Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ

Patricia Rodríguez; Gloria Romero de Pérez; Mónica Guzmán

Publicado

2009-01-01

Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ

Palabras clave:

inmunoimpresión, Elisa, hibridación, microscopía, CTV, IC-RT-PCR, immunoimpression, hybridization, microscopy (es)

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Autores/as

Patricia Rodríguez Investigador
Gloria Romero de Pérez Investigador
Mónica Guzmán Investigador

Resumen (es)

In situ serological, microscopy and hybridization detection of CTV

Resumen: El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) es perjudicial para la citricultura y causa la enfermedad llamada tristeza de los cítricos. Infecta las especies del género Citrus ocasionando la muerte de millones de árboles. Los síntomas son decaimiento rápido (QD) y acanalamiento de tallo (SP). En el trabajo se diagnosticó molecular y serológicamente al CTV en aislados provenientes de Citrus aurantifolia o Lima Tahití (LT) y Citrus madurensis (Lour) o Calamondino (Ca), y se realizaron estudios preliminares de detección viral por medio de microscopía óptica e hibridación in situ. Se utilizó IC-RT-PCR e inmunoimpresión de tejido (IMI) expuesto a los anticuerpos monoclonales 3DF1+3CA5, y con el anticuerpo discriminante MCA 13 con técnica de Enzyme Linked Inmunossorbent Assay Doble Sándwich (Elisa-DAS). La detección por microscopía se realizó sobre secciones de pecíolo de LT y C que se tiñeron con Azure A, y con acetato de uranilo y citrato de plomo. Para la hibridación in situ se empleó una sonda marcada con digoxigenina dirigida hacia el gen de la proteína mayor de la cápside. Los resultados de IC-RT-PCR, IMI y Elisa fueron positivos para LT y C, indicando la presencia de variantes virales de tipo severo. Con microscopía de luz se detectaron inclusiones citoplasmáticas en las células acompañantes y del floema, confirmado con IMI y por hibridación in situ. Se visualizaron inclusiones de partículas virales en el tejido vegetal con microscopía electrónica con cambios en la ultraestructura celular como presencia de grandes vacuolas propias de la infección viral. Este trabajo integra distintas técnicas diagnósticas sobre dos especies cítricas exóticas.

Palabras clave: inmunoimpresión; Elisa; hibridación; microscopía; CTV; IC-RT-PCR.

Abstract: Citrus tristeza virus (CTV) is deleterious for citriculture and causes citrus tristeza disease. CTV infects all citrus species thereby causing the death of millions of trees. Its main symptoms are quick decline (QD) and stem pitting (SP). Serological, molecular and microscopy techniques were used in this work for diagnosing CTV in Citrus aurantifolia or Tahiti Lime (Citrus latifolia Tanaka) (TL) and Citrus madurensis (Lour) or Calamondin (Ca) isolates. Petioles were tissue printed (IMI) and exposed to 3DF1+3CA5 monoclonal antibodies; they were then ELISA buffer extracted and exposed to a discriminant MCA 13 monoclonal antibody in a double-antibody sandwich indirect enzyme-linked immunosorbent assay (DASI-ELISA). Immunocapture reverse transcriptase-polymerase chain reaction (IC-RT-PCR) amplification, using specific major coat protein gene (CPG) primers, was used on the ELISA buffer extracts as template. Optical and electron microscopy were used for detection on transversal sections of petiole and stained with azure A, uranyl acetate or lead citrate. Digoxygenin-labelled major CPG CTV probes were used for in situ hybridisation of petioles printing. All IC-RT-PCR, IMI and ELISA results were positive for both LT and C, indicating the presence of severe viral variants. Light microscopy cytoplasm inclusions were detected in the phloem and accompanying cells, confirmed by IMI and in situ hybridisation. Electron microscopy analysis revealed cellular abnormalities with changes in ultrastructure and the presence of big vacuoles which are characteristic of cytoplasmic viral infection. This is the first work integrating all available diagnostic techniques on these two exotic citric species.

Key words: immunoimpression; Elisa; hybridization; microscopy; CTV, IC-RT-PCR.

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ÿþ<html> <head> <title></title> </head> <body> ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Relación de la fijación de nitrógeno y la producción de auxinas en cepas de Gluconacetobacter diazotrophicus procedentes de diferentes cultivos Relationships between nitrogen fixation and auxins production in Gluconacetobacter diazotrophicus strains from different crops Marcia M. Rojas1 , Anar J. Rodríguez2 , Iván D. Trujillo3 , Mayra Heydrich3 1 Profesora asistente, Departamento de Microbiología y Virología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba. <a href="mailto:marcia@fbio.uh.cu">marcia@fbio.uh.cu</a> 2 Profesora asistente, Departamento de Microbiología y Virología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba. 3 Estudiante de postgrado, Departamento de Microbiología y Virología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba. 4 Profesora auxiliar, Departamento de Microbiología y Virología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba. Recibido: febrero 2 de 2008 Aprobado: junio 16 de 2009 <hr> Resumen Se determinó la capacidad de fijar nitrógeno mediante la actividad reductora de acetileno para 8 cepas de G. diazotrophicus aisladas de diferentes ecosistemas empleando el medio LGI-P. Además, se determinó la producción de auxinas a través del método de Salkowski y se analizó la influencia del aminoácido triptófano y del AIA en la actividad de la nitrogenasa. El triptófano, al igual que otros aminoácidos y las diferentes concentraciones de AIA, inhiben en distinta medida la actividad de la enzima solo parcialmente. Se demostró que las condiciones de nitrofijación no afectan la producción de AIA en esta bacteria. Esta relación entre ambas capacidades fisiológicas beneficiosas para los cultivos agrícolas pudiera tener gran importancia ya que pueden desarrollarse paralelamente, y potenciar la acción beneficiosa hacia la planta, basada en la dinitrofijación y la producción de auxinas estimuladoras del crecimiento vegetal. Palabras clave: Gluconacetobacter diazotrophicus, auxinas, fijación de nitrógeno. Abstract The capacity to fix nitrogen of 8 strains of G. diazotrophicus from different ecosystems was determined by acetylene reduction assay using LGIP medium. Moreover, auxins production was determined by Salkowski’s method and the influence of triptophan and indoleacetic acid (IAA) in the nitrogenase activity were analyzed. The triptophan as other aminoacids and different concentrations of IAA, inhibit at different levels the nitrogen fixation only partially. There were demonstrated that the nitrogen fixation conditions do not affect the auxins production of this bacteria. This relationship between both crop beneficial physiological capacities should be a great importance since they may be parallely developed, and enhance the beneficial action to the plant, based on dinitrogen fixation and stimulating plant growth auxins production. Key words: Gluconacetobacter diazotrophicus, auxins, nitrogen fixation. <hr> Introducción Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB, por sus siglas en inglés) benefician a las plantas a través de diferentes mecanismos, entre los que se encuentran la producción de hormonas (especialmente las auxinas) del crecimiento vegetal, el mejoramiento de la disponibilidad de nutrientes para la planta (la solubilización de fosfatos inorgánicos, la fijación de nitrógeno), y el control biológico de patógenos (Kloepper, 1993). Una gran parte de las bacterias identificadas para utilizarse como PGPB se han aislado de la rizosfera y pocas de estas han clasificado como endófitas (Manjula et ál., 2002; Sessitsch et ál., 2004; Kishore et ál., 2004). G. diazotrophicus es una PGPB que se puede encontrar asociada con la caña de azúcar como endófita (Cavalcante y Döbereiner, 1988). Esta especie ha sido objeto de estudio debido a su potencialidad para mejorar el crecimiento vegetal por su capacidad de llevar a cabo la fijación biológica de nitrógeno, la producción de auxinas, la solubilización de fosfatos y la liberación de sustancias antimicrobianas (Mowade y Bhattacharyya, 2000; Sevilla et ál., 2001; Muñoz-Rojas, 2005). Se ha informado que esta bacteria, además de asociarse a la caña de azúcar y la chinche harinosa coligada a esta (Saccharococus sacchari) (Muñoz-Rojas, 2005), se ha encontrado en otros cultivos agrícolas como el boniato (Ipomoea batatas), algunos pastos de forraje (Pennisetum purpureum Cameroon) (Paula et ál., 1991), el cafeto (Coffea arabica) (Jiménez-Salgado et ál., 1997), la piña (Ananas comosus) (Tapia-Hernández et ál., 2000), el mango (Maginifera indica) (Muthukumarasamy et ál., 2002), wetland rice (Oryza sativa L.) (Muthukumarasmy et ál., 2005), entre otros. G. diazotrophicus es una bacteria de especial interés porque además de su capacidad de fijar el nitrógeno en presencia de KNO3 y a valores de pH bajos (Stephan et ál., 1991), puede excretar casi la mitad del nitrógeno fijado en una forma potencialmente disponible para la plantas (Cojho et ál., 1993; Youssef et ál., 2004). Además de la fijación biológica del nitrógeno se han podido determinar otras acciones beneficiosas que pueden ejercer estos microorganismos sobre las plantas. Se ha demostrado la producción de sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal como ácido 3indolacético (AIA) y giberelinas en medio de cultivo por G. diazotrophicus (Fuentes-Ramírez et ál., 1993; Heydrich et ál., 1998; Bastián et ál., 1998, Jiménez-Salgado et ál., 1997), lo que contribuiría de manera general con el crecimiento de la planta. Muñoz-Rojas et ál. (2005) demostraron que cuando se inocula G. diazotrophicus en plantas de caña de azúcar, la bacteria puede fijar ciertas cantidades de nitrógeno y promover el crecimiento de las plantas predominantemente a través de mecanismos hormonales, dependiendo de la variedad de caña de azúcar y del genotipo de la bacteria inoculada. Pedraza (2008) plantea que es necesario llevar a cabo estudios más profundos para esclarecer las interrogantes que existen sobre la interacción entre los diazotrofos y la planta, lo cual es imprescindible para su utilización comercial. Teniendo en cuenta estos antecedentes se planteó el presente trabajo, donde se analiza la relación que se establece, in vitro, entre la fijación biológica del nitrógeno y la producción de ácido indolacético por la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus. Materiales y métodos Cepas bacterianas utilizadas Se utilizaron 8 cepas de referencia de la especie G. diazotrophicus aisladas de diferentes ecosistemas que se listan en la <a href="#t1">tabla 1.</a> <a name="t1"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a09t1.JPG"></a> Determinación de la influencia de la fijación de nitrógeno en la producción de auxinas Se midió la producción de AIA por las cepas PAl5 (ATCC 49037) y 4-02 en el tiempo (24, 48,72 y 96 horas) a partir de lo cual se seleccionó el tiempo y las condiciones adecuadas para determinar la producción de esta auxina por todas las cepas en estudio. Se utilizó medio LGI-P líquido con las siguientes variantes en cuanto a las condiciones de nitrofijación y la presencia de triptófano. <ul> <li>0,132 g.L-1 de (NH4)2 SO4 y 100 Μg. mL-1 de Trp</li> <li>0,132 g.L-1 de (NH4)2 SO4 y sin adición de Trp</li> <li>2 g.L-1 de (NH4)2 SO4 y 100 Μg. mL-1 de Trp</li> <li>2 g.L-1 de (NH4)2 SO4 y sin adición de Trp</li> </ul> Después del periodo de incubación indicado se centrifugaron los cultivos a 5000 rpm a durante 10 min. A los sobrenadantes se les adicionó el reactivo de Salkowski (Sawar et ál., 1992) en una relación 1:1. La mezcla se incubó durante 30 min en la oscuridad, y luego se midió la absorbancia a 530 nM en un espectrofotómetro. Previamente se realizó una curva patrón empleando soluciones de 5, 10, 15, 20, 40, 60, y 80 ΜgmL-1 de AIA sintético. Determinación de la producción de auxinas de las 8 cepas en estudio Se sembraron tubos con 5 mL de medio al 5% con los preinóculos preparados de cada una de las cepas en estudio y se incubaron a 30o C en condiciones de agitación en zaranda. Para la determinación de la producción de auxinas se siguió la metodología previamente descrita y se tuvieron en cuenta las condiciones seleccionadas en el experimento anterior respecto a las condiciones de nitrofijación, la presencia de Trp y el tiempo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Determinación de la influencia de aminoácidos y hormonas en la fijación de nitrógeno Para este experimento se utilizó la cepa 4-02 de G. diazotrophicus. Partiendo de una suspensión de células microbianas ajustada a la concentración 108 ufc correspondiente al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland (NCCLS, 1993), se inocularon frascos de 10 ml que contenían 5 ml de medio LGI-P semisólido suplementado con AIA y ácido giberélico por separado a las concentraciones de 0,025; 0,25 y 2,5 mg/l y se incubaron 5 repeticiones por concentración por microorganismo a 30° C durante 48 horas. Luego se les extrajo el 12% del aire con jeringuillas y se les inyectó esa misma cantidad de acetileno, se incubaron durante 96 horas y se midió la reducción del acetileno a etileno en un cromatógrafo de gases por ionización de llamas acoplado a una computadora con el programa Biocrom mediante el cual se procesaron los resultados. Análisis biométricos Para los análisis biométricos se realizaron pruebas de normalidad y homogeneidad de varianza a todas las variables de los experimentos y después del Anova se aplicó el método SNK paramétrico o no paramétrico según el caso, utilizando el programa Statistica para Window versión 6.0. Resultados y Discusión Influencia de la fijación de nitrógeno en la producción de auxinas En las últimas décadas se ha observado que las asociaciones entre los procariotas y las plantas son de gran importancia para la agricultura como herramienta para mejorar el rendimiento de los cultivos y la preservación del medioambiente, lo que se complementa con la reducción de los riesgos por el uso de fertilizantes químicos (Pedraza, 2008). G. diazotrophicus-caña de azúcar representa un sistema modelo de la asociación entre los diazotrofos y las monocotiledóneas, pero aún no se ha entendido totalmente dicha interacción. Momose et ál. (2009) detectaron fijación de nitrógeno en tallos de plantas jóvenes de caña de azúcar y sugieren que esto se debe a la actividad de endófitos como G. diazotrophicus que se han descrito previamente en esa misma variedad (Asis et ál., 2000). G. diazotrophicus también produce el ácido 3 indolacético (AIA), auxina natural de gran importancia y significativa actividad biológica (Arshad y Frankerberger, 1998; Velázquez et ál., 1999). Teniendo en cuenta estos aspectos, debería ser analizada y bien entendida la relación entre la FBN y producción de AIA para aplicar esta bacteria promotora de crecimiento vegetal (PGPB) de la manera más eficaz en la agricultura sostenible. El triptófano (Trp) es un aminoácido esencial que sirve como precursor fisiológico para la biosíntesis de auxinas en plantas y microorganismos. Muchos investigadores han informado un incremento en la biosíntesis de auxinas en suelos rizosféricos suplementados con Trp (Frankenberger y Poth, 1987). En este experimento se determinó cómo se afecta la producción de AIA in vitro por la presencia de Trp como inductor y las condiciones de nitrofijación, lo cual se puede observar en la <a href="#f1">figura 1</a>. <a name="f1"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a09f1.JPG"></a> En este experimento se demostró que en las dos variantes de concentración de nitrógeno en el medio de cultivo las cepas 4-02 y PAl5 producen auxinas en presencia de Trp desde el primer día de crecimiento y de manera incrementada durante un periodo de 96 horas. Por el contrario, la producción de auxinas en ausencia de Trp fue nula, independientemente de si existió suplemento de nitrógeno o no. Teniendo en cuenta este resultado se podría asumir que la vía principal de biosíntesis de AIA en G. diazotrophicus es dependiente de la presencia de Trp. Resultados contrastantes fueron obtenidos por Rojas (2005), quien empleó el medio SYP para la cuantificación del AIA para las mismas cepas de G. diazotrophicus. En este caso la bacteria produjo las hormonas en ausencia de Trp añadido, pero no escapa su presencia en el medio con extracto de levadura, la cual es una fuente de aminoácidos. Se han descrito 3 vías fundamentales para la producción de AIA para las plantas y los microorganismos las cuales son dependientes de triptófano (Normanly y Bartel, 1999). Evidentemente G. diazotrophicus debe utilizar una de ellas, según se muestra en los experimentos realizados. De acuerdo con los resultados obtenidos para las cepas PAl 5 y 402 se decidió realizar el estudio de producción de AIA en condiciones de nitrofijación para todas las cepas (no se realizó este ensayo sin nitrofijación debido a que no existieron diferencias significativas en la producción de AIA bajo las dos variantes de nitrofijación). Se seleccionaron las 96 horas como el tiempo óptimo de producción para todas las cepas del estudio debido a que existió diferencia significativa entre las concentraciones de AIA producidas entre 72 y 96 h en condiciones de nitrofijación por la cepa PAl5, que es la cepa tipo de la especie. Los resultados expresados en la <a href="#f2">figura 2</a> indican que todas las cepas de G. diazotrophcus del estudio son productoras de auxinas. El rango de concentraciones varió desde 9,25 ΜgmL-1 hasta 32,14 ΜgmL-1, donde UAPCf 53 fue el menor productor y CFNCf 52 el mayor. La producción de AIA se comporta para las diferentes cepas en orden decreciente como se señala a continuación: CFNCf 52, Pal 3, UAPAc10, 4-02, PRC 1, 1-05, Pal 5 y UAPCf 53, existiendo diferencias estadísticamente significativas entre ellas, según lo mostrado en la <a href="#f2">figura 2</a>. <a name="f2"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a09f2.JPG"></a> Los valores de auxinas obtenidos son comparables con los de otras bacterias como Azospirillum y Azotobacter según lo probado por Fuentes-Ramírez et ál. (1993). Igualmente, si comparamos la producción de la hormona con otros nitrofijadores como Azospirillum y Herbaspirillum se encuentran en el mismo rango, pero siempre mayores que este último género (Rives, 2006). Influencia de aminoácidos y hormonas en la fijación de nitrógeno Cuando se añaden aminoácidos al medio de cultivo se evidencia una inhibición parcial de la actividad enzimática (<a href="#f3">figura 3</a>). Resultados similares se encontraron con las cepas PAl 3 y la PAl 5 con otros aminoácidos (Stephan et ál., 1991; Reis y Dobereiner, 1998), aunque estos autores demostraron que la inhibición frente a los aminoácidos depende de la concentración de sacarosa en el medio de cultivo y de la cepa en cuestión, como se puede apreciar para la asparagina, que inhibe totalmente la actividad de la nitrogenasa en la cepa PAl5, lo que no ocurre con las cepas 4-02 y 1-05. Se ha comprobado que todas las cepas tienen buen crecimiento en presencia de estos y otros aminoácidos, siendo mayor estadísticamente con la asparagina (Rodríguez et ál., 2002, Tejera et ál., 2004). Tejera et ál. (2004) detectaron la presencia de varios aminoácidos y amonio en la savia de la caña de azúcar, siendo las concentraciones de amonio tanto en el fluido apoplástico como en el simplástico mucho menores que las de los aminoácidos. Esto favorecería la fijación de nitrógeno por esta bacteria, si se tienen en cuenta los resultados obtenidos respecto a la inhibición de la actividad nitrogenasa por estos compuestos del nitrógeno y pudiera tener importancia en la interacción planta-bacteria en sentido general, ya que se ha comprobado que la presencia de triptófano estimula la producción de auxinas (Khalid et ál., 2001). <a name="f3"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a09f3.JPG"></a> Muchos autores han abordado la influencia que pueden ejercer las fitohormonas producidas por los microorganismos sobre las plantas, pero son muy pocos los estudios realizados donde se analice la interacción endófito-planta en sentido contrario, respecto a la presencia de estimuladores del crecimiento vegetal. En este trabajo se probó la capacidad de G. diazotrophicus para fijar nitrógeno en presencia de varias concentraciones de auxinas (AIA) y giberelinas (ácido giberélico, GA). La cepa 4-02 fija mayor cantidad de nitrógeno atmosférico en presencia de 0,025 mg/L de AIA, respecto a las otras concentraciones ensayadas, aunque la fijación es menor que en el medio donde no hay presencia de esta hormona (<a href="#f4">figura 4</a>). Respecto a la presencia de giberelina, las mayores tasas de fijación de nitrógeno se obtienen cuando está presente esta hormona al 0,025 mg/L, la menor concentración ensayada. Pudiera ser que para la fijación de nitrógeno esta cepa necesitara niveles menores de concentración de la fitohormona ya que se puede observar que la fijación de nitrógeno aumenta al disminuir tanto la concentración de AIA como la de GA, pero en el caso de esta última con la menor concentración utilizada hay una mayor actividad de la nitrogenasa (<a href="#f4">figura 4</a>). <a name="f4"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a09f4.JPG"></a> Los resultados son contrarios a los reportados por Christiansen-Weniger (1988) para Azospirillum brasilense, donde se muestra que el AIA a concentración de 2,5 mg.L-1 incrementa la fijación de nitrógeno y el GA a bajas concentraciones (0,025 mg.L-1) inhibe esta capacidad. No está claro cómo las sustancias del crecimiento de la planta pueden interactuar con la actividad nitrogenasa de los microorganismos, pudiera ser un efecto realmente hormonal, comparable con el que estas sustancias realizan en la regulación de la fisiología de la planta. Todas estas diferencias pudieran deberse a que la cepa de Azospirillum brasilense estudiada por estos autores se aisló de la rizosfera y la utilizada en nuestro experimento proviene del interior de las plantas. Además, es obvio que las auxinas y giberelinas producidas por el propio microorganismo pueden estar involucradas en la fisiología de la bacteria. La medida de fijación de nitrógeno como actividad de reducción del acetileno por mg de proteína de 11 cepas de G. diazotrophicus a las 96 h (tiempo seleccionado con base en la curva patrón realizada) se muestra en la <a href="#f5">figura 5</a>. Estos resultados se corresponden con los encontrados por Lee et ál. (2002), quienes señalan que tanto la fijación de nitrógeno como la producción de ácido 3 indolacético pudieran contribuir a la promoción del crecimiento de la planta. <a name="f5"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a09f5.JPG"></a> El estudio de la ecología de la interacción entre los endófitos y las plantas es de gran importancia. La influencia de los diferentes componentes de la planta en la selección y el desarrollo de la comunidad microbiana endófita es fundamental, teniendo en cuenta las perspectivas de utilización de estos microorganismos en el mejoramiento de los cultivos agrícolas. Conclusiones Se corroboró que las cepas de G. diazotrophicus producen hormonas estimuladoras del crecimiento vegetal del tipo de las auxinas y fijan nitrógeno atmosférico. - El ácido indolacético así como el triptófano inhiben parcialmente la actividad nitrogenasa de la especie G. diazotrophicus. - Las condiciones de nitrofijación no influyen notablemente en la producción de auxinas por esta bacteria, para lo cual hace falta suplemento del precursor triptófano. Referencias bibliográficas 1 Arshad, M. F., Frankenberger, W. T. 1998. Plant growth-regulating substances in the rhizosphere: microbial production and functions. Advances in Agronomy 62: 45-51. 2 Asis, C. A. Jr., Kubota, M., Chebotar, V. K., Ohta, H., Arima, Y., Nishiyama, K., Tsuchiya, K., Akao, S. 2000. Endophytic bacterial population in Philippine sugarcane cultivars and isolation of nitrogen-fixing strains. Microbes Environ 15: 209-216. 3 Bastian, F. A., Cohen, P., Piccoli, V., Luna, R., Baraldi S., Bottini, R. 1998. Production of indole 3-acetic acid and gibberellins A1 y A3 by Acetobacter diazotrophicus and Herbaspirillum seropedicae in chemically-defined culture media. Plant Growth Regul 24: 7-11. 4 Caballero-Mellado, J., Fuentes-Ramírez, L. E., Reis, V. M., Martínez-Romero, E. 1995. Genetic structure of Acetobacter diazotrophicus populations and identification of a new genetically distant group. Appl Environ Microbiol 61: 3008-3013. 5 Cavalcante, V. A., Döbereiner, J. 1988. A new acid-tolerant nitrogen fixing bacterium associated with sugarcane. Plant Soil 108: 23-31. 6 Cojho, E. H., Reis, V. M., Schenberg, A. C., Dobereiner, J. 1993. Interactions of Acetobacter diazotrophicus with amylolytic yeast in nitrogen-free batch culture. FEMS Microbiol Lett 106: 341-346. 7 Christiansen-Weniger, C. 1988. An influence of plant growth substances on growth and nitrogenase activity from Azospirillum brasilense, p. 141-149. In W. Klingmuller (ed.), Azospirillum IV. Berlin: Springer-Verlag. 8 Frankenberger, W. T., Poth, M. 1987. Biosinthesis of indole 3 acetic acid by pine ecto mycorizal fungi Pisolithus tictorius. Appl Environ Microbiol 53: 2908-2913. 9 Fuentes-Ramírez, L. E., Jiménez-Salgado, T., Abarca-Ocampo, I. R., Caballero-Mellado, J. 1993. Acetobacter diazotrophicus, and indolacetic acid producing bacterium isolated from sugarcane cultivars of Mexico. Plant Soil 154: 145-150. 10 Heydrich, M., Rojas, M. M., Prieto, A., Manzano, J. 1998. Isolation and characterization of Acetobacter diazotrophicus from different varieties of sugar cane in Cuba. 16th North American Conference on Symbiotic Nitrogen Fixation, Cancún, México. 11 Jiménez-Salgado, T., Fuentes-Ramírez, L. E., Tapia-Hernández, A., Mascarua-Esparza, M. A., Martínez- Romero, E., Caballero-Mellado, J. 1997. Coffea arabica L., a new host plant for Acetobacter diazotrophicus, and isolation of other nitrogen-fixing acetobacteria. Appl Envirom Microbiol 63 (9): 3676-83. 12 Khalid, A., Arshad, M., Zahir, Z.A., Khalid, M. 2001. Relative efficiency of rhizobacteria for auxin biosynthesis. Online Journal of Biological Sciences 1: 750-754. 13 Kishore, G. K., Pande, S., Podile, A. R. 2004. Phylloplane bacteria increase seedling emergence, growth and yield of field-grown groundnut (Arachis hypogaea L.) Letters in Applied Microbiology 40: 260-268. 14 Kloepper, J. W. 1993. Plant growth-promoting rhizobacteria as biological control agents. Soil Microbial Ecology. Metting, F. B. Jr. pp. 255-274. 15 Lee, S., Pierson, E., Escamilla, E., Kennedy, C. 2002. Involvement of cytochrome c in the biosynthesis of IAA in Gluconacetobacter diazotrophicus and assessment of a role for IAA production in sugarcane growth enhancement. In: Nitrogen Fixation: Global Perspectives. Finan, T., M. O´Brian, D. Layzell, J. K. Vessey and W. Newton (eds.), CAB International. 16 Manjula, K., Singh, S. D., Kishore, G. K. 2002. Role of endophytic bacteria in biological control of plant diseases. Annu Rev Plant Pathol 1: 231-252. 17 Momose, A., Ohtake, N., Sueyashi, K., Sato, T., Nakonishi, Y., Akao S., Ohyama, T. 2009. Nitrogen fixation and translocation in young sugarcane (Saccarum officinarum L.) plants associated with endophytic nitrogen fixing bacteria. Microbes and Environment, Advanced Publication. 18 Mowade, S., Bhattacharya, P. 2000. Resistance of P-solubilizing Acetobacter diazotrophicus to antibiotics. Current science 79 (11): 1591-1598. 19 Muñoz-Rojas, J. 2005. La interacción Gluconacetobacter diazotrophicus-caña de azúcar como modelo para el estudio de la transmisión de bacterias benéficas. Elementos 57. 20 Muñoz-Rojas, J., Caballero-Mellado, J. 2003. Population Dynamics of Gluconacetobacter diazotrophicus in Sugarcane Cultivars and Its Effects on Plant Growth. Microb Ecol. 21 Muñoz-Rojas, J., Fuentes-Ramírez, L. E., Caballero-Mellado, J. 2005. Antagonism among Gluconacetobacter diazotrophicus strains in culture media and in endophytic association. FEMS Microbiology Ecology 54: 57-66. 22 Muthukumarasamy, R., Cleenwerck, I., Revathi, G., Vadivelu, M., Janssens, D., Hoste, B., Gum, K. U., Park, K. D., Son, C. Y., Sa, T., Caballero-Mellado, J. 2005. Natural association of Gluconacetobacter diazotrophicus and diazotrophic Acetobacter peroxydans with wetland rice. Systematic and Applied Microbiology 28: 277-286. 23 Muthukumarasamy, R., Revathi, G., Seshardri, S., Lakshminarasimhan, C. 2002. Gluconacetobacter diazotrophicus (syn. Acetobacter diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte in tropics. Current Science 83 (2): 137-145. 24 NCCLS. 1993. Natural Committee for Clinical Laboratory Standards. "Performance standards for antimicrobial disk. Susceptibility Test". Approved standard M2-A5, 13 (24). 25 Normanly J., Bartel, B. 1999. Redundancy as a way of life, IAA metabolism. Curr Opin Plant Biol 2: 207-213. 26 Paula, M. A., Reis, V. M., Dobereiner, J. 1991. Interactions of Glomus clarum with Acetobacter diazotrophicus in infection of sweet potato (Ipomoea batatas), sugarcane (Saccharum spp.), and sweet sorghum (Sorghum vulgare). Biol Fertil Soils 11: 111-115. 27 Pedraza, O. 2008. Recent advances in nitrogen-fixing acetic acid bacteria. Int Journal of Food Microbiology 125: 25-35. 28 Reis, V. M., Dobereiner, J. 1998. Effect of high sugar concentration on nitrogenasa activity of Acetobacter diazotrophicus. Arch Microbiol 171: 13-18. 29 Rives, N. 2006. Caracterización de géneros bacterianos rizosféricos y endófitos asociados al cultivo de arroz (Oryza sativa L.). Tesis en opinión al título académico de Maestro en Microbiología. Instituto de Investigaciones del Arroz, Departamento de Protección de Plantas, La Habana, Cuba. 30 Rodríguez, A., Pérez, J., Rojas, M., Manzano, J., Heydrich, M. 2002. Fijación biológica del nitrógeno. Contribución a la educación y la protección ambiental 3. Soporte magnético. 31 Rojas, M. M. 2005. Caracterización de cepas de Gluconacetobacter diazotrophicus aisladas de variedades de caña de azúcar (Saccharum spp.) cultivadas en Cuba. Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas. Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba. 32 Sawar, M., Ashad, M., Martens, D. A., Frankenberger Jr., W. T. 1992. Trytophan-dependent biosinthesis of auxins in soil. Plant soil 147: 207-215. 33 Sawar, M., Ashad, M., Martens, D. A., Frankenberger, W. T. Jr. 1992. Trytophan-dependent biosinthesis of auxins in soil. Plant soil 147: 207-215. 34 Sessitsch, A., Reiter, B., Berg, G. 2004. Endophytic bacterial communities of field-grown potato plants and their plant-growth promoting and antagonistic abilities. Can J Microbiol 50: 239-249. 35 Sevilla, M., Burris, R. H., Gunapala, N., Kennedy, C. 2001. Comparison of Benefit to sugarcane plant growth and 15N2 incorparation following inoculation of sterile plants with Acetobacter diazotrophicus wild tipe and NIF- mutant strains. Molecular Plant Microbe Interaction 14: 358-366. 36 Stephan, M. P., Oliveira, M., Teixeira, K. R. S., Martínez-Drets, G., Dobereiner, J. 1991. Physiology and dinitrogen fixation of Acetobacter diazotrophicus. FEMS Microbiol Lett 77: 67-72. 37 Tapia-Hernández, A., Bustillos-Cristales, M. R., Jiménez-Salgado, T., Caballero-Mellado, J., Fuentes-Ramírez, L. E. 2000. Natural endophytic ocurrence of Acetobacter diazotrophicus in pineapple plants. Microbial Ecology 39: 49-55. 38 Tejera, N. A., Ortega, E., Rodés, R., Lluch, C. 2004. Influence of carbon and nitrogen sources on growth, nitrogenase activity, and carbon metabolism of Gluconacetobacter diazotrophicus. Can J Microbiol 50: 745-750. 39 Tien, T. M., Gaskins, M. H., Hubel, D. H. 1977. Plant growth substances produced by Azospirillum brasilense and their efect on the growth of pearl millet (Pennisetum americanum L.). Appl Environ Microbiol 37: 1016-1024. 40 Velázquez, M., Hernández, A., Heydrich, M., Hernández, A. N. 1999. Estudio de la interacción maíz-Burkholderia cepacia. Revista Latinoamericana de Microbiología 41: 17-23. 41 Youssef, H. H., Fayez, M., Monib, M., Hegazi, N. 2004. Gluconacetobacter diazotrophicus: a natural endophytic diazotroph of Nile Delta sugarcane capable of establishing an endophytic association with wheat. Biol Fertil Soils 39: 391-397. </body> </html>

ÿþ<html> <head> <title></title> </head> <body> ARTÍCULO CORTO Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ In situ serological, microscopy and hybridization detection of CVT Patricia Rodríguez1 , Gloria Romero de Pérez2 , Mónica Guzmán1 1 Bióloga, M. Sc., Universidad Nacional, Instituto de Biotecnología, Bogotá, Colombia. <a href="mailto:parodriguezb@unal.edu.co">parodriguezb@unal.edu.co</a> 2 Bióloga, M.Sc., Laboratorio de Microscopía Electrónica, Universidad Nacional, Bogotá, Colombia. <a href="mailto:hgsperez@andinet.com">hgsperez@andinet.com</a> 3 Bióloga, Ph. D., coordinadora Laboratorio de Virus Vegetales, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional, Bogotá. Colombia. <a href="mailto:mmguzmanb@unal.edu.co">mmguzmanb@unal.edu.co</a> Recibido: octubre 1 de 2008 Aprobado: junio 18 de 2009 <hr> Resumen El virus de la tristeza de los cítricos (CTV), es perjudicial para la citricultura y causa la enfermedad llamada tristeza de los cítricos. Infecta las especies del género citrus ocasionando la muerte de millones de árboles. Los síntomas son decaimiento rápido (QD) y acanalamiento de tallo (SP). En el trabajo se diagnosticó molecular y serológicamente al CTV en aislados provenientes de Citrus aurantifolia o Lima Tahití (LT) y citrus madurensis (Lour) o Calamondino (Ca), y se realizaron estudios preliminares de detección viral por medio de microscopía óptica e hibridación in situ. Se utilizó IC-RT-PCR e inmunoimpresión de tejido (IMI) expuestos a los anticuerpos monoclonales 3DF1+3CA5, y con el anticuerpo discriminante MCA 13 con técnica de Enzyme Linked Inmunossorbent Assay Doble Sándwich (Elisa-DAS). La detección por microscopia microscopía se realizó sobre secciones de pecíolo de LT y C que se tiñeron con Azure A, y con acetato de uranilo y citrato de plomo. Para la hibridación in situ se empleó una sonda marcada con digoxigenina dirigida hacia el gen de la proteína mayor de la cápside. Los resultados de IC-RT-PCR, IMI y Elisa fueron positivos para LT y C, indicando la presencia de variantes virales de tipo severo. Con microscopía de luz se detectaron inclusiones citoplasmáticas en las células acompañantes y del floema, confirmado con IMI y por hibridación in situ. Se visualizaron inclusiones de partículas virales en el tejido vegetal con microscopía electrónica con cambios en la ultraestructura celular como presencia de grandes vacuolas propias de la infección viral. Este trabajo integra distintas técnicas diagnósticas sobre dos especies cítricas exóticas. Palabras clave: inmunoimpresión, Elisa, hibridación, microscopía, CTV, IC-RT-PCR. Abstract Citrus tristeza virus (CTV), is deleterious for citriculture and cause citrus tristeza disease. CTV infects all Citrus species causing the death of millions of trees. Main symptoms are quick decline (QD) and stem pitting (SP). In this work serological, molecular and microscopical CTV diagnose was done in Citrus aurantifolia or Tahití Lime (Citrus latifolia Tanaka) (LT) and citrus madurensis (Lour) or Calamondino (Ca) isolates. Petioles were tissue printing (IMI) and exposed to 3DF1+3CA5 monoclonal antibodies; they were then Elisa buffer extracted and exposed to MCA 13 monoclonal discriminant antibody in a double-antibody sandwich indirected enzyme-linked Inmunossorbent Assay (DASI-Elisa). Immunocapture-reverse transcriptase amplification (IC-RT-PCR) with specific mayor coat protein gene (CPG) primers were used on the Elisa buffer extracts as template. Optic and electron microscopy detection was carried out on transversal sections of petiole and were stained with Azure A or uranile acetate and plumb citrate, respectively. Digoxigenine marked mayor CPG CTV probes were used for in situ hybridization of petioles printing. All IC-RT-PCR, IMI and Elisa results were positive for LT and C too indicating the presence of severe viral variants. Light microscopy cytoplasm inclusions were detected in the phloem and accompanying cells, confirmed with IMI and in situ hybridization. Electronic microscopy analysis showed cellular abnormalities with changes in ultraestructure with big vacuoles presence that are characteristic of cytoplasmic viral infection. This is the first work that integrate all different diagnostic techniques in this two exotics citrus species. Key words: inmunoimpression, Elisa, hibrization, microscopy, CTV, IC-RT-PCR. <hr> Introducción El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) (Closteroviridae-Closterovirus) es causa de una de las enfermedades más destructivas para los cítricos, y está presente en todos los países citrícolas, con distintos niveles de incidencia. Es endémico en Asia, Sudáfrica, Australia, Sudamérica, México y Estados Unidos, y se ha detectado con incidencias menores en los países del Mediterráneo. Los huéspedes están restringidos a la familia Rutaceae (Bar-Joseph et ál., 1989; Cambra y Moreno, 2000), y el género Poncirus tiene genes de resistencia (Rai, 2006). El primer brote masivo de la enfermedad de la tristeza sobre patrón de naranjo agrio, se observó en Argentina en 1930, y luego en Brasil en 1937 (Naranjo, 1997). La infección viral ocasiona un bloqueo de los vasos conductores impidiendo la nutrición y afectando fisiológicamente a sus huéspedes, implicando la pérdida de millones de árboles (Schneider, 1957; Cambra y Moreno, 2000). En general se reconocen tres tipos principales de síntomas: el declinamiento rápido (QD) de árboles que se encuentran injertados sobre patrón de naranjo amargo; el acanalamiento de tallo (SP) que no tiene restricciones en cuanto al patrón, y el amarillamiento de plántulas (SY), que causa pérdidas en los semilleros de cítricos e invernaderos, e involucra clorosis en hojas y crecimiento atrofiado en plantas de naranjo dulce, toronja y limón. La gama de síntomas y la intensidad de los mismos, depende de la combinación patrón-copa y cepa viral (Bar-Joseph et ál., 1989). El virus es transmitido por diferentes áfidos, entre ellos, Toxoptera citricidus, (Kirkaldy) que es el más eficiente para la transmisión de cepas severas (Roistacher y Moreno, 1991; Brlansky et ál., 2004; Broadbent et ál., 1996). La partícula viral es filamentosa y flexuosa con 2000 x 11 nm, y posee dos proteínas de cápside: p25 o proteína mayor, y p27 o proteína divergente de cápside. Ambas proteínas son inmunogénicas y se relacionan con la virulencia o transporte viral (Pappu et ál., 1993; Febres et ál., 1996, ; Karasev, 1995). Varios anticuerpos anti CTV se han obtenido, entre policlonales y monoclonales (Vela et ál., 1986; Zemzami et ál., 1993), sin embargo, pocos son útiles para discriminar entre aislados severos y suaves, como MCA 13 de USA, 109/110 de USA, 4G12 y 110E 3 de Taiwan (Permar et alál.,1990; Tsai y Hsu, 1991; Nikolaeva et ál., 1997). Diferencias de detección serológica dependiendo del anticuerpo de cubrimiento utilizado, han sido informadas por diferentes autores (Cambra et ál., 1991; Nikolaeva et ál., 1998; Martínez et ál., 2005; Martínez y Guzmán, 2007; Lbida et ál., 2005). El CTV se acumula en el citoplasma como inclusiones citoplasmáticas (IC), que incluyen agregados virales y proteína p20 (Gowda et ál., 2000). Además, la infección viral puede conllevar la formación de vacuolas de gran tamaño, anormales para el funcionamiento celular adecuado. Las IC se localizan en las células asociadas al floema, tienen utilidad diagnóstica, y se pueden observar con microscopio de luz, en cortes de tejido coloreados con Azure A o por inmunodetección (Christie y Edwardson, 1977; Brlansky, 1987; Brlansky y Lee, 1990). La IC es uno de los 49 criterios para la clasificación grupal de los virus de plantas (Brlansky, 1991); además, se han informado diferencias en cuanto al número de inclusiones dependiendo de la cepa, suave o severa, para algunos huéspedes (Ecale Zhou et ál., 2002). Por microscopía electrónica, se ha estudiado la morfología de la partícula viral a partir de purificados (Kitajima et ál., 1964; Ecale Zhou, et ál., 2002). También, la microscopía electrónica serológicamente específica (SSEM) ha sido utilizada para detectar viriones con anticuerpos específicos (Roberts y Harrison, 1979; Derrick y Timmer, 2000). En Colombia, el CTV se ha detectado desde el año 1985 (Aubert, et alál., 1992; Acosta et alál., 1994) en diferentes departamentos citrícolas, especialmente en cultivos de naranja dulce, utilizando tanto pruebas serológicas como moleculares. Los trabajos indican alta incidencia del CTV con porcentajes que varían entre el 80 y 100%. Los estudios serológicos y moleculares han determinado la presencia de algunos aislamientos suaves y otros severos (Guzmán et ál., 1993-1994; Peñaranda et ál., 1996; Oliveros et ál., 2001., Delgado et ál., 2004) incluyendo aislados con variantes virales tipo SP (Martínez, et ál., 2005), que representan una fuerte amenaza para la citricultura nacional. Algunas Limas Tahití (Citrus aurantifolia), especie reconocida como moderadamente susceptible a este virus, han sido evaluadas recientemente encontrando alta incidencia del CTV y mezcla de variantes (Guzmán et ál., 2006; Guzmán y Rodríguez, 2007). El objetivo del presente trabajo fue ampliar las herramientas de diagnóstico y de discriminación de aislados de CTV provenientes de Lima Tahití y de Calamondino (Ca) que son especies cítricas poco estudiadas en nuestro país e interesantes para la exportación (LT), utilizando diferentes aproximaciones serológicas, moleculares-hibridación, evaluando también la disposición celular del CTV y el efecto del mismo en la estructura celular, por medio de microscopía de luz y electrónica. Metodología Material vegetal Se utilizaron aislados de 8 árboles de Lima Tahití de 8 años de edad injertados en patrón de mandarina Cleopatra, y recolectados en la Corporación Colombiana para la Investigación Agropecuaria, y dos plantas ornamentales de Calamondino, mantenidas en macetas. Los árboles (LT) y las plantas (Ca) presentaban síntomas de acanalamiento de tallo (SP) (<a href="#f1">figura 1</a>). Se colectaron ramas del contorno y hojas jóvenes. Como controles se emplearon muestras de plantas cítricas obtenidas en invernadero a partir de semilla control negativo C-: Mandarina (Citrus reticulata) libre de CTV y como controles positivos se utilizaron aislados colombianos de CTV: B128 (severo), B272 y B274 (suaves) mantenidos y donados por la colección de Bestville Maryland USA. Se debe aclarar que en estudios previos, los aislados LT y los 2 Ca se reportaron como positivos para variantes SP utilizando la sonda específica marcadas con digoxigenina (B3A) que detecta variantes severas de CTV tipo Madeira que ocasionan SP en naranjos y toronjas (Guzmán y Rodríguez, 2007). <a name="f1"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f1.JPG"></a> Pruebas serológicas Se utilizó modificación de la técnica de inmunoimpresión (IMI) reportada por Garnsey et ál, (1993) y Guzmán et ál. (2001), a partir de impresiones de pecíolos, sobre membranas de nitrocelulosa de 0.,45 Μm. En resumen, se utilizó una solución de BSA al 5% en PBS-Tween para bloquear los sitios inespecíficos, durante toda la noche a 4 °C. Para la detección viral se utilizaron los anticuerpos monoclonales 3CA5 + 3DF1 (1:1000) (donados por Pedro Moreno) disueltos en buffer ECI (Agdia) por 3 horas. El anticuerpo conjugado a la fosfatasa alcalina (Goat anti Rabbit AP Sigma®) se utilizó en dilución 1:10000 en buffer ECI, durante 1 hora. Los lavados se realizaron con PBS-Tween por 3 min. El revelado se realizó con Nitro Blue Tetrazodium/Bromo Cloro Indol Fosfato (NBT/BCIP). La localización del virus se determinó bajo estereoscopio (40X) (Konus ®), por la coloración violeta resultante de la reacción fosfatasa alcalina-sustrato. La técnica Elisa-DAS se realizó siguiendo protocolos de Cambra et alál., (1989), y Guzmán, et alál. (2002). Básicamente, las muestras se maceraron en buffer de extracción (Agdia) en relación 1:10 (p/v). El sobrenadante se empleó como antígeno y el anticuerpo policlonal SP6 (donado por G. Nolasco) en dilución 1:1000 en buffer de cubrimiento (ECI Agdia) como anticuerpo primario. Como anticuerpo secundario se utilizó el MCA13 en relación 1:1000 en buffer (ECI Agdia) durante 3 horas a temperatura ambiente. Se empleó GAM (Goat anti Mouse AP Sigma ®) en dilución 1:10000 como anticuerpo conjugado a la enzima fosfatasa alcalina, y el substrato para-nitro-fenil-fosfato (1mg/ml) (Sigma®). Las densidades ópticas (D.O) de las muestras por duplicado, de la reacción enzimática se midieron a 405 nm a los 90 minutos y 16 horas en lector de Elisa Biorad ®. La técnica Elisa-DAS se realizó siguiendo protocolos de Cambra et alál., (1989), y Guzmán, et alál. (2002). Básicamente, las muestras se maceraron en buffer de extracción (Agdia) en relación 1:10 (p/v). El sobrenadante se empleó como antígeno y el anticuerpo policlonal SP6 (donado por G. Nolasco) en dilución 1:1000 en buffer de cubrimiento (ECI Agdia) como anticuerpo primario. Como anticuerpo secundario se utilizó el MCA13 en relación 1:1000 en buffer (ECI Agdia) durante 3 horas a temperatura ambiente. Se empleó GAM (Goat anti Mouse AP Sigma ®) en dilución 1:10000 como anticuerpo conjugado a la enzima fosfatasa alcalina, y el substrato para-nitro-fenil-fosfato (1mg/ml) (Sigma®). Las densidades ópticas (D.O) de las muestras por duplicado, de la reacción enzimática se midieron a 405 nm a los 90 minutos y 16 horas en lector de Elisa Biorad ®. Microscopía de luz y electrónica Se realizaron cortes transversales semifinos (4 µm de grosor aproximadamente, a mano alzada) de las mismas secciones de pecíolos empleadas en IMI; estos cortes se tiñeron con Azure A según Christie y Edwardson (1977), y se revisaron en microscopio de luz (Nikon Labophot-2). Para microscopía electrónica se obtuvieron cortes ultrafinos (60 nm de grosor) de pecíolos embebidos en resina Epón-araldita, los cuales se montaron en rejillas de cobre y se tiñeron con acetato de uranilo 1% y citrato de plomo Reynolds, se revisaron en microcopio electrónico (Jeol EM-BGM-1). IC-RT-PCR y RT-PCR Se realizó una IC-RT-PCR en un solo tubo según lo reportado en Nolasco et al., (1993) y Guzmán et ál., (2001-2002), empleando el anticuerpo SP6. Brevemente, se utilizaron extractos de las plantas LT y Ca en buffer de extracción, se incubaron por 12 horas, se lavaron con PBS-Tween y se aplicó el mix de RT-PCR, utilizando 10 pmol de cebadores forward (CTV1) y reverse (CTV10) específicos para la amplificación del gen de la proteína mayor de la cápside (CPG-p25) de CTV reportados en Nolasco et ál., (2002), con enzimas MMLV (200 U Fermentas®) y Taq (2.5 U Fermentas®), MgCl2 (2.5 mM), DTT (100 mM), dNTPs (10 mM), Buffer PCR 10X, a un volumen final de 25 µl con 35 ciclos de amplificación. Para el RT-PCR se utilizó extracción de dsRNA con fenol cloroformo y purificación con columna de Sephadex (Guzmán et ál., 1994), tomando 10% (v:v) del extracto de dsRNA viral para realizar la amplificación en un solo tubo, con los mismos cebadores y mezcla para amplificación por RT-PCR ya indicada para la reacción de IC-RT-PCR. En estudios previos se utilizó la sonda (B3A) específica para SP de CTV tipo Madeira sobre productos de PCR del CPG-p25 marcado con dUTP digoxigenina. (Guzmán y Rodríguez, 2007) basados en los informes Cevik et ál., (1996) de PCR bidireccional y PCR asimétrica de Nolasco et ál., (2002) para detectar variantes suaves y severas del virus, y mezclas en los aislados. Hibridación in situ Se obtuvieron cortes transversales de pecíolo de LT, Ca y C-, y se realizaron impresiones en membrana de nitrocelulosa, las cuales fueron tratadas según Kanemitsu y Koji (2000); brevemente, fijación en paraformaldehído 4% y HCl 0.,2 M, formamida 40% en 4xSSC, e hibridación con una sonda marcada con digoxigenina, especifica para el reconocimiento del gen de la proteína de cápside mayor (p25) de CTV, obtenida mediante PCR utilizando los cebadores CTV42 y CTV43 informados en Nolasco et ál., (2002). La hibridación se realizó durante toda la noche a 50 °C y la membrana se lavó 3 veces con formamida al 50 % en 2XSSC para limpiar residuos inespecíficos. El bloqueo se realizó con suero bovino fetal (BSA, Sigma) al 5% en PBS, durante una hora. Luego se expuso la membrana al anticuerpo anti digoxigenina conjugado a fosfatasa alcalina (1: 1000 Roche ®) en buffer ECI (Agdia). El revelado se realizó con el sustrato NBT/BCIP. Resultados discusión Las LT se detectaron como positivas para la infección con CTV por la sencilla y rápida técnica IMI con grados variables de intensidad, es decir, que algunos cortes de pecíolo de hojas del entono del árbol presentaban más acúmulos virales y otras menos (<a href="#f2">figura 2</a>). <a name="f2"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f2.JPG"></a> Con el anticuerpo monoclonal MCA13 (técnica Elisa-DAS) el cual es discriminante de aislados severos de suaves con un 95% de confiabilidad, se determinó positividad, con un rango de DO entre 0,600 y 1,5, densidades que fueron 2 veces superiores a la DO presentada por el control negativo (DO = 0,150) (<a href="#t1">tabla 1</a>). Los aislados controles positivos para CTV B272 y B274 fueron negativos para este anticuerpo (DO = 0,200) confirmando la condición de aislados suaves, como bien se conoce por su expresión de síntomas en plantas indicadoras, mientras que el aislado severo B128 , que produce SP en Toronja, tuvo una OD = 1.,2 positiva para el anticuerpo MCA13. Es decir, que los aislados de las LT y de los Ca están conformados por variantes de CTV de tipo severo, que pueden expresar en campo diferentes síntomas severos dependiendo de las condiciones ambientales y del huésped. Es de anotar que las LT utilizadas presentaban en campo una sintomatología de SP, que es considerada como severa en la medida en que reduce el vigor de la planta, el tamaño del fruto y la producción. De igual manera, en la corteza de los Ca se observó SP , como se muestra en la <a href="#f1">figura 1</a>. <a name="t1"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10t1.JPG"></a> Los cortes observados en microscopía de luz con la tinción Azure A permitieron detectar la presencia de inclusiones citoplasmáticas de coloración azul, en todo el tejido conductor, conformadas por acumulaciones de proteínas virales o partículas virales. Mediante la IMI se comprobó que las regiones reconocidas por el colorante Azure A corresponden a regiones positivas al CTV a través de la detección con los anticuerpos monoclonales 3CA5 + 3DF1, teniendo en cuenta que el corte de tejido analizado por Azure A fue el mismo que se imprimió en la membrana de nitrocelulosa (<a href="#f3">figura 3</a>). <a name="f3"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f3.JPG"></a> En el presente trabajo se encontraron algunas inclusiones, aumento de vacuolas y células colapsadas en los campos analizados en el microscopio electrónico que no se observaron en el control negativo (<a href="#f4">figura 4</a>). <a name="f4"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f4.JPG"></a> La amplificación positiva por IC-RT- PCR del gen de la proteína mayor de la cápside de CTV con un fragmento de 679 pb aproximadamente se muestra en la <a href="#f5">figura 5</a>. Por medio de RT-PCR se obtuvieron resultados similares sobre las mismas muestras (la imagen no se incluye), demostrando reproductibilidad de la amplificación del GPC de LT y Ca, en las dos metodologías. Existiendo cebadores específicos para la detección de variantes de CTV suaves y severas, estos cebadores se pueden utilizar ya sea con la técnica de PCR bi-direccional (Cevik et ál., 1996) o con la técnica de IC-RT-PCR en un solo tubo para obtener dos bandas de tamaño diferente en la migración de fragmentos en el gel de agarosa. <a name="f5"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f5.JPG"></a> Con la hibridación in situ empleando una sonda marcada con digoxigenina, sintetizada para detectar el gen de la cápside de CTV a partir de los cebadores CTV específicos (CTV 42 y 43), se identificaron regiones de hibridación en los vasos conductores en los cortes de pecíolo (<a href="#f6">figura 6</a>). <a name="f6"><img src="img/revistas/biote/v11n1/v11n1a10f6.JPG"></a> Las diferentes técnicas utilizadas en este trabajo de tipo serológico (IMI, Elisa-DAS), moleculares (IC-RT-PCR, hibridación in situ) y ópticas (microscopía de luz y microscopía electrónica), permitieron detectar al CTV en los aislados de Lima Tahití mantenidos por Corpoica Meta, y en las plántulas de Calamondino. El uso conjunto de estas metodologías es interesante, algunas de ellas son propuestas de implementación original como la hibridación in situ y el “merge” o sobreposición entre el resultado de Azure A y detección con anticuerpos (IMI) que permitieron el diagnóstico y la visualización del CTV tanto en algunos aspectos biológicos de localización viral en el tejido in situ (microscopía, IMI, hibridación in situ, serología) como en algunos aspectos bioquímicos como la amplificación y detección del gen de la proteína de la cápside por IC-RT-PCR, e hibridación in situ, debidos a la infección con el CTV. Es importante mencionar que los aislados utilizados en este trabajo tenían expresión de SP y se había informado previamente la detección de variantes SP severa utilizando sondas CTV específicas (B3A). Entonces, puesto que ya se conocía la presencia de variante SP en estos aislados, no era el interés ahondar en este aspecto sino presentar otras propuestas metodológicas simples para la detección del CTV. Tanto en LT como en Ca, se estableció la presencia de variantes de tipo severo, al usar el anticuerpo monoclonal discriminante MCA13, que como ha sido reportado es un anticuerpo que discrimina entre variantes severas y suaves del CTV con un 95% de confiabilidad. Hay que tener en cuenta que la detección con este anticuerpo es a “grosso modo”, es decir, que incluye la positividad a todas las variantes sintomáticas severas de CTV como son SP o SY o QD, las cuales pueden estar presentes en un mismo aislado. A partir de los resultados de severidad utilizando anticuerpos anti CTV, y las técnicas IMI y de Elisa-DAS, se prosiguió a realizar las metodologías para la detección viral por microscopía, sobre muestras de peciolo positivas y severas para la infección por CTV. Con la tinción con Azure A y con la observación bajo microscopía de luz se pudo visualizar un gran campo de inclusiones citoplasmáticas a nivel del floema y de las células acompañantes, típicas de la localización del CTV, que es una partícula viral que se limita a la zona de vascularización (floema) de la planta. Sin embargo, con esta tinción no se pudo delimitar cuáles regiones corresponden a la presencia de inclusiones virales y cuáles pueden corresponder al virus o a otro tipo de restos de la planta. Por tanto, al utilizar de manera original la superposición del mismo tejido expuesto a tinción con Azure A, y expuesto a anticuerpos anti CTV sobre la sección impresa en membrana de nitrocelulosa por la técnica IMI, se determinó que no existe una completa correspondencia entre los tejidos detectados por las dos técnicas, y que los anticuerpos delimitan más la localización espacial en el tejido de las inclusiones virales. Una posible razón sería que IMI solamente está detectando las regiones en las cuales está presente la cápside viral, puesto que los anticuerpos empleados están dirigidos a esta proteína específicamente, mientras que para la tinción con Azure A se reporta que la unión de este colorante se realiza frente a acumulaciones de nucleoproteína localizadas en los haces vasculares, por tanto la detección pudo ser más amplia o, por otro lado, más inespecífica incluyendo fragmentos propios de la planta. De otra parte, por microscopía electrónica en los microcortes de pecíolo se observaron vacuolas gigantes e inclusiones que hacen parte de las malformaciones citopáticas informadas con esta infección, y para los efectos citoplasmáticos de otros virus (Ecale Zhou et ál., 2002, Brlansky et ál., 2002). Las técnicas utilizadas miden aspectos diferentes por lo que no son exactamente comparables entre sí pero pueden servir, individualmente o en conjunto, para estudios investigativos o de diagnóstico viral. IMI es altamente sensible y sencilla, y aunque cualitativa, permitió un rastreo rápido de la infección en el órgano-pecíolo analizado, ubicando claramente la acumulación viral en las zonas correspondientes al floema, con correspondencia con aquellas con la tinción Azure A. La técnica Elisa-DAS proporcionó información cuantitativa del título viral en el tejido, en la medida en que se utilizó la misma muestra para realizar Elisa, IMI, IC-RT-PCR. La hibridación in situ y la microscopía electrónica, son útiles para estudios morfológicos o de expresión de genes virales durante la infección (Ecale Zhou et ál., 2002; Borlido et ál., 2002; Takeshita et ál., 2004). Es bastante posible que estas metodologías se puedan utilizar en propuestas investigativas o de diagnóstico para otras especies virales utilizando los cebadores y anticuerpos virus específicos requeridos. Conclusiones La tinción con Azure A permite localizar “inclusiones virales” en el floema y células asociadas, pero con poca claridad sobre la presencia de las acumulaciones virales en los haces vasculares; por tanto, de manera original, para la detección específica del CTV en el floema en este trabajo se utilizó de una parte microscopía de luz y tinción con Azure de los cortes transversales de pecíolo continuando con la superposición “merge” de imágenes de la misma sección expuesta a anticuepos anti CTV a través de la técnica serólogica de “tissue printing” o inmunoimpresión. De otra parte, la sonda específica de hibridación utilizada, derivada de secuencias del gen de la proteína mayor de la cápside del CTV, permitió reconocer de manera original la especificidad de infección con CTV en las células de floema y acompañantes de los cortes de pecíolo. Es decir, que la sonda reconoció en los viriones “parcialmente descubiertos” secuencias del gen de la proteína de cápside impresas en las membranas de nitrocelulosa que mostraron correspondencia de localización en el floema de la planta. Sobre los cortes transversales de pecíolo realizados con micrótomo se detectaron con microscopía electrónica los cambios en la estructura y ultraestructura celular, con presencia de grandes vacuolas debidas a la infección con este fitopatógeno confirmando los resultados de la literatura sobre vacuolización para otros cítricos infectados por el virus. Las metodologías utilizadas en conjunto por primera vez, algunas de manera original, son sencillas y permiten observar la localización y la distribución viral dentro de la planta infectada, y pueden ser útiles para detección de otras especies virales. Se señala la importancia de las técnicas serológicas y de amplificación por IC-RT-PCR para la detección viral rápida y masiva. Según nuestro conocimiento es la primera vez que se realiza la detección del CTV en plantas ornamentales y en Lima Tahiti utilizando este conjunto de técnicas serológicas, moleculares y ópticas , las cuales no son per se comparables entre sí por cuanto evalúan aspectos bioquímicos y biológicos distintos, y se pueden utilizar independientemente ya sea para efectos de investigación básica o de diagnóstico de plantas únicas (microscopía electrónica, hibridación in situ, Azure A y serología) o de diagnóstico masivo (serología, IC-RT-PCR, hibridación in situ). En Colombia, la Lima Tahití es una especie interesante para la exportación, y es poco lo que se ha estudiado con relación a la susceptibilidad al CTV. También es poco lo que se sabe sobre los efectos del CTV en cítricos ornamentales como los calamondinos, que se utilizan en los bancos de germoplasma, viveros y cultivadores como patrones de injerto a pesar de ser reservorios del CTV incluyendo variantes de tipo severo, lo que puede potenciar la expresión de síntomas severos. Es importante continuar estudios de diferente orden (serológicos, moleculares, biológicos y de microscopía) para ampliar la caracterización de cepas virales y vislumbrar estrategias futuras de control viral. Agradecimientos Las autoras expresan sus agradecimientos a la Universidad Nacional de Colombia (DIB, Instituto de Biotecnología, y al Laboratorio de Microscopía) por la financiación del presente trabajo; al doctor Javier Orduz y a Corpoica-Meta por la colaboración con las muestras cítricas; al doctor G. Nolasco de la Universidad de Algarbe, Portugal, por la donación del anticuerpo SP6; al doctor S. Garnsey por la donación del anticuerpo MCA13, y al doctor Pedro Moreno por la donación de los anticuerpos 3CA5 + 3DF1. Referencias bibliográficas 1 Acosta, O., Alegría, A., Guzmán, M., Lee, R., Niblett, C., Peñaranda, J. 1994. El Virus de la Tristeza de los Cítricos: una grave amenaza para la citricultura colombiana. Bogotá: Ed. Científica. 2 Aubert, B., Etienne, J., Cottin, R., Leclant, F., Cao Van, P., Villaume, C., Jaramillo, C., Barneau, G. 1992. Citrus tristeza virus a new threat for the Caribbean basin. Report of a survey to Colombia, Dominican Republic, Guadaloupe. Martinique and Trinidad. Fruits 3: 393-404. 3 Bar-Joseph, M., Marcus, R., Lee, R. F. 1989. The continuous challenge of Citrus tristeza virus control. Annual Review of Phytopathology 27: 292-316. 4 Borlido, J., Pereira, S., Ferreira, R., Coelho, N., Duarte, P., Pissarra, J. 2002. Simple and Fast in situ Hybridization. Plant Molecular Biology Reporter 20: 219-229. 5 Brlansky, R. H., 1987. Inclusions Bodies produced in citrus spp. by citrus Tristeza virus. Phytophylactica 19: 211-213. 6 Brlansky R. H., Lee, R. 1990. Numbers of inclusion bodies produced by mild and severe strains of citrus tristeza virus in seven hosts. Plant Disease 74: 297-299. 7 Brlansky, R. H. 1991. Detection of citrus tristeza virus inclusion bodies using azure A staining and in situ immunofluorescence. In: Grtaf-Transmissible diseases of citrus. Handbook for detection and diagnosis. Roistacher editor. California: University of California, Riverside, USA IOCV, FAO. Rome. 8 Brlansky, R. H., Howd, D. S., Broadbent, P., Damsteegt, V. D. 2002. Histology of Sweet Orange Stem Pitting Caused by an Australian Isolate of Citrus tristeza virus. Plant Disease 86:1169-1174. 9 Brlansky, R. H., Roy, A., Damsteegt, V. D. 2004. Aphid transmission of stem pitting citrus tristeza virus from mixed virus infections. Phytopathology 94:100. 10 Broadbent, P., Brlansky, R. H., Indsto, J. 1996. Biological characterization of australian isolates of citrus tristeza virus and separation of subisolates by aphid transmissions. Plant Disease 80: 329-333. 11 Cambra, M., Camarasa, E., Gorris, M., Garnsey, S., Carbonell, E. 1991. Comparison of different inmunosorbent assays for citrus tristeza virus (CTV) using CTV specific monoclonal and polyclonal antibodies. Proccedings of the 11th Conference of the International Organization of Citrus virologists. Riverside: IOCV. University of California, pp. 38-45. 12 Cambra M., Ballester-Olmos J. F., Pina J. A., Lavina A., Camarasa E. 1989. Distinction of populations infected with severe and common strains of the citrus tristeza virus in Spain, by the Elisa-DASc (quantitative). Fruits 44: 335-41. 13 Cambra, M., Moreno, P. 2000. Tristeza. En: Duran-Vila, N., Moreno, P. 2000. Enfermedades de los Cítricos: Monografía de la sociedad fitopatológica española No. 2. Madrid: Ediciones Mundi. 14 Cevik, B., Pappu, S. S., Pappy, H. P., Benscher, D., Irey, M., Lee, R. F., Niblett, C. L. 1996. Application of bi-directional PCR to citrus tristeza virus: detection and strain differentiation. In: Proccedings of the 13th Conference of the International Organization of Citrus virologists. Riverside: IOCV. University of California, pp. 17-24. 15 Christie, G. G., Edwardson, J. R. 1977. Light and electron microscopy of plant virus inclusions. Fla. Agric. Exp. Stn. Monogr. Ser. 9. 16 Delgado, J., Guzmán, M., Caicedo, A., Ordúz, J. 2004. CTV screening of Colombian germplasm banks kept in Palmira (Valle del Cauca) and Villavicencio (Meta) and preliminary estimation of CTV variants by RFLP and SSCP. 44 Meeting of the American Phytopathological Society Caribbean Division. La Habana, mayo 24-28. Memorias. 17 Derrick, K. S., Timmer, V. 2000. Citrus blight and other diseases of recalcitrant etiology Annual Review of Phytopathology 38: 181-205. 18 Ecale Zhou, C. L., Ammar, E. D., Sheta, H., Kelley, S., Polek, M., Ullman, D. E. 2002. Citrus tristeza virus ultraestructure and associated cytopathology in Citrus sinensis and Citrus aurantifolia. Canadian Journal of Botany 80:512-525. 19 Febres, V. J., Ashoulin, L., Mawassi, M., Frank, A., Bar-Joseph, M., Manjunath, K. L., Lee, F. R., Niblett, C. L. 1996. The P27 Protein is present at one end of citrus tristeza particle. Phytopatology 86:1331-1335. 20 Garnsey, S. M., Permar, T. A., Cambra, M., Henderson, C. T. 1993. Direct tissue blot immunoassay (DTBIA) for detection of citrus tristeza. In: Proccedings of the 12th Conference of the International Organization of Citrus virologists. Riverside: IOCV. University of California, pp. 30-50. 21 Gowda, S., Satyanarayana, T., Davis, C. L., Navas-Castillo, J., Albiach-Marti, M. R., Mawassi, M., Valkov, N., Bar-Joseph, M., Moreno, P., Dawson, W. O. 2000. The p20 gene product of citrus tristeza virus accumulates in the amorphous inclusion bodies. Virology 274:246-254. 22 Guzmán-Barney, M., Manjunath, K. L., Pappu, S., Pappu, H., Febres, V., Lee, R. Niblett, C. 1993. Characterization of coat protein genes of citrus tristeza strains from Colombia. Phytopathology 83: 1403. 23 Guzmán-Barney, M., Manjunath, K. L., Pappu, S., Pappu, H., Febres, V., Lee, R. Niblett, C. 1994. Comparación de secuencias del gen de la proteína de la cápside de aislamientos colombianos del virus de la tristeza de los cítricos. Revista Fitopatología Colombiana 18: 107-113. 24 Guzmán, M., Caro, M., García, Y. 2001. Técnica de inmunoimpresión en membranas de nitrocelulosa: una detección rápida para estimar la incidencia de los virus PLRV, PVX, PVY y PVS que infectan a la papa Solanum spp. Revista Colombiana de Biotecnología 4: 45-51. 25 Guzmán, M., Bermúdez, Y., Castro, C. 2001. Identificación del YMMV en muestras de Disocorea alata de la Costa Atlántica colombiana. Caracterización biológica, serológica y molecular. Revista Colombiana de Biotecnología 3: 72-79. 26 Guzmán, M., Vernière, C., Niblett, C., Bové, J. M. 2002. Biological, Serological and molecular characterization of two CTV isolates from Corsica. In: Proccedings of the 15th Conference of the International Organization of Citrus virologists. Riverside: IOCV. University of California, pp. 158-164. 27 Guzmán, M., Rodríguez, P., Ordúz, J., Nolasco, G. 2006. Ponencia: Situación del virus de la tristeza de los cítricos en Limas colombianas (Mexicana y Tahití) -Una aproximación molecular. 46 Meeting of the American Phytopathological Society- Caribbean Division. Y XXVIII Congreso ASCOLFI. Memorias CD. Septiembre 12-16. 28 Guzmán, M., Rodríguez, P. 2007. Uso de sondas específicas para la detección rápida de variantes y mezclas del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) en aislados de campo. II Simposio Internacional de Fruticultura Tropical y Subtropical. La Habana. Abstract, CD. Septiembre 17-21. 29 Kanemitsu, Y., Koji, T. 2000. Molecular Histochemical Techniques. Germany: Springer. 30 Karasev, M., Boyoko, V., Gowda, V., Nikolaeva, O., Hilf, M., Koonin, M., Nibellt, C., Cline, K., Gumpf, D., Lee, R., Garnsey, S., Levandowsky, D., Dawson, W. 1995. Complete sequence of the citrus tristeza virus RNA genome. Virology 208: 511-520. 31 Kitajima, E. W., Silva, D. M., Oliveira, A. R., Müller, G. M., Costa, A. S. 1964. Thread-like particles associated with tristeza disease of citrus. Nature 201: 1011-1012. 32 Lbida, B., Bennani, A., Serrhini, M. N., Zemzami, M. 2005. Biological, serological and molecular characterization of three isolates of citrus tristeza closterovirus introduced into Morocco EPPO BULLETIN 35: 511. 33 Martínez, S., Guzmán, M., Oliveros, O., Acosta, O. 2005. Secuenciamiento de la proteína de la cápside de dos aislados colombianos del virus de la tristeza de los cítricos (CTV). XXVI Congreso Ascolfi. Bogotá. Memorias. 34 Martínez, S., Guzmán, M. 2007. Serological analysis of Colombian Citrus tristeza virus isolates. Phytopathology 97: S175. 35 Naranjo, M. 1997. Reseña bibliográfica sobre la enfermedad tristeza de los cítricos. Levante Agrícola 3: 227-240. 36 Nikolaeva, O., Karasev, A., Powell, Ch., Garnsey, S., Lee, R. 1997. Modulation of the antigenic reactivity of the citrus tristeza virus coat protein. Journal of Immunological Methods 206: 97-105. 37 Nikolaeva, O., Karasev, A., Garsey, S., Lee, R. 1998. Serological differentiation of the citrus tristeza virus causing stem pitting in sweet oranges. Plant Disease 82: 1276-1280. 38 Nolasco, G., Blas, C. D., Torres, V., Pons, F. 1993. Method combining inmunocapture and PCR amplication in a microtite plate for the detection of plant viruses and subviral pathogens. Journal of Virological Methods 45: 201-218. 39 Nolasco, G., Squeira, Z., Soares, C., Mansinho, A., Bailey, A., Niblett, C. L. 2002. Asymmetric PCR Elisa: Increased sensitivity and reduced costs for the detection of plant viral and other nucleic acids. European Journal of Plant Pathology 108: 293-298. 40 Oliveros, O., Torres, J., Morales, G., Guzmán, M., Acosta, O., Peñaranda J. 2001. Two common haplotypes of the CPm gene(p27) in Colombian field isolates of the citrus tristeza virus. In: Proccedings of the 15th Conference of the International Organization of Citrus virologists. Riverside: IOCV. University of California, Abstracts. 41 Pappu, H., Pappu, S., Niblett, C., Lee, R., Civerolo, E. 1993. Comparative sequence analysis of the coat proteins of biological distinct citrus tristeza closterovirus isolates. Virus Genes 7: 225-264. 42 Peñaranda, J., Acosta, O., Guzmán, M., Alegría, A., Manjunath, K., Lee, R., Niblett, C. 1996. Biological and molecular characterization of mild and severe isolates of CTV from Colombia. In: Proccedings of the 13th Conference of the International Organization of Citrus virologists. Riverside: IOCV. University of California, pp. 71-76 43 Permar, T., Garsey, S., Gumpf, D., Lee, R. 1990. A monoclonal antibody that discriminate strains of citrus tristeza virus. Phytopathology 80: 224-228. 44 Rai, M. 2006. Refinement of the Citrus tristeza virus resistance gene (Ctv) positional map in Poncirus trifoliata and generation of transgenic grapefruit (Citrus paradisi) plant lines with candidate resistance genes in this region. Plant Molecular Biology 61: 399-414. 45 Roberts, I. M., Harrison, B. D. 1979. Detection of potato leafroll and potato mop-top viruses by immunosorbent electron microscopy. Annals of Applied Biology 93: 289-297. 46 Roistacher, C. N., Moreno, P. 1991. The worldwide threat from destructive isolates of citrus tristeza virus a review. In: Proccedings of the 11th Conference of the International Organization of Citrus virologists. Riverside: IOCV. University of California, pp. 7-19. 47 Schneider, H. 1957. The Anatomy of Tristeza virus Infected Citrus. Proc. Conf Citrus Virus Disease 18-22. 48 Takeshita, M., Shigemune, N., Kikuhara, K., Furuya, N., Takanami, Y. 2004. Spatial analysis for exclusive interactions between subgroups I and II of Cucumber mosaic virus in cowpea. Virology 328: 45-51. 49 Tsai, M., Hsu, H. 1991. Development and characterization of monoclonal antibodies to Citrus tristeza virus (CTV) strains in Taiwan. In: Proccedings of the 11th Conference of the International Organization of Citrus virologists. Riverside: IOCV. University of California, pp. 46-50. 50 Vela, C., Cambra, M., Cortés, E., Moreno, P., Miguet, J., Perez de San Roman. 1986. Production and characterization of monoclonal antibodies specific for Citrus tristeza virus: and their use for diagnosis. Journal of General Virology 67: 91-96. 51 Zemzami, M., Hill, J., Van Deusen, R., Nadori, E. 1993. Characterization of monoclonal antibodies raised against Citrus tristeza virus in Morocco. In: Proccedings of the 12th Conference of the International Organization of Citrus virologists. Riverside: IOCV. University of California, pp. 93-99. </body> </html>

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Rodríguez, P., Romero de Pérez, G. y Guzmán, M. (2009). Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ. Revista Colombiana de Biotecnología, 11(1), 94–106. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/10335

ACM

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Rodríguez, P., Romero de Pérez, G. y Guzmán, M. 2009. Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ. Revista Colombiana de Biotecnología. 11, 1 (ene. 2009), 94–106.

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(1)

Rodríguez, P.; Romero de Pérez, G.; Guzmán, M. Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ. Rev. colomb. biotecnol. 2009, 11, 94-106.

ABNT

RODRÍGUEZ, P.; ROMERO DE PÉREZ, G.; GUZMÁN, M. Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ. Revista Colombiana de Biotecnología, [S. l.], v. 11, n. 1, p. 94–106, 2009. Disponível em: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/10335. Acesso em: 18 ene. 2025.

Chicago

Rodríguez, Patricia, Gloria Romero de Pérez, y Mónica Guzmán. 2009. «Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ». Revista Colombiana De Biotecnología 11 (1):94-106. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/10335.

Harvard

Rodríguez, P., Romero de Pérez, G. y Guzmán, M. (2009) «Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ», Revista Colombiana de Biotecnología, 11(1), pp. 94–106. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/10335 (Accedido: 18 enero 2025).

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P. Rodríguez, G. Romero de Pérez, y M. Guzmán, «Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ», Rev. colomb. biotecnol., vol. 11, n.º 1, pp. 94–106, ene. 2009.

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Rodríguez, P., G. Romero de Pérez, y M. Guzmán. «Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ». Revista Colombiana de Biotecnología, vol. 11, n.º 1, enero de 2009, pp. 94-106, https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/10335.

Turabian

Rodríguez, Patricia, Gloria Romero de Pérez, y Mónica Guzmán. «Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ». Revista Colombiana de Biotecnología 11, no. 1 (enero 1, 2009): 94–106. Accedido enero 18, 2025. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/10335.

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1.

Rodríguez P, Romero de Pérez G, Guzmán M. Detección del virus de la tristeza de los cítricos por serología, microscopía e hibridación in situ. Rev. colomb. biotecnol. [Internet]. 1 de enero de 2009 [citado 18 de enero de 2025];11(1):94-106. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/10335

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