Obtención de vesículas de las microvellosidades del epitelio intestinal del gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax Hustache

Brush border membrane vesicle purification using Andean Potato Weevil (premnotrypes vorax Hustache) epithelial midgut tissue

La exploración del uso potencial de microorganismos como agentes de control biológico de plagas requiere estudios básicos acerca de su mecanismo de acción en el insecto blanco seleccionado. El empleo de vesículas obtenidas a partir de las microvellosidades epiteliales del intestino de los insectos (BBMVs), se ha constituido en una herramienta valiosa a nivel mundial para el estudio del mecanismo de acción de las proteínas de Bacillus thuringiensis considerado como el agente de control microbiológico por excelencia. El objetivo del presente trabajo fue normalizar una metodología para la obtención de BBMVs a partir del intestino del gusano blanco de la papa, con el fin de utilizarlas posteriormente en estudios para determinar la potencialidad de uso de proteínas de B. thuringiensis con actividad toxica hacia coleópteros, para el control biológico de este insecto. El trabajo se llevó a cabo empleando larvas de último instar de P. vorax, obtenidas de una cria de laboratorio. Se partió de la metodología propuesta por Wolfersberger et al. (1987) con modificaciones desarrolladas por los autores. Las BBMVs obtenidas se caracterizaron mediante electroforesis de proteínas SDS PAGE y microscopia electrónica de transmisión. Asi mismo, se cuantifico la cantidad de proteína total obtenida por mi de purificado. Se logro la obtención de un purificado de vesículas con tamaños y formas de características similares a los reportados en la literatura internacional por otros autores. La concentración promedio de proteína total obtenida fue de 1mg/ml, siendo adecuada para estudios de unión con proteínas de B. thuringiensis. El análisis electroforético indicó la presencia de un complejo de proteínas en el purificado con pesos moleculares que oscilan entre 24 y 116 KDa. La metodología de purificación para obtener BBMVs será empleada en estudios de unión de proteínas de B. thuringiensis con las proteínas receptoras presentes en las microvellosidades del intestino del gusano blanco de la papa.

The use of micro-organisms as biological pest control agents requires basic studies related to their action mechanism inside the target insect. Brush border membrane vesicles (BBMVs) obtained from different insects' epithelial gut tissues have become a valuable tool worldwide in action mechanism studies employing Bacillus thuringiensis, which is considered to be the micro-organism most used for biological pest control in agriculture throughout the world. This work's objective was to standardise a BBMV purification methodology using Andean potato weevil gut tissues for use in further studies with coleopteran B. thuringiensis proteins, exploring their potential in turn as P. vorax biological control agents. This work was carried out with P. vorax late stage larvae, obtained from a laboratory colony. BBMVs purification methodology was standardised by using a basic methodology developed by Wolfersberger et al (1987). BBMVs were characterised by SDS PAGE and electrón microscopy analysis. Total protein present was also quantified. A BBMV purificate was obtained, having vesicles with size and shape similar to others reported in the international literature. Average total protein was 1 mg/ml, this being suitable for B. thuringiensis protein binding assays. BBMV SDS PAGE analysis showed a protein complex with proteins ranging from 24 KDa to 116 KDa. Nowadays, BBMV purification methodology is being used in B thuringiensis protein binding studies with brush border receptors present in Andean potato weevil gut.