M de sorbitol durante la etapa DE en palma aceitera. Ellos observaron un aumento significativo en la cantidad de embriones somáticos obtenidos. Mientras que Te-chato and Hilae (2007), en esa misma especie, reportaron que la mejor fuente de carbono para la inducción de ES secundaria fue el sorbitol (0,2 M), comparado con las mismas concentraciones de manitol, sacarosa, fructuosa y glucosa.

El tipo de gelificante agregado al medio de cultivo también puede influir en las etapas finales de la ES, como lo mostraron Wong et al. (1997) en palma aceitera. Según estos autores, el Gelrite favoreció el desarrollo de los embriones (etapa DE) ya que con este gelificante se obtuvo mayor cantidad de embriones que con el uso de agar.

Tamaño del explante

El tamaño del explante es otro de los factores que puede afectar la respuesta embriogénica en palmas. En general, los tamaños más pequeños responden mejor ante los diferentes tratamientos, probablemente porque existe una mayor cantidad de células expuestas al medio de cultivo, lo cual provoca un mayor estrés que fomenta el metabolismo celular (Fehér et al. 2003). Gueye et al. (2009) afirman que, en hojas de palmas, el callo emerge a partir de las células perivasculares. El seccionamiento de los explantes hasta alcanzar tamaños pequeños, permitiría que una mayor cantidad de células perivasculares se encuentren en contacto con los componentes del medio de cultivo y, por tanto, respondan con mayor facilidad.

Existen pocos estudios en palmas en los que se ha evaluado el efecto del tamaño del explante sobre su respuesta. En estos se han utilizado hojas como fuente de material vegetal. En palma aceitera, Othmani et al. (2009) mostraron que la mayor cantidad de callo embriogénico se obtuvo con los explantes más pequeños (5-10 mm) de hoja. Mientras que en pejibaye (Steinmacher et al., 2007c) y palma aceitera (Scherwinski-Pereira et al., 2010) se ha utilizado exitosamente la técnica conocida como TCL (capas delgadas de células, por sus siglas en inglés), la cual consiste en utilizar explantes muy pequeños (0,7-1,0 mm) obtenidos a partir de diferentes partes de la planta (Silva, 2003).

Conclusiones

La ES in vitro representa una alternativa para la propagación clonal de palmas con gran potencial para superar los problemas de propagación vegetativa que presenta esta familia de plantas. Aunque son muchos los factores que influyen sobre la ES en este grupo vegetal, su manejo adecuado ha permitido la obtención de buenos resultados en varias especies, como en el caso de palma dátil, coco y palma aceitera. Al respecto, es muy importante tener en cuenta que los tres factores que más han influido sobre la respuesta embriogénica en palmas son: los reguladores de crecimiento, el tipo de explante y el genotipo. Una vez evaluado y definido el efecto de estos tres factores para una determinada especie y variedad, el correcto manejo de factores adicionales (estado de desarrollo, tamaño del explante y medio de cultivo) permite aumentar la eficiencia del proceso.

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Cómo citar

APA

Viñas, M. y Jiménez, V. M. (2011). Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae). Revista Colombiana de Biotecnología, 13(2), 229–242. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/28028

ACM

[1]
Viñas, M. y Jiménez, V.M. 2011. Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae). Revista Colombiana de Biotecnología. 13, 2 (jul. 2011), 229–242.

ACS

(1)
Viñas, M.; Jiménez, V. M. Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae). Rev. colomb. biotecnol. 2011, 13, 229-242.

ABNT

VIÑAS, M.; JIMÉNEZ, V. M. Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae). Revista Colombiana de Biotecnología, [S. l.], v. 13, n. 2, p. 229–242, 2011. Disponível em: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/28028. Acesso em: 28 mar. 2024.

Chicago

Viñas, María, y Víctor M. Jiménez. 2011. «Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae)». Revista Colombiana De Biotecnología 13 (2):229-42. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/28028.

Harvard

Viñas, M. y Jiménez, V. M. (2011) «Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae)», Revista Colombiana de Biotecnología, 13(2), pp. 229–242. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/28028 (Accedido: 28 marzo 2024).

IEEE

[1]
M. Viñas y V. M. Jiménez, «Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae)», Rev. colomb. biotecnol., vol. 13, n.º 2, pp. 229–242, jul. 2011.

MLA

Viñas, M., y V. M. Jiménez. «Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae)». Revista Colombiana de Biotecnología, vol. 13, n.º 2, julio de 2011, pp. 229-42, https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/28028.

Turabian

Viñas, María, y Víctor M. Jiménez. «Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae)». Revista Colombiana de Biotecnología 13, no. 2 (julio 1, 2011): 229–242. Accedido marzo 28, 2024. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/28028.

Vancouver

1.
Viñas M, Jiménez VM. Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae). Rev. colomb. biotecnol. [Internet]. 1 de julio de 2011 [citado 28 de marzo de 2024];13(2):229-42. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/28028

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