Indução e histologia de embriões somáticos primários e secundários do híbrido Phalaenopsis Classic Spotted Pink (Orchidaceae)

Induction and Histology of Primary and Secondary Somatic Embryos of Phalaenopsis Hybrid Classic Spotted Pink (Orquidaceae)

O presente trabalho teve como objetivos induzir a formação de embriões somáticos in vitro no híbrido Phalaenopsis Classic Spotted Pink, utilizando diferentes meios nutritivos e avaliar a morfologia interna desses embriões através de análises histológicas e histoquímicas. Folhas jovens de plantas cultivadas in vitro foram utilizadas como explantes e dessas folhas foram retiradas as bordas, ficando segmentos de aproximadamente 1cm². Para indução foram utilizados meios nutritivos contendo ANA (0,1 mg L-1) e BAP (1 mg L^-1), acrescido de phytagel e com pH 5,8 (meio TM 07) e ANA (0,1 mg L-1) e TDZ (3 mg L^-1) acrescido de gelrite e com pH 5,2 (meio TC06-1). Embriões somáticos primários foram obtidos aos 90 dias de cultivo no meio TC06-1 e foram transferidos para o mesmo meio para obtenção de embriogênese secundária. Os embriões somáticos obtidos foram transferidos para meio MS com metade da força iônica, sem regulador de crescimento e cultivados em fotoperíodo de 16 horas, o qual estimulou a produção de clorofila tanto nos embriões primários como secundários, promovendo o desenvolvimento desses em protocormos e posteriormente em plantas. As análises histológicas permitiram confirmar o caráter embrionário das estruturas formadas in vitro, demonstrando que os embriões somáticos foram formados diretamente das camadas epidérmicas dos explantes, sem passar pela fase de calo, caracterizando embriogênese somática direta. Os métodos histoquímicos utilizados, possibilitaram evidenciar a deposição de compostos orgânicos nas células embriogênicas em decorrência de mecanismos fisiológicos, permitindo o desenvolvimento dos embriões primários e secundários em plantas.

The present work had as objectives to induce the formation of somatic embryos in vitro on Phalaenopsis hybrid Classic Spotted Pink, using different nutrient medium and assess the internal morphology of these embryos by means of histological and histochemical analysis. Young leaves of plants grown in vitro were used as explants for induction of somatic embryos in different nutrient medium: New Dogashima Medium, containing ANA (0.537 mM) and BAP (4.440 mM) plus phytagel and with pH 5.8 (NDM) and the Murashige & Skoog with half the concentration of salts, plus NNA (0.537 mM) and TDZ (13.621 mM), jellied with gelrite and pH 5.2 (0.5 MS). Primary somatic embryos were obtained to 90 days of cultivation in half MS and have been transferred to the same means for obtaining of secondary embryos. The primary and secondary somatic embryos were subcultived for MS with half the concentration of salts, without fitoregulator subjected to photoperiod of 16 hours, which stimulated the production of chlorophyll in primary embryos as secondary, promoting the development of those in protocorms and later in plants. The histological analysis showed that the somatic embryos were formed directly from the epidermal layers of the explants, without going through the phase of callus, featuring direct somatic embryogenesis. The histochemical methods used made it possible to highlight the deposition of starch and lipids in cells embriogenics as a result of physiological mechanisms, enabling the development of primary and secondary embryos in plants. Therefore, the medium 0.5 MS Plus ANA (0.537 mM) and TDZ (13.621 mM), jellied with gelrite and pH 5.2 promoted to obtain primary and secondary embryos with ability to regenerate plants showing morphological similar the mother plant.

El presente trabajo tuvo como objetivos inducir la formación de embriones somáticos in vitro en el híbrido Phalaenopsis Classic Spotted Pink, utilizando diferentes medios nutritivos, y evaluar la morfología interna de estos embriones mediante análisis histológico e histoquímico. Hojas jóvenes de plantas cultivadas in vitro se utilizaron como explantes para la inducción de embriones somáticos en diferentes medios nutritivos: New Dogashima Medium, contenido de ANA (0.537 mM) y BAP (4.440 mM) además de phytagel y con pH 5.8 (NDM) y el Murashige Skoog con la mitad de la concentración de sales, además de ANA (0.537 mM) y TDZ (13.621 mM), gelificado gelrite y pH 5.2 (½ MS). Se obtuvieron embriones somáticos primarios a los 90 días de cultivo en el medio ½ MS y a estos se les transfirió al mismo medio (½ MS) para la obtención de embriones secundarios. Los embriones somáticos primarios y secundarios fueron subcultivados para MS con la mitad de la concentración de sales, sin reguladores de crecimiento y sometidos a fotoperiodo de 16 horas, lo que estimuló la producción de clorofila tanto en los embriones primarios como en los secundarios, promoviendo el desarrollo de los protocormos y más tarde en las plantas. Los análisis histológicos demostraron que los embriones somáticos fueron formados directamente en las capas epidérmicas de los explantes, sin pasar por la fase de callo, vía embriogénesis somática directa. Los métodos histoquímicos hicieron posible destacar la deposición de almidón y lípidos en las células embriogénicas como resultado de mecanismos fisiológicos, que permiten el desarrollo de los embriones primarios y secundarios en las plantas. Por lo tanto, el medio ½ MS contenido de ANA (0.537 mM) y TDZ (13.621 mM), con gelrite y pH 5.2 permitió obtener embriones primarios y secundarios con capacidad para regenerar plantas con caracteres morfológicos similares a los dela planta matriz.

DOI: https://doi.org/10.15446/abc.v21n3.50032

INDUÇÃO E HISTOLOGIA DE EMBRIÕES SOMÁTICOS PRIMÁRIOS E SECUNDÁRIOS DO HÍBRIDO Phalaenopsis CLASSIC SPOTTED PINK (ORQUIDACEAE)

Inducción e histología de embriones somáticos primarios y secundarios del híbrido Classic Spotted Pink (Orquidaceae)

Cláudia ULISSES¹; João Alves Ferreira PEREIRA²; Simone Sampaio SILVA²; Emília ARRUDA³; Marciana MORAIS⁴.

¹ Departamento de Biologia, Área Botânica, Prédio Dárdano de Andrade Lima, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos. Recife, Pernambuco, Brasil.
² Departamento de Biologia, Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos. Recife, Pernambuco, Brasil.
³ Centro de Biociências, Departamento de Botânica, Área Anatomia Vegetal, Universidade Federal de Pernambuco. Av. Professor Moraes Rego, 1235-Cidade Universitária, Recife, Pernambuco, Brasil.
⁴ Centro de Biociências, Laboratório de Genômica e Proteômica de Plantas, Universidade Federal de Pernambuco. Av. Professor Moraes Rego, 1235-Cidade Universitária, Recife, Pernambuco, Brasil.

For correspondence. claulisses@gmail.com

Received: 21^st October 2015, Returned for revision: 22^nd February 2016, Accepted: 14^th March 2016.
Associate Editor: Cristiano Buzatto.

Citation/Citar este artículo como: Ulisses C, Pereira JAF, Silva SS, Arruda E, Morais M. Indução e histologia de embriões somáticos primários e secundários do híbrido Phalaenopsis Classic Spotted Pink (Orquidaceae). Acta biol. Colomb. 2016;21(3):571-580. DOI: https://doi.org/10.15446/abc.v21n3.50032

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RESUMO

O presente trabalho teve como objetivos induzir a formação de embriões somáticos in vitro no híbrido Phalaenopsis Classic Spotted Pink, utilizando diferentes meios nutritivos e avaliar a morfologia interna desses embriões por meio de análises histológicas e histoquímicas. Folhas jovens de plantas cultivadas in vitro foram utilizadas como explantes para indução de embriões somáticos em diferentes meios nutritivos: New Dogashima Medium, contendo ANA (0,537μM) e BAP (4,440μM), acrescido de phytagel e com pH 5,8 (NDM) e o Murashige & Skoog com a metade da concentração dos sais, acrescido de ANA (0,537μM) e TDZ (13,621μM), gelificado com gelrite e o pH 5,2 (½ MS). Embriões somáticos primários foram obtidos aos 90 dias de cultivo no meio ½MS e foram transferidos para o mesmo meio para obtenção de embriões secundários. Os embriões somáticos primários e secundários foram subcultivados para meio MS com metade da concentração de sais, sem fitoregulador submetidos a fotoperíodo de 16 horas, o qual estimulou a produção de clorofila tanto nos embriões primários como secundários, promovendo o desenvolvimento desses em protocormos e posteriormente em plantas. As análises histológicas demonstraram que os embriões somáticos foram formados diretamente das camadas epidérmicas dos explantes, sem passar pela fase de calo, caracterizando embriogênese somática direta. Os métodos histoquímicos utilizados possibilitaram evidenciar a deposição de amido e lipídeos nas células embriogênicas em decorrência de mecanismos fisiológicos, permitindo o desenvolvimento dos embriões primários e secundários em plantas. Portanto, o meio ½ MS acrescido de ANA (0,537μM) e TDZ (13,621μM), gelificado com gelrite e o pH 5,2 promoveu a obtenção de embriões primários e secundários com capacidade para regenerar plantas apresentando características morfológicas semelhantes a planta matriz.

Palavras-chave: anatomia, cultivo in vitro, histoquímica, orquídea.

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ABSTRACT

The present work had as objectives to induce the formation of somatic embryos in vitro on Phalaenopsis hybrid Classic Spotted Pink, using different nutrient medium and assess the internal morphology of these embryos by means of histological and histochemical analysis. Young leaves of plants grown in vitro were used as explants for induction of somatic embryos in different nutrient medium: New Dogashima Medium, containing ANA (0.537 μM) and BAP (4.440 μM) plus phytagel and with pH 5.8 (NDM) and the Murashige & Skoog with half the concentration of salts, plus NNA (0.537 μM) and TDZ (13.621 μM), jellied with gelrite and pH 5.2 (0.5 MS). Primary somatic embryos were obtained to 90 days of cultivation in half MS and have been transferred to the same means for obtaining of secondary embryos. The primary and secondary somatic embryos were subcultived for MS with half the concentration of salts, without fitoregulator subjected to photoperiod of 16 hours, which stimulated the production of chlorophyll in primary embryos as secondary, promoting the development of those in protocorms and later in plants. The histological analysis showed that the somatic embryos were formed directly from the epidermal layers of the explants, without going through the phase of callus, featuring direct somatic embryogenesis. The histochemical methods used made it possible to highlight the deposition of starch and lipids in cells embriogenics as a result of physiological mechanisms, enabling the development of primary and secondary embryos in plants. Therefore, the medium 0.5 MS Plus ANA (0.537 μM) and TDZ (13.621 μM), jellied with gelrite and pH 5.2 promoted to obtain primary and secondary embryos with ability to regenerate plants showing morphological similar the mother plant.

Keywords: anatomy, histochemistry in vitro cultivation, orchid.

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RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivos inducir la formación de embriones somáticos in vitro en el híbrido Phalaenopsis Classic Spotted Pink, utilizando diferentes medios nutritivos, y evaluar la morfología interna de estos embriones mediante análisis histológico e histoquímico. Hojas jóvenes de plantas cultivadas in vitro se utilizaron como explantes para la inducción de embriones somáticos en diferentes medios nutritivos: New Dogashima Medium, contenido de ANA (0.537 mM) y BAP (4.440 μM) además de phytagel y con pH 5.8 (NDM) y el Murashige Skoog con la mitad de la concentración de sales, además de ANA (0.537 μM) y TDZ (13.621 μM), gelificado gelrite y pH 5.2 (½ MS). Se obtuvieron embriones somáticos primarios a los 90 días de cultivo en el medio ½ MS y a estos se les transfirió al mismo medio (½ MS) para la obtención de embriones secundarios. Los embriones somáticos primarios y secundarios fueron subcultivados para MS con la mitad de la concentración de sales, sin reguladores de crecimiento y sometidos a fotoperiodo de 16 horas, lo que estimuló la producción de clorofila tanto en los embriones primarios como en los secundarios, promoviendo el desarrollo de los protocormos y más tarde en las plantas. Los análisis histológicos demostraron que los embriones somáticos fueron formados directamente en las capas epidérmicas de los explantes, sin pasar por la fase de callo, vía embriogénesis somática directa. Los métodos histoquímicos hicieron posible destacar la deposición de almidón y lípidos en las células embriogénicas como resultado de mecanismos fisiológicos, que permiten el desarrollo de los embriones primarios y secundarios en las plantas. Por lo tanto, el medio ½ MS contenido de ANA (0.537 μM) y TDZ (13.621 μM), con gelrite y pH 5.2 permitió obtener embriones primarios y secundarios con capacidad para regenerar plantas con caracteres morfológicos similares a los dela planta matriz.

Palabras clave: anatomia, cultivo in vitro, histoquímica, orquídea.

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INTRODUÇÃO

A família Orchidaceae pertencente à ordem Asparagales é considerada a maior família em número de espécies de monocotiledôneas (Stevens, 2001), No Brasil, ocorrem 2440 espécie, agrupadas em 240 gêneros, com cerca de aproximadamente 1635 espécies endêmicas (Barros et al., 2013).

As orquídeas possuem uma distribuição cosmopolita (Batista et al., 2005), apresentando indivíduos de hábitos terrestres, epífitos, rupícolas, saprofíticos (Shiraki e Diaz, 2012) e subterrâneos (Raven et al., 2014).

Dentre as orquídeas, o gênero Phalaenopsis está entre os mais populares e de maior valor comercial (Lee, 2011), compreende cerca de 66 espécies, em sua maioria epífitas, monopodiais e com folhas suculentas (Tsai et al., 2003). Apresentam colorações, tamanhos e formatos variados provenientes do processo de hibridação, com excelente aceitação no mercado de flores, pois responde bem à indução floral e possui flores com uma longa durabilidade, podendo durar até três meses (Vaz e Kerbauy, 2005; Lee, 2011). Sua propagação vegetativa é lenta, pois a formação de brotos laterais não é comum, sendo a reprodução por sementes a mais utilizada (Minamiguchi e Machado Neto, 2007). As mudas provenientes de sementes não apresentam uma uniformidade morfológica e genética, dessa forma as plantas produzidas vegetativamente podem oferecer maior fidelidade genética (Ishii et al., 1998). Por se tratar de uma planta monopodial, a utilização do ápice caulinar contendo o meristema apical para induzir a propagação vegetativa in vitro, promove a morte da planta. Sendo assim, se faz necessário à indução da morfogênese in vitro a partir de regiões da planta que não comprometam ou impossibilitem a existência da planta matriz (Minamiguchi e Machado Neto, 2007).

A embriogênese somática (ES) conhecida também como embriogênese adventícia ou assexual, é uma técnica de micropropagação que vem sendo utilizada por muitas espécies de plantas. A ES consiste no processo em que células haploides ou somáticas passam por diferentes estádios embriogênicos dando origem a uma planta, sem que ocorra a fusão de gametas (Williams e Maheswaran, 1986). Esse processo pode ocorrer por via direta ou indireta. A embriogênese por via direta, ocorre quando a primeira expressão morfogênica é o surgimento de estruturas globulares diretamente no explante, as quais apresentam-se geralmente brancas e translúcidas, caracterizando em embriões somáticos. Enquanto a embriogênese somática indireta, inicia-se com uma diferenciação das células do explante formando calos, que são normalmente brancos e translúcidos, convencionalmente designados de massas ou complexos celulares pró-embriogênicos, os quais se dividem e formam embriões somáticos (Guerra et al., 1999).

Independentemente do padrão direto ou indireto, as células-mães embriogênicas apresentam um conjunto de características comuns ao comportamento de células embrionárias em processo de divisão. Estas características incluem o tamanho pequeno (100-200μm) das células, conteúdo citoplasmático denso, apresentando núcleo com volume considerado em relação as outras organelas celulares e com nucléolos proeminentes, vacúolos pequenos, caracterizando células jovens e presença de grãos de amido. As propriedades histoquímicas destas células sugerem intensa atividade metabólica e de síntese de RNA (Guerra et al., 1999).

A embriogênese somática secundária (ESS) ocorre quando novos embriões são formados a partir de embriões somáticos primários (Uzelac et al., 2007; Karami et al., 2008). Há algumas vantagens nesse processo quando comparado à embriogênese somática primária, tais como: a taxa elevada de multiplicação, a independência de uma fonte de explante e a repetibilidade de formação de embriões (Vasic et al., 2001).

Desse modo, a embriogênese somática, como técnica para propagação clonal, tem sido tema de diferentes estudos, em especial, com abordagens morfológicas e histológicas, para melhor entendimento da caracterização das estruturas iniciais e do desenvolvimento embriogênico em plantas superiores (Quiroz-Figueroa et al., 2006). Para compreender e avaliar a formação e a viabilidade dos embriões somáticos, se faz necessário identificar a ultraestrutura dos mesmos por meio de análises histológicas e histoquímicas.

Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo induzir a formação de embriões somáticos in vitro no híbrido Phalaenopsis Classic Spotted Pink, utilizando meios nutritivos capazes de induzir ES no gênero Phalaenopsis, e avaliar a morfologia interna desses embriões somáticos por meio de análises histológicas e histoquímicas.

MATERIAIS E MÉTODOS

Indução de embriogênese primária

Inicialmente foram utilizadas folhas jovens, com tamanho aproximado de 3 cm, de plantas cultivadas in vitro do híbrido Phalaenopsis Classic Spotted Pink, mantidas in vitro por 90 dias. Foram retiradas as bordas das folhas deixando segmentos de aproximadamente 1 cm².

Foram estabelecidos dois tratamentos, segundo as metodologias adotadas por Minamiguchi e Machado Neto (2007) e Chen e Chang (2006) (Tabela 1) para algumas espécies do gênero Phalaenopsis. A metodologia proposta por Minamiguchi e Machado Neto (2007), utiliza o meio NDM (New Dogashima Medium) (Tokuhara e Mii, 1993) contendo ANA (0,537μM) e BAP (4,440μM), acrescido de phytagel e com pH 5,8, denominado Meio NDM e a metodologia proposta por Chen e Chang (2006) faz uso do meio MS (Murashige e Skoog, 1962), com a metade da concentração dos sais, acrescido de ANA (0,537μM) e TDZ (13,621μM), gelificado com gelrite e o pH 5,2, denominado meio ½ MS). Cada tratamento continha 20 repetições e cada repetição foi composta de um tubo de ensaio contendo uma secção foliar inoculada em 20 mL do meio nutritivo. O experimento foi conduzido em sala de crescimento do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da UFRPE, sob temperatura de 25 ⁺ 2 ^oC em ausência de luz durante 90 dias.

Indução de embriogênese somática secundária

Aos 90 dias as estruturas morfogênicas formadas a partir do explante foliar no tratamento ½MS, foram separadas do explante indutor, com cuidado para não ocasionar ferimentos ou danificar as estruturas, utilizando o auxílio de um bisturi e foram inoculadas no mesmo meio indutor ½MS, permanecendo ainda no escuro por mais 60 dias para induzir a formação de embriões somáticos secundários (ESS). Posteriormente, os embriões (primários e secundários) foram transferidos para o meio MS com metade da concentração de sais, na ausência de fitoregulador, e submetidos a um fotoperíodo de 16 horas fornecido por lâmpadas fluorescentes brancas com intensidade luminosa de 42 µmol. m² s^-1

Análise histológica dos embriões somáticos

Para avaliação da morfologia interna em microscopia óptica, foram retiradas amostras de explantes com a presença de estruturas morfogênicas obtidas durante o processo de indução de embriogênese somática primária e secundária. As amostras foram fixadas em FAA 70 por 72 horas e preservadas em álcool etílico 70 % (Johansen, 1940). Posteriormente, o material foi desidratado em série etílica (70 % a 100 %), imersos em xilol, emblocados em parafina e seccionado em micrótomo rotativo (MRP09 LUPETEC), com secções longitudinais, variando entre 5 a 8 µm de espessura. As secções obtidas foram submetidas à dupla coloração composta por Azul de Alcian e Safranina (1:1, v/v) e montados em lâminas permanentes com bálsamo do Canadá (Bukatsch, 1972). A análise e o registro fotográfico dos caracteres anatômicos mais relevantes, foram realizados em microscópio óptico Top Light B2, utilizando-se o software BEL MicroImage Analyser.

Para a identificação de algumas substâncias nas secções histológicas, foram realizados testes histoquímicos utilizando os seguintes reagentes: sudan IV, para evidenciar e localizar substâncias lipídicas (Pearse, 1961); lugol, para detectar amido (Jensen, 1962) e cloreto férrico, para verificar a presença de compostos fenólicos (Johansen, 1940). As imagens foram registradas em microscópio de luz (COLEMAN).

O processamento histológico foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da UFRPE e os testes histoquímicos foram realizados no Laboratório de Anatomia Vegetal pertencente à UFPE.

RESULTADOS

Indução de embriogênese somática primária.

No meio nutritivo NDM durante toda fase de indução de embriões somáticos, não apresentou formação de estruturas morfogênicas, ocorrendo oxidação e necrose completa dos explantes foliares.

Aos 25 dias de cultivo ocorreu o surgimento de pequenas estruturas arredondadas na face adaxial de explantes foliares no meio ½ MS. Tais estruturas se apresentavam mais evidentes sobre o explante aos 45 dias de cultivo, demonstrando morfogênese direta (Fig. 1A), uma vez que não foi visualizada a presença de calo.

Aos 50 dias de cultivo foi possível verificar um crescimento e desenvolvimento das estruturas morfogênicas, bem como o surgimento de novas estruturas em diversos estádios de desenvolvimento, por toda extensão do explante foliar (Fig. 1B), tanto na face adaxial como abaxial (Fig. 1C).

Indução de embriogênese somática secundária.

Aos 60 dias de indução da ESS, observou-se a formação de embriões somáticos secundários em estádio avançado de desenvolvimento, tendo a aparência semelhante a um protocormo aclorofilado devido ao cultivo na ausência de luz (Fig. 1D).

Aos 15 dias de cultivo com luz, parte dos embriões somáticos (primários e secundários) apresentavam em estádio avançado de desenvolvimento, evidenciando os primórdios foliares no ápice do eixo caulinar (Fig. 1E). Na presença da luz, esses embriões começaram a produzir clorofila e consequentemente o desenvolvimento da parte aérea aos 30 dias de exposição à luz (Fig. 1F). Aos 45 dias esses embriões desenvolveram-se em plântulas com folhas bem desenvolvidas (Fig. 1G), bem como o sistema radicular (Fig. 1H).

Análise histológica e histoquímica dos embriões somáticos

As análises histológicas permitiram evidenciar o início da formação dos embriões somáticos diretamente sob a superfície do explante foliar. Este início de formação é caracterizado por um aglomerado de células que se desdiferenciaram em células meristemáticas e que se encontram em constante divisão na superfície epidérmica do explante (Figs. 2A-2B). Foi observada a formação das estruturas morfogênicas tanto na face adaxial como na face abaxial do explante (Fig. 2B).

As células-mães embriogênicas apresentavam-se em constantes divisões periclinais e anticlinais, e com as seguintes características meristemáticas: tamanho reduzido, indiferenciadas, citoplasma denso e núcleos bem desenvolvidos (Fig. 2A). Posteriormente, estas células foram formando estruturas globulares, caracterizando a primeira fase de formação dos embriões somáticos (Figs. 2B-2C-2D). Estes embriões globulares se originavam diretamente da superfície do explante foliar sem nenhuma conexão com o sistema vascular da folha. Nesses embriões, que já se apresentavam formados, observou-se uma estrutura semelhante a um suspensor, unindo o embrião somático em formação, ao tecido de origem (Fig. 2D).

Aos 50 dias de cultivo em meio de indução para a formação de embriões, observou-se que os mesmos apresentavam independência do explante foliar (Fig. 2E), provavelmente iniciando a organização deste embrião, porém não apresentavam ainda uma polaridade distinta. Foi observada também a presença de ráfides (cristais aciculares de oxalato de cálcio ou carbonato de cálcio) encontradas no interior de algumas células dos embriões formados, denominadas idioblastos (Fig. 2F). Além disso, pode-se verificar também a ocorrência de ilhotas de procâmbio dispersas pela extensão do embrião, configurando um arranjo poliárquico (Fig. 2G). Os embriões desenvolvidos apresentavam os meristemas primários (protoderme, meristema fundamental e procâmbio) bem como o surgimento de alguns primórdios foliares (Fig. 2H).

Os embriões maduros apresentavam tecidos mais diferenciados, com primórdios foliares mais desenvolvidos, indicando o processo de regeneração do embrião em plântula (Fig. 2H), além da presença do sistema vascular (xilema e floema) (Fig. 2G). Essas características evidenciam que esses embriões somáticos apresentam capacidade para regenerar plantas completas semelhantes a plantas originadas por embriões zigóticos.

No que se refere às análises histoquímicas não foi detectado a presença de amido nos embriões primariamente formados, reagindo apenas na área do parênquima do explante foliar que corresponde a uma folha adulta (Fig. 3A). Amido foi observado na região do meristema fundamental que circunda o sistema vascular dos embriões em desenvolvimento (Fig. 3B). Em embriões que já se observava primórdios foliares, pode verificar uma boa quantidade de amido em várias regiões da plântula (Fig. 3B).

Quanto às substâncias lipídicas, foram observadas na protoderme do embrião (Figs. 3C-3D), provavelmente cutina, além de pequenas gotículas de lipídeo sob a superfície da cutícula (Fig. 3D). Não foi observado lipídeo no interior do embrião, apenas em seu revestimento.

DISCUSSÃO

A oxidação, observada no meio NDM, é considerada um entrave na cultura de tecidos. Esse processo consiste na liberação de compostos fenólicos pelos tecidos, que pode ser uma resposta a vários fatores, como por exemplo, resposta aos ferimentos, altas concentrações de reguladores de crescimento no meio nutritivo ou pela oxidação de polifenois e quininas, conforme observado por Ledo et al., (2002). A oxidação pode causar toxidez, inibir o crescimento, e, eventualmente, ocasionar a morte do explante (Ozyigit et al., 2007).

As respostas obtidas no meio ½MS acrescido de ANA (0,537μM) e TDZ (13,621μM), gelificado com gelrite e o pH 5,2, aos 25 dias no genótipo estudado, foram similares aos resultados encontrados por Chen e Chang (2006), que trabalhando com o mesmo gênero, com a espécie Phalaenopsis amabilis (L.) Blume e com diferentes associações e concentrações entre ANA e TDZ, obtiveram o surgimento dos embriões somáticos aos 20 dias de cultivo na ausência de luz. Porém, neste trabalho só foi observada a presença de embriões apresentando primórdios foliares aos 45 dias. Diferenças relacionadas ao período de obtenção de embriões podem estar associadas ao genótipo, interferindo diretamente na velocidade do processo de indução de embriões somáticos (Torres, 1999).

Neste trabalho, quando os embriões primários e secundários passaram a ser cultivados na presença de luz, apresentaram desenvolvimento progressivo, evoluindo para protocormos e posteriormente plantas. Esse comportamento está associado ao fato da luz promover a regeneração do embrião em plantas, logo fatores como intensidade e qualidade (da luz) alteram as concentrações endógenas de fitoreguladores, espessura dos tecidos e atuam na síntese de pigmentos (Xing et al., 2014).

O sucesso na produção de plantas, a partir de embriões somáticos, depende, por exemplo, do estádio de maturação do embrião e da composição do meio nutritivo (Sharma et al., 1996). Os embriões em estádio avançado de desenvolvimento são praticamente autotróficos e possuem uma menor exigência nutricional (Santos Jesus et al., 2011). A constituição e quantidade dos sais presentes no meio de cultura, o uso de fitoreguladores, fonte de carbono e o tipo de agente gelificante, também podem alterar as propriedades do meio, interferindo na formação de embriões somáticos.

Análise histológica e histoquímica dos embriões somáticos primários e secundários

Ao induzir a rota morfogenética da embriogênese somática em explantes foliares de orquídea, Chen e Chang (2006) observaram comportamento similar ao presente trabalho em Phalaenopsis amabilis, ou seja, células meristemáticas em constante divisão sob a superfície do explante, caracterizando o início da formação dos embriões somáticos de forma direta (sem a passagem pela fase de calo), por meio da camada epidérmica do explante. Com o intuito de restringir a perda de água, estas células epidérmicas não deixam espaços entre elas, sendo perfeitamente justapostas (Alquini et al., 2006). Essas células formaram estruturas globulares que se originavam diretamente da superfície do explante foliar, sem nenhuma conexão com o sistema vascular da folha. Estas características configuram uma particularidade dos embriões somáticos, que é a presença de um sistema vascular fechado, sem conexão vascular com os tecidos do explante inicial (Guerra et al., 1999). Resultados semelhantes foram observados por Carneiro et al., (2014), onde não presenciaram a conexão vascular entre os embriões somáticos, confirmando a individualidade dos embriões formados.

No que diz respeito à estrutura que foi observada semelhante a um suspensor, deve-se considerar que essa é uma estrutura encontrada geralmente em embriões zigóticos, que estabelece grande contato com os tecidos maternos circundantes, provavelmente facilitando o suprimento de nutrientes para o embrião (Capron et al., 2009). Estruturas semelhantes foram encontradas por Ferreira et al., (2005) em Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.) K. Schum., Portillo et al., (2007) em Agave tequilana F.A.C. Weber e Carneiro et al., (2014) em Agave sisalana Perrine ex Engelm.. De acordo com esses autores, foi possível verificar anatomicamente embriões somáticos ligados ao tecido do explante por um suspensor. Resultados obtidos com embriões somáticos de Feijoa sellowiana (O. Berg.) O. Berg (atualmente Acca sellowiana (O. Berg.) Burret) tem demonstrado que existe uma estrutura semelhante a um suspensor que os conectam aos tecidos da planta-mãe (Correia e Canhoto, 2010). A formação, ou não, de uma estrutura semelhante ao suspensor pode estar relacionada a diferentes origens dos embriões somáticos, podendo o mesmo apresentar uma origem unicelular, que geralmente forma um suspensor, ou terem origem multicelular, não formando essa estrutura, sendo apenas provenientes de um grupo de células, que estão ligadas ao tecido da planta-mãe por uma ampla região (Williams e Maheswaran, 1986). No entanto, a formação de um suspensor ou estrutura anexa de embriões somáticos em angiospermas, tem sido bastante questionada devido à insuficiência de estudos mais aprofundados acerca desta estrutura embrionária. Em contrapartida, nas gimnospermas tornou-se um sistema modelo de estudos, como em coníferas (Correia e Canhoto, 2010). Entretanto, George et al., (2008) afirmam que a célula apical passa por sucessivas divisões para originar o embrião, enquanto a célula basal, por meio de divisões anticlinais, formará o suspensor.

Semelhante ao observado neste estudo, Mayer et al., (2008) ao fazer a comparação anatômica das folhas e raízes de Cymbidium Sw. (Orchidaceae) cultivadas ex vitro e in vitro, também constataram a presença de ráfides no meristema fundamental das plantas cultivadas nos dois ambientes, estando em maior número na planta in vitro. Esse fato pode estar associado a maior disponibilidade e facilidade de absorção dos sais presentes no meio nutritivo. Em orquídeas do gênero Cattleya Lindl. cultivadas ex vitro, também foi observada a ocorrência de idioblastos com ráfides de oxalato de cálcio, por todo o mesofilo (Godoy e Costa, 2003). A presença de cristais de oxalato de cálcio, formados em diferentes órgãos de uma planta, está diretamente associada com a quantidade de cálcio disponível (Zindler-Frank et al., 2001), que pode também estar relacionado com o processo de eliminação do excesso de cálcio (Kostman et al., 2001). Diante do exposto pode-se afirmar que a presença de ráfides nas células do híbrido Phalaenopsis Classic Spotted Pink, pode estar atrelado a compartimentalização do excesso de sais no vacúolo celular.

Após a transferência dos embriões para local iluminado, observou-se o desenvolvimento dos tecidos meristemáticos, evoluindo para a formação de tecidos mais diferenciados, como os tecidos primários, como os primórdios foliares. Esse comportamento demonstra a importância da luz na diferenciação dos tecidos e consequentemente no desenvolvimento do embrião em planta.

Quanto às análises histoquímicas, a ausência de amido nos embriões provavelmente está associada ao estádio juvenil em que se encontravam, além de serem cultivados na ausência de luz durante o período de indução, ausência de um sistema vascular bem desenvolvido e por ainda não apresentarem um metabolismo fotossintético eficiente. O amido é considerado como o principal carboidrato de reserva nas plantas, atuando como fonte de energia para as alterações metabólicas em plantas ou fornecendo moléculas de açúcares para biossíntese de lipídeos, proteínas, antioxidantes e polissacarídeos (Pescador et al., 2008; Gomez-Gonzalez et al., 2010) e como base de energia para o crescimento, regulação da morfogênese e diferenciação celular das plantas, com grande importância na constituição da estrutura da parede celular (Smeekens, 2000). Análises histoquímicas em jabuticaba-branca (Myrciaria sp.) comprovou que o material de reserva de embriões somáticos e zigóticos, era o amido, todavia, os embriões somáticos apresentavam uma quantidade menor dessa reserva comparado com os embriões zigóticos (Motoike et al., 2007).

No que compete às substâncias lipídicas, foi observada a presença de uma cutícula pouco espessa nos embriões, podendo desempenhar um papel de relativa importância contra a perda excessiva de água, o que facilitará a aclimatização dessas plantas, viabilizando a produção de mudas por meio de embriões somáticos primários e secundários no híbrido Phalaenopsis Classic Spotted Pink.

CONCLUSÕES

O meio nutritivo MS (Murashige e Skoog, 1962), com a metade da concentração dos sais, acrescido de ANA (0,537μM) e TDZ (13,621μM), gelificado com gelrite e o pH 5,2, proporcionou a formação de embriões somáticos primários e secundários com competência celular para regenerar plantas, a partir de células epidérmicas dos explantes foliares.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos de forma especial ao Prof. Joaquim Evêncio Neto e a Msc. Maria Edna Gomes de Barros, por possibilitar o uso das dependências do Laboratório de Anatomia Animal da UFRPE para as análises iniciais de histologia.

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