Regeneración de brotes adventicios en hojas de guayaba (Psidium guajava L.) cultivadas in vitro

Adventitious shoot regeneration from in vitro cultured leaves of guava (Psidium guava L.)

La regeneración de brotes adventicios es una etapa clave para la aplicación de las técnicas de ingeniería gené­tica. El presente trabajo tuvo como objetivo el desarrollo de un procedimiento para la regeneración de brotes por organogénesis a partir de hojas de microesquejes o brotes de guayaba (Psidium guajava L.) cultivados in vi­tro. Para ello se estudiaron algunos de los principales factores que afectan la regeneración de brotes, tales como la concentración de reguladores del crecimiento (citoquinina), el estado fisiológico del explante y la he­rida. En todos los experimentos se utilizaron como explantes hojas de vitroplantas de guayaba de la variedad Enana Roja Cubana EEA18-40 de diferentes subcultivos. El mejor resultado se alcanzó con una concentración de 0,75 mg/L de 6-bencilaminopurina como suplemento hormonal del medio MS. Se comprobó que para las hojas provenientes de microesquejes con mayor número de subcultivo y tomadas de la parte inferior de los brotes, el potencial morfogenético disminuye significativamente (p<0,05). La frecuencia de regeneración de brotes más alta (>60%) y el mayor número de brotes por explante promedio (>3) se alcanzó al realizar varias heridas en forma de punteaduras en el nervio central de las hojas. Este protocolo de regeneración constituye una importante herramienta que puede ser empleada para futuros estudios de transformación genética en esta especie. Palabras clave: cultivo de tejidos, explantes de hoja, reguladores de crecimiento, organogénesis, guayaba.

Adventitious regeneration is a key step in the application of genetic engineering to the breeding programs of plants. In this work a method for adventitious shoot regeneration from leaves of micropropagated guava shoots has been developed and some of main factors to affect the shoot regeneration like, concentration of plant growth regulators (citoquinine), physiological state of explants and the wound are studied. Leaves from guava in vitro cultured of variety Cuban Red Dwarf 18-40 was used like explant in all experiments. The best re-sult was reached with MS basal medium supplemented with 0.75 mg/L of 6-benzylaminopurine. Was de-monstrated that for the leaves with more multiplication subculture number and taken from lower part of shoot (older); the morfogenetic potential falls significantly (p<0.05). The highest shoot regeneration rate (>60%) and the largest number of shoot per regenerating leaf (>3) were obtained with several wounds carried out in f orm of jabs to the central nerve of leaves. This regeneration protocol constitutes an important tool that can be applied for future studies of genetic transformation in this species. Key words: Tissue culture, leaf explants, growth regulators, organogenesis, guava

	REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL.VI No. 2 Diciembre 2004 54-61_________________ Regeneración de brotes adventicios en hojas de guayaba (Psidium guajava L.) cultivadas in vitro Adventitious shoot regeneration from in vitro cultured leaves of guava (Psidium guava L.)
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	Óscar Concepción Laffitte*, Lelurlys Nápoles Borrero** , Aurora Pérez Martínez***, Ninel Peralta Ballbé****, Reinaldo Trujillo Sánchez*** RESUMEN La regeneración de brotes adventicios es una etapa clave para la aplicación de las técnicas de ingeniería gené­tica. El presente trabajo tuvo como objetivo el desarrollo de un procedimiento para la regeneración de brotes por organogénesis a partir de hojas de microesquejes o brotes de guayaba (Psidium guajava L.) cultivados in vi­tro. Para ello se estudiaron algunos de los principales factores que afectan la regeneración de brotes, tales como la concentración de reguladores del crecimiento (citoquinina), el estado fisiológico del explante y la he­rida. En todos los experimentos se utilizaron como explantes hojas de vitroplantas de guayaba de la variedad Enana Roja Cubana EEA18-40 de diferentes subcultivos. El mejor resultado se alcanzó con una concentración de 0,75 mg/L de 6-bencilaminopurina como suplemento hormonal del medio MS. Se comprobó que para las hojas provenientes de microesquejes con mayor número de subcultivo y tomadas de la parte inferior de los brotes, el potencial morfogenético disminuye significativamente (p<0,05). La frecuencia de regeneración de brotes más alta (>60%) y el mayor número de brotes por explante promedio (>3) se alcanzó al realizar varias heridas en forma de punteaduras en el nervio central de las hojas. Este protocolo de regeneración constituye una importante herramienta que puede ser empleada para futuros estudios de transformación genética en esta especie. Palabras clave: cultivo de tejidos, explantes de hoja, reguladores de crecimiento, organogénesis, guayaba. ABSTRACT Adventitious regeneration is a key step in the application of genetic engineering to the breeding programs of plants. In this work a method for adventitious shoot regeneration from leaves of micropropagated guava shoots has been developed and some of main factors to affect the shoot regeneration like, concentration of plant growth regulators (citoquinine), physiological state of explants and the wound are studied. Leaves from guava in vitro cultured of variety Cuban Red Dwarf 18-40 was used like explant in all experiments. The best re-sult was reached with MS basal medium supplemented with 0.75 mg/L of 6-benzylaminopurine. Was de-monstrated that for the leaves with more multiplication subculture number and taken from lower part of shoot (older); the morfogenetic potential falls significantly (p<0.05). The highest shoot regeneration rate (>60%) and the largest number of shoot per regenerating leaf (>3) were obtained with several wounds ca-
	* Ingeniero agrónomo. ** Magíster en biotecnología vegetal (ingeniero agrónomo). *** Magíster en biotecnología vegetal (licenciada en biología). **** Licenciada en bioquímica. ***** Doctor en ciencias biológicas (licenciado en biología). Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos, Centro de Bioplantas, Universidad de Ciego de Ávila, carretera a Morón, km 9 Va, CP 69450, Ciego de Ávila, Cuba. Correo electrónico: oconcepcion@bioplantas.cu Recibido: marzo 29 de 2004. Aceptado: octubre 22 de 2004.
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	REGENERACIÓN DE BROTES ADVENTICIOS EN HOJAS DE GUAYABA (Psidium guajava L.)
	rried out in f orm of jabs to the central nerve of leaves. This regeneration protocol constitutes an important tool that can be applied for future studies of genetic transformation in this species. Key words: Tissue culture, leaf explants, growth regulators, organogenesis, guava.
	INTRODUCCIÓN La guayaba es considerada una de las más valiosas frutas tropicales, tanto por su valor alimenticio como por su importancia agroecológica. Posee un elevado contenido de vitamina C, que en ocasiones sobrepasa los 400 mg en 100 g de pulpa (Peña et al., 1996), ade­más de abundantes fibras, vitamina A, pectina, fósforo, calcio y potasio (Yadava, 1994), aspectos que la con­vierten en un alimento natural muy apetecido. En Cuba su cultivo se ha intensificado con el auge de la industria de productos alimenticios y el turismo. Muchos son los problemas que afectan este cul­tivo desde varios puntos de vista. Dentro de los fruta­les tropicales es uno de los más afectados por plagas y enfermedades. Se señalan más de 70 especies de insectos que inciden de forma perjudicial sobre la guayaba, entre los que se destacan el bicho de San Juan o mosca antillana de la fruta (Anastrepha mom-bipraeoptans Sein) y los nemátodos de los géneros Meloidogyne y Pratylenchus (Peña, 1996). Por otro lado, la maduración de los frutos ocurre de forma rápi­da, lo cual dificulta las actividades de poscosecha, de almacenamiento y traslado a las áreas urbanas, ade­más de que limita la exportación como fruta fresca por parte de los países productores (McGuire y Hallman, 1995). La biotecnología puede jugar un papel funda­mental en la solución de estos problemas a través de herramientas como la transformación genética. Sin embargo, para ello es necesario contar con un siste­ma de regeneración adventicia de plantas que permi­ta la aplicación de las técnicas de ingeniería genética. La selección de tejidos somáticos con capaci­dad regenerativa es imprescindible para los protoco­los de transformación genética. En más de una oca­sión se han utilizado las hojas como material vegetal con potencial morfogenético capaz de regenerar plantas en especies leñosas tanto por organogénesis (Pérez-Tornero et al., 2000; Liu y Bao, 2003) como por embriogénesis somática (Fernández-Guijarro et al., 1995; Toribio et al., 2004). En guayaba los inten­tos por llevar a cabo la formación de callos y/o rege­neración de brotes a partir de segmentos de hojas de campo han fallado, fundamentalmente a causa de la	alta fenolización y poca viabilidad de los explantes (Ramírez y Salazar, 1998). En la guayaba (Amin y Jaiswal, 1988; Papada-tou et al., 1990; Mohamed-Yassen et al., 1995; Pé­rez et al., 2002), al igual que en muchas otras Myrta-ceae (Toussaint et al., 1992; List et al., 1996; Sha Valli Khan et al., 1999; Oltramari et al., 2000), se ha llevado a cabo la propagación con el empleo de las técnicas del cultivo in vitro, y se ha demostrado que posee resultados ventajosos con respecto a los mé­todos convencionales. Trabajos recientes (Nápoles et al., 2003) han permitido cultivar y propagar in vitro brotes de guayaba obtenidos a partir de yemas de rebrotes de la raíz de árboles adultos. Loh y Rao (1989), señalaron por primera vez la organogénesis a partir de hojas de brotes de guayaba que se multiplicaban in vitro como parte de la obser­vación de experimentos de micropropagación y consi­deraron que se trataba de un evento poco reproduci-ble. Sin embargo, no realizaron estudios posteriores de optimización que permitieran la utilización de este proceso morfogénico como una herramienta para los especialistas en transformación genética. Por otro lado, la formación de brotes fue observada únicamen­te a partir del material proveniente de semillas y no a partir de material proveniente de tejidos maduros. Por último, se debe destacar que para el caso de la guayaba no se conoce de la existencia de un procedimiento de regeneración adventicia de brotes que permita ser utilizado como herramienta para la transformación genética de esta especie. Por todo lo anterior, este trabajo tiene como ob­jetivo lograr un procedimiento para la regeneración de brotes a partir de hojas provenientes de brotes de guayaba (Psidium guajava L.) cultivados in vitro. Todo ello por medio del estudio de algunos de los factores que intervienen en dicho proceso. MATERIALES Y MÉTODOS Procedimientos generales para el establecimien­to del cultivo in vitro. Se colectaron yemas de
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	rebrotes de la raíz de plantas de guayaba de la varie­dad Enana Roja Cubana EEA 18-40 cultivadas bajo condiciones de vivero, en una solución de PVPP (0,5%) y se sometieron a un proceso de desinfección con bicloruro de mercurio (0,05%) durante 20 minu­tos, luego se lavaron con abundante agua destilada estéril. La implantación y el establecimiento in vitro se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito por Nápoles et al. (2003). Posterior a la desinfección, y después de varios subcultivos de multiplicación, los brotes o microes-quejes de aproximadamente 2,0 cm de altura con dos pares de hojas abiertas se individualizaron y se colocaron en frascos de cultivo que contenían 25 mL de medio de enraizamiento MS (Murashige y Skoog, 1962) sin reguladores del crecimiento y se incubaron en cámara de luz artificial con intensidad de 87,5 |jmol.m~2.s~1 y fotoperiodo de 16 horas luz a una tem­peratura de 26±1 °C. Al cabo de 45 días se tomaron las hojas de los microesquejes enraizados cortando por el pecíolo, las cuales se utilizaron como explan­tes para realizar los diferentes experimentos de re­generación de brotes. Efecto de diferentes concentraciones de la 6-ben-cilaminopurina (BAP). Las hojas intactas separadas por el pecíolo se colocaron con polaridad axial en reci­pientes de cultivo que contenían 25 mL de medio de cultivo MS suplementado con ácido indol-3-acético (AIA) a 0,1 mg/L y diferentes concentraciones de BAP (0,25; 0,50; 0,75; 1,00; 1,50 y 2,00 mg/L). Se estable­ció un control sin citoquinina. Las condiciones de incu­bación fueron similares a las descritas con anteriori­dad para el enraizamiento de los microesquejes. A los 45 días se realizó la observación y evaluación de los resultados. Se evaluó el porcentaje de explantes muertos, de formación de protuberancias, así como de formación de raíces y/o brotes. Efecto del estado fisiológico del explante en la for­mación de brotes. Microesquejes de diferentes eda­des o generaciones (diferentes números de subculti­vos de multiplicación luego del establecimiento in vitro): I- generación con 1 subcultivo; II- generación con 2 subcultivos; III-generación con 5 subcultivos; IV-gene­ración con 6 subcultivos se transfirieron al medio de enraizamiento descrito anteriormente. Al cabo de 45 días se utilizaron los pares de hojas de acuerdo con el orden en que éstos se encuentran en el tallo. Se enu­meraron de arriba hacia abajo a partir del ápice hasta el cuarto par de hojas expandidas y sin contacto directo	con el medio. Estas hojas se separaron del brote por el pecíolo y se colocaron, manteniendo la clasificación anterior y con polaridad axial, en cultivos que conte­nían 25 mL de medio de cultivo de regeneración de brotes de acuerdo con el mejor resultado del experi­mento anterior. Los cultivos se incubaron en iguales condiciones de luz, fotoperiodo y temperatura. Al cabo de 45 días se realizó la evaluación del porcentaje de explantes muertos, de formación de protuberancias (pequeños nódulos meristemáticos) y de formación de brotes. También se determinó el número de brotes emitidos por explante. Efecto de la herida en la formación de brotes. Se tomaron hojas de microesquejes de guayaba cultiva­dos in vitro de acuerdo a los mejores resultados de los experimentos anteriores y se procedió a cortarlas de la siguiente forma: Hojas intactas (solamente cor­tadas por el pecíolo). Hojas cortadas por el pecíolo y seccionadas transversalmente a % del área del lim­bo. Hojas cortadas por el pecíolo y con 5 punteadu-ras en la nervadura central. Todos estos explantes se colocaron con polari­dad axial en un medio de cultivo de regeneración de brotes y en condiciones de incubación similares al primer experimento. A los 45 días se realizó una eva­luación del porcentaje de explantes muertos, de for­mación de protuberancias, de formación de brotes, así como del número de brotes por explante. Análisis estadístico de los datos. Todos los experi­mentos se montaron colocando cinco explantes por frasco y siete frascos por tratamiento. Para las eva­luaciones porcentuales se tomó el 100% como el nú­mero inicial de explantes puestos en cultivo y los da­tos se transformaron mediante de la ecuación x'= 2*arcosin(sqrt(x/100)) con el objetivo de lograr distri­bución normal y homogeneidad de varianza. Con el mismo objetivo se utilizó para los datos de variables discretas la ecuación x'= sqr(x+0.5). A los datos trans­formados se les realizó un análisis de varianza Anova y la prueba Tukey para un valor de p<0,05. Se utilizó el paquete estadístico SPSS 8,0 para Windows. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Efecto de diferentes concentraciones de BAP. En la tabla 1 se muestra el efecto de la concentración de BAP en la respuesta morfogenética de las hojas de guayaba al cabo de 45 días de iniciado el cultivo.
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	La supervivencia de los ex­plantes se ve afectada por la con­centración de BAP utilizada en el medio de cultivo. El mayor porcen­taje de explantes muertos se ob­servó en la dosis de 2.0 mg/L, se­guido por el tratamiento testigo. La muerte del explante se caracterizó en todos los casos por una decolo­ración paulatina del limbo de la hoja hasta tornarse completamen­te clorótico. Por último la hoja comienza a ennegrecerse y muere. En las concentraciones de 0,50; 0,75 y 1,00 mg/L no ocurrió la muer­te de ninguno de los explantes.	Tabla 1. Efecto de la concentración de BAP a los 45 días de cultivo
		BAP (mg.L-1) Explantes muertos (%) Porcentaje de formación de (%) Protuberancias Raíces Brotes 0,0 (testigo) 12,0 c 100 a 100 a 0,0 e 0,25 4,0 b 100 a 0b 16,0 d 0,50 0,0 a 100 a 0b 28,0 bc 0,75 0,0 a 100 a 0b 48,0 a 1,00 00 a 00,0 a 0b 32,0 b 1,50 4,0 b 100 a 0b 20,0 cd 2,00 20,0 d 48 b 0b 0,0 e ES 3,2 1,7 0,0 5,8 (Medias con letras desiguales difieren significativamente según Anova y Tukey para p<0,05).
			El uso de citoquininas en la regeneración de plantas a partir de explantes foliares es una práctica frecuente en el cultivo de tejidos (Lain et al., 1994; Ramírez y Salazar, 1998; Dronne etal., 2003; Genti-le et al., 2003; Liu y Bao, 2003; Toribio et al., 2004). Loh y Rao (1989) señalaron por primera vez la formación de estructuras nodulares a las que denomi­naron protuberancias, las cuales se formaban a partir de las hojas provenientes de brotes o microesquejes de guayaba cultivados in vitro. Ellos determinaron que estas protuberancias crecen hasta formar brotes cuando las hojas se separan y se cultivan en medio MS + BA (1 mg/L). También reportaron que luego del subcultivo estas estructuras se convertían en brotes, lo cual indicaba que tales protuberancias (centros me-ristemáticos) guardaban relación con el ápice y el sis­tema radical del brote. Sin embargo, la formación de estos brotes no fue optimizada ni observada en aque­llos momentos como una herramienta para la trans­formación genética de esta especie. Los resultados alcanzados permiten obtener valores óptimos del balance hormonal necesario en el medio de cultivo para la formación de brotes me­diante organogénesis en hojas provenientes de bro­tes de guayaba cultivados in vitro, pero otros aspec­tos relacionados con el estado fisiológico del explante deben ser estudiados. Efecto del estado fisiológico del explante en la formación de brotes. En la tabla 2 se pueden ob­servar los resultados del efecto de dos factores que describen de alguna manera el estado fisiológico de una hoja in vitro. La edad que tiene el órgano de acuerdo con el tiempo que lleva bajo condiciones in vitro (asociada al número de subcultivos) y la edad
	La formación de protuberancias se observó fundamentalmente en la zona basal del nervio cen­tral de la hoja, o sea, en el extremo cortado del pe­cíolo. Con excepción de 2,0 mg/L, dosis a la cual la aparición de las estructuras se ve afectada en más de un 50%, en el resto de los tratamientos la forma­ción de protuberancias fue del ciento por ciento. Estas protuberancias son precursoras de la forma­ción de otras estructuras más organizadas y están asociadas a la nervadura central de la hoja. Una fun­ción primaria de la mitosis en la organogénesis es la formación de un número crítico de células en división activa, las cuales, luego son capaces, de responder a las señales del desarrollo (Villalobos y Thorpe, 1991). Estas zonas de división celular resultan de la capacidad misma de células activamente divisorias que existen en el tejido, que estimulan la división ce­lular en las células adyacentes; éstas toman nutrien­tes y metabolitos a partir de las células periféricas, li­mitando la potencialidad divisoria de estas últimas (George, 1993). La formación de raíces está inhibida por la pre­sencia de la citoquinina a cualquier concentración de las empleadas; únicamente en ausencia de ésta, se observó el crecimiento de raíces surgidas a partir de las estructuras meristemáticas. Por el contrario, la formación de brotes se estimuló en presencia de la citoquinina. El mejor resultado se alcanzó con la dosis de 0,75 mg/L, el cual difiere de manera signifi­cativa del resto de los tratamientos. Con el incre­mento de la concentración de BAP superior a esta dosis, el porcentaje de formación de brotes dismi­nuyó significativamente.
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	que tiene el órgano de acuerdo con su aparición (asociada a la posición que ocupa en el brote). Se observa que para las variables de porcenta­je de explantes muertos y porcentaje de formación de protuberancias no existen diferencias estadísti­cas significativas entre los tratamientos. Sin embar­go, al analizar el porcentaje de brotación y el número de brotes por explante se aprecia que existe una marcada diferencia entre los explantes de acuerdo con su estado fisiológico. Los mejores resultados se alcanzan con los explantes provenientes de la gene­ración II (2 subcultivos de multiplicación) y segunda posición descendente en el tallo, seguido por los ex­plantes de la generación I (1 subcultivo de multiplica­ción) y segundo par de hoja en orden descendente en el tallo. En sentido general se puede apreciar que los explantes (hojas expandidas sin contacto directo con el medio in vitro) deben ser obtenidos de brotes con pocos subcultivos de multiplicación y preferible­mente del segundo y primer par de hojas en el tallo, lo cual se traduce en órganos más jóvenes.	De acuerdo con estos resultados, el número de subcultivos que recibe el brote tiene una mayor inci­dencia en la regeneración que la posición de las ho­jas en el tallo, ya que para las generaciones III y IV no se observan diferencias significativas entre las hojas de diferentes posiciones en el tallo, en cuanto al porcentaje de brotación y al número de brotes por explante. Esto puede estar dado por el hecho de que se utilizaron hojas que no eran muy diferentes entre sí en cuanto a la posición y sí en cuanto a los subcul­tivos. Tal vez si se comparasen estos resultados con hojas de una posición más baja en el brote sí se re­flejaría una mayor incidencia por parte de este factor. En albaricoque (Prunus americana L.), los ex­plantes jóvenes correspondientes a las primeras cua­tro hojas apicales expandidas de brotes en prolifera­ción in vitro producen los mejores resultados y superan en el doble el porcentaje de regeneración que las hojas viejas, correspondientes a las últimas cuatro hojas expandidas del tallo (Pérez-Tornero et al., 2000).
	Tabla 2. Efecto del estado fisiológico del explante a los 45 días de cultivo
	Tratamientos Porcentaje de ocurrencia (%) No. Generaciones (No. de subcultivos) Posición en el tallo Muerte del explante Formación de protuberancias Formación de brotes Brotes / explante I (1 subcultivo) 1 0,0 100 28,0 bc 1,7 ab 2 0,0 100 38,0 a 2,2 a 3 0,0 100 0,4 cd 0,4 cd 4 0,0 16,0 c 0,6 cd II (2 subcultivos) 1 4,0 100 32,0 b 1,4 ab 2 0,0 100 46,0 a 2,4 a 3 2,0 96 1,0b c 1,0 bc 4 0,0 100 16,0 c 0,7 cd III (5 subcultivos) 1 0,0 100 4,0 d 0,2 d 2 0,0 100 0,0 d 0,0 d 3 0,0 100 4,0 d 0,2 d 4 0,0 100 0,0 d 0,0 d IV (6 subcultivos) 1 0,0 100 0,6 cd 0,6 cd 2 0,0 96 8,0 cd 0,2 d 3 0,0 100 0,0 d 0,0 d 4 4,0 92 4,0 d 0,2 d ES 1,09 0.69 2,03 0,12 Signif. NS NS *** ***
	(Medias con letras desiguales difieren significativamente según Anova y Tukey para p<0,05). NS: no significativo para p>0,05.
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	En sentido general se concluye que para lograr una mayor formación de brotes es necesario utilizar hojas de brotes con pocos subcultivos de multiplica­ción y ubicadas en el primer y segundo nudo del tallo a partir del ápice. La observación de los explantes demostró que la región de la base de la hoja, por donde se cortó el pecíolo para separarla del tallo, era el lugar por donde surgían los brotes. Esto llevó a que se estudiara el efecto de la herida en la organogénesis. Efecto de la herida en la formación de los brotes. En la tabla 3 se observan los resultados obtenidos al evaluar diferentes formas de cortar la hoja de guaya­ba in vitro. El porcentaje de explantes muertos y el porcentaje de formación de protuberancias no mos­traron diferencias significativas entre las hojas intac­tas y las hojas punteadas en la nervadura central. Sin embargo, para los explantes cortados transversal-mente sí se observó una marcada diferencia estadís­tica en comparación con los anteriores tratamientos.		La capacidad morfogénica de algunos tejidos puede pasar desapercibida debido a la asociación de éstos con tejidos diferenciados que están dentro de un sistema organizado (George, 1993). Por ello, en la mayoría de las ocasiones las heridas permiten poner en contacto directo algunos tejidos internos con el medio de cultivo y facilitar la absorción de los reguladores del crecimiento. Por otro lado, el papel de la herida como factor de estrés que promueve el desarrollo morfogenético in vitro es muy conocido en la literatura. Fehéret al. (2003) aseguran que la heri­da por sí sola es una señal significativa de inducción de la diferenciación celular. Muchos de los genes ex­presados en protoplastos de hojas recién aislados, no sólo aquellos que están involucrados en la res­puesta al estrés, son inducidos generalmente como respuesta a la herida (Pasternak et al., 2002). En albaricoque, la respuesta morfogénica ocu­rre principalmente en los bordes cortados y en los nervios de las hojas, asociada siempre a los tejidos
	El mayor porcentaje de formación de brotes y el mayor número de brotes por ex­plante se alcanzó en las hojas punteadas en el nervio central, los cuales difieren de mane­ra significativa del resto de los tratamientos. Para el caso de las hojas cortadas transver-salmente, todo parece indicar que las condi­ciones de estrés son muy grandes y el tejido no logra superarlas. Los mejores resultados se obtienen con las hojas punteadas a lo largo del nervio cen­tral, lo cual demuestra que la herida juega un papel fundamental pues en la región de ésta surge la protuberancia y a partir de ella se for­ma el brote (figura 1a y b).
		Figura 1.a) Hoja de guayaba punteada en el nervio central, mostrando el crecimiento de los brotes a lo largo de éste, y b) la misma hoja pero en esta ocasión vista por el envés; se observa la formación de protuberan­cias o nódulos meristemáticos (flecha) en el lugar punteado del nervio central.
	Tabla 3. Efecto del tipo de herida en porcentajes obtenidos a los 45 días de cultivo in vitro
	Tratamientos Porcentaje de ocurrencia i (%) No. Explantes muertos Formación protuberancias Formación brotes Brotes/ explante Hojas intactas 15.4 a 84.6 a 30.8 b 2.12 b Hojas seccionadas transversalmente a % 32.0 b 32.0 b 6.4 c 0.87 c Hojas con punteaduras en el nervio central 17.9 a 83.3 a a3.52 a 3.52 a ES 7.1 6.9 6.2 0.07
	(Medias con letras desiguales difieren significativamente según Anova y Tukey para p<0,05).
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	vasculares (Pérez-Tornero et al., 2000). Algo similar ocurre en la regeneración de brotes de Platanus acerifolia Willd, donde los brotes se originan princi­palmente a partir de callos formados alrededor de los extremos cortados del pecíolo y a lo largo de los cor­tes transversales de la nervadura central (Liu y Bao, 2003). Para la guayaba en este trabajo, la principal actividad meristemática ocurre en los tejidos que conforman el nervio central y estuvo siempre asocia­da a las zonas donde se produjo una herida. Con es­tos resultados se corrobora una vez más que la heri­da juega un papel fundamental en la respuesta morfogenética in vitro de las plantas superiores. CONCLUSIONES Se logró establecer un procedimiento para la rege­neración de brotes adventicios en hojas de guayaba obtenidas a partir de brotes o microesquejes cultiva­dos in vitro. Junto con ello se logró determinar que el BAP en concentración de 0,75 mg/L suplementado al medio de cultivo MS, permite alcanzar hasta un 48% de formación de brotes en las hojas intactas. También se determinó que al utilizar hojas más juve­niles (de brotes con 1 o 2 subcultivos de multiplica­ción y ubicadas en el segundo nudo del tallo, contan­do a partir del ápice) se logra entre un 38 a un 46% de formación de brotes y de 2,2 a 2,4 brotes por ex­plante. La herida provocada por punteaduras en la nervadura central de las hojas estimuló la formación de brotes hasta alcanzar más de un 60%, mientras que el número de brotes por explantes alcanzó un valor mayor de 3. Este procedimiento se puede utili­zar como vía morfogenética para obtener plantas a partir de tejido somático para futuros estudios de transformación genética en esta especie. BIBLIOGRAFÍA Amin, M. N.; Jaiswal, V. S. 1988. Micropropagation as an aid to rapid cloning of a guava cultivar. Scientia Horticultu-rae, 36: 89-95. 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	Red Nacional de Biotecnología Forestal
	www.rebiofor.org REBIOFOR convocará a la colectividad interesada en biotecnología forestal, para aprovechar el conocimiento generado y la voluntad de muchos por aportar al auge del sector forestal. Por medio de la presentación de grupos, la publicación de proyectos, informes de investigación, noticias y herramientas, se consolidará el surgimiento de una verdadera comunidad biotecno-lógica forestal en el país.
	Enrique Vega: director Dagoberto Castro: asesor científico Edwin Cristancho: asesor institucional Sonsire Baquero: coordinadora sonsire.baquero@rebiofor.org
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