Publicado

2004-07-01

Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares

Determination of borojo sex (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) through molecular markers

Palabras clave:

Borojoa patinoi, plantas dioicas, AFLP, marcadores ligados al sexo, diagnóstico de sexo, dioecious plant, gender-linked marker, gender diagnosis (es)

Autores/as

  • Clara Inés Giraldo Biólogos. Estudiantes de maestría en biología molecular y biotecnología
  • Lucero Rengifo .
  • Enrique Aguilar Biólogo, Cenbiotep, UTP
  • Álvaro H. Alegría Médico. Doctor en bioquímica y biología molecular
El borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) una rubiacea endémica de la región Pacífica de Colombia, produce un fruto carnoso con importantes propiedades alimenticias que lo posicionan como un recurso genético promisorio. Se usa para preparar conservas y vino, pero su principal uso es como bebida refrescante. Económicamente representa una fuente de ingresos para algunas poblaciones nativas que comercializan la fruta o sus derivados en el mercado local o en las principales ciudades colombianas. El borojó es una planta dioica y los dos sexos no son fenotípicamente distinguibles antes de la floración (3-4 años después de la siembra), por lo cual la productividad de una plantación no seleccionada es sustancialmente reducida. El objetivo de este estudio fue determinar marcadores moleculares AFLP (Polimorfismo en la Longitud de Fragmentos Amplificados) asociados al sexo de borojó. Con base en la secuencia de uno de estos marcadores ligados al sexo, se diseñó una pareja de iniciadores de 20 y 22 pb para diagnosticar el sexo de las plantas vía reacción en cadena de la polimerasa. Se analizaron plantas con sexo molecularmente identificado por PCR, encontrándose resultados congruentes entre éstas y los AFLP. Esto representa para los agricultores una oportunidad para establecer cultivos de borojó diseñados en cuanto a espacio y productividad esperada, en términos de número de árboles femeninos y masculinos plantados. Palabras clave: Borojoa patinoi, plantas dioicas, AFLP, marcadores ligados al sexo, diagnóstico de sexo.
Borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas), a rubiacea indigenous to the Colombian Pacific Region, produces a fleshy fruit having interesting nutritious characteristics making it a promising plant resource. It is used for fresh beverages; preserves and wine can also be obtained. It is an especially important source of income for some of the native population who sell it in local food markets and the main Colombian cities. Borojó is a dioecious plant; the two genders are not phenotypically distinguishable before flowering (3-4 years after planting). A non-selected plantation's productivity thus becomes substantially reduced. This project was aimed at determining gender-linked amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers. 20 and 22 bp primers were designed by sequencing one of these gender-linked markers abd used for determining the plants' gender via polymerase chain reaction (PCR). Samples examined by PCR and AFLP were compared; the techniques presented no differences when determining plant gender. Determining gender in borojó is an important tool for agriculture because it allows adequate selection and distribution of female and male plants for establishing greater productivity plantations. Key words: Borojoa patinoi, dioecious plant, AFLP, gender-linked marker, gender diagnosis.
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______________________REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL.VI No. 2 Diciembre 2004 9-14
Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares*
Determination of borojo sex (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) through molecular markers
Clara Inés Giraldo**, Lucero Rengifo*, Enrique Aguilar***, Duberney Gaviria*, Álvaro H. Alegría
RESUMEN
El borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) una rubiacea endémica de la región Pacífica de Colombia, produce un fruto carnoso con importantes propiedades alimenticias que lo posicionan como un recurso genético promisorio. Se usa para preparar conservas y vino, pero su principal uso es como bebida refrescante. Económicamente representa una fuente de ingresos para algunas poblaciones nativas que comercializan la fruta o sus derivados en el mercado local o en las principales ciudades colombianas. El borojó es una planta dioica y los dos sexos no son fenotípicamente distinguibles antes de la floración (3-4 años después de la siembra), por lo cual la productividad de una plantación no seleccionada es sustancialmente reducida. El objetivo de este estudio fue determinar marcadores moleculares AFLP (Polimorfismo en la Longitud de Fragmentos Amplificados) asociados al sexo de borojó. Con base en la secuencia de uno de estos marcadores ligados al sexo, se diseñó una pareja de iniciadores de 20 y 22 pb para diagnosticar el sexo de las plantas vía reacción en cadena de la polimerasa. Se analizaron plantas con sexo molecularmente identificado por PCR, encontrándose resultados congruentes entre éstas y los AFLP. Esto representa para los agricultores una oportunidad para establecer cultivos de borojó diseñados en cuanto a espacio y productividad esperada, en términos de número de árboles femeninos y masculinos plantados.
Palabras clave: Borojoa patinoi, plantas dioicas, AFLP, marcadores ligados al sexo, diagnóstico de sexo.
ABSTRACT
Borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas), a rubiacea indigenous to the Colombian Pacific Region, produces a fleshy fruit having interesting nutritious characteristics making it a promising plant resource. It is used for fresh beverages; preserves and wine can also be obtained. It is an especially important source of income for some of the native population who sell it in local food markets and the main Colombian cities. Borojó is a dioecious plant; the two genders are not phenotypically distinguishable before flowering (3-4 years after planting). A non-selected plantation's productivity thus becomes substantially reduced. This project was aimed at determining gender-linked amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers. 20 and 22 bp primers were designed by sequencing one of these gender-linked markers abd used for determining the plants' gender via polymerase chain reaction (PCR). Samples examined by PCR and AFLP were compared; the techniques presented no differences when determining plant gender. Determining gender in borojó is an important tool for agriculture because it allows adequate selection and distribution of female and male plants for establishing greater productivity plantations.
Key words: Borojoa patinoi, dioecious plant, AFLP, gender-linked marker, gender diagnosis.
* Este artículo corresponde a la presentación oral que obtuvo el primer lugar en la sala de biotecnología agrícola del
Segundo Congreso Colombiano de Biotecnología.
Biólogos. Estudiantes de maestría en biología molecular y biotecnología, Cenbiotep, UTP.
Biólogo, Cenbiotep, UTP. **** Médico. Doctoren bioquímica y biología molecular, Cenbiotec, UTP.
Centro de Biología Molecular y Biotecnología (Cenbiotep), Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad
Tecnológica de Pereira, La Julita, Pereira-Colombia. Correo electrónico: cenbiotep@utp.edu.co
Recibido: octubre 26 de 2004. Aceptado: octubre 29 de 2004
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INTRODUCCIÓN
El borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) (Cuatreca-sas, 1948) es una especie originaria del departa­mento del Chocó (Colombia), perteneciente a la fa­milia Rubiaceae. Hace parte de los ecosistemas de vega de río a lo largo del Pacífico colombiano encon­trándose ampliamente cultivada desde Bahía Sola­no (Chocó) hasta el río Naya (límites de Valle y Cau­ca). Actualmente está diseminada en todo el territorio colombiano, incluyendo la Amazonia, la zona cafetera y el Magdalena Medio, ya que se adapta desde los 0 a los 500 msnm. Sin embargo, los sitios de producción comercial de la fruta se en­cuentran en el Chocó (zona del Atrato, Lloró y Bajo San Juan) y el Valle del Cauca (región del Bajo Anchicayá y el Bajo Calima, y Buenaventura) con un rendimiento que va de 5 a 12 frutos árbol/año duran­te los primeros 5 años, y de 12 a 30 frutos árbol/año para el resto del periodo de utilidad (Mosquera y Are­nas, 1995; Constantino et al., 2000).
El borojó hace parte de un pequeño grupo de plantas que florecen y que son sexualmente dimórfi-cas, las plantas dioicas. Los árboles macho, no pro­ductores de frutos, no se diferencian fenotípicamen-te de las hembras antes de la floración; las inflorescencias masculinas son terminales, en raci­mo, color blanco crema, y las flores femeninas son solitarias, terminales y también color blanco crema (figura 1a y 1b). El fruto es una baya que en sus pri­meros estadios es verde clara, y al madurar se torna parda rojiza; tiene un mesocarpo carnoso con sabor aromático y muy perfumado, posee propiedades ali­menticias por contener aminoácidos esenciales y ser fuente de calcio, hierro, fósforo y vitamina C (figura 1c). Posee metabolitos secundarios de gran interés como modelos químicos para nuevas drogas. Ade­más, posee propiedades que le atribuye la medicina tradicional y popular como diurético, cicatrizante, afrodisíaco y antitumoral (Gentry, 1982, 1988). Te­niendo en cuenta esas propiedades, la expectativa de mercadeo alrededor de la fruta de borojó en el ámbito nacional e internacional es prometedora.
Alrededor del 5% de las especies del reino ve­getal son dioicas, y muchas de estas plantas son de valor comercial por la producción de frutos, tales como papaya y kiwi, o de semillas como pistacho, nuez moscada y pimienta negra, por lo que se pre­fieren en altas proporciones en un cultivo (Parasnis et al., 2000; Ainsworth, 2000). Aunque el dioicismo
es una característica que se presenta en muchos grupos taxonómicos, poco se conoce sobre la base genética de este evento de reciente evolución y, a di­ferencia de los animales donde los cromosomas se­xuales han evolucionado independientemente hasta presentar formas heteromórficas, sólo unas pocas especies dioicas contienen cromosomas heteromór-ficos como Silene, Rumex y Humulus que permitan identificar su sexo citológicamete (Negrutiu et al., 2001; Vyskot y Hobza, 2004).
En muchas especies dioicas el sexo no es re­velado sino hasta alcanzar la madurez, cuando apa­recen las flores, lo cual puede tomar de meses a años. Este hecho ha generado un interés por desa­rrollar estrategias de identificación del sexo de plan­tas a través de marcadores moleculares donde las técnicas basadas en PCR han sido de gran utilidad y han sido explotadas para detectar diferencias entre plantas masculinas y femeninas a nivel molecular. En plantas existen varios marcadores moleculares li­gados al sexo generados ya sea a través de estudios de mapeo genético (Spada et al., 1998) o de investi­gaciones encaminadas a encontrar marcadores liga­dos al sexo de especies agronómicamente impor­tantes; por ejemplo, se han usado microsatélites para identificar diferencias específicas de sexo en papaya, Carica papaya (Parasnis et al., 1999), AFLP para la identificación de marcadores ligados al sexo de Dioscorea tokoro (Terauchi y Kahl, 1999), de espá­rrago, Asparagus officinalis (Reamon-Büttner et al., 1999) y patrones de bandas RAPD ligados al sexo de marihuana Cannabis sativa L. (Mandolino et al., 2002), de álamo, Salix viminalis L. (Alstrom-Rapaport et al., 1998) de Atriplex garrettii (Ruas et al., 1998) y de Silene latifolia (Nakao et al., 2002).
En especies como papaya y kiwi el diagnóstico del sexo puede realizarse desde estados tempranos de desarrollo de la planta gracias al diseño de inicia­dores de PCR a partir de marcadores moleculares (Parasnis et al., 2000; Deputy et al., 2002; Gill et al., 1998).
Debido a la importancia económica, al sistema de determinación del sexo y a su genoma pequeño, Carica papaya ha sido una especie clave en el estu­dio de los cromosomas sexuales y su evolución. Con base en mapeo de alta densidad se ha encontrado un alto nivel de polimorfismo en una región genómi-ca que rodea el locus del sexo, lo que sugiere una supresión de la recombinación y una tendencia al
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proceso degenerativo del cromosoma Y de papaya en lo que pueden ser los primeros pasos en la evolu­ción del cromosoma sexual (Liu et al., 2004; Vyskot y Hobza, 2004).
En este artículo se reportan dos marcadores moleculares específicos para plantas masculinas de Borojoa patinoi C. obtenidos mediante AFLP y la apli­cación de la técnica PCR con iniciadores diseñados a partir de la secuencia de uno de los marcadores. Esto permite determinar el sexo de las plantas en edad temprana y establecer cultivos comerciales eficientes.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y extracción de ADN. Se colecta­ron hojas tiernas de 97 árboles de borojó con pre­sencia de flores y frutos, 51 hembras y 46 machos en tres regiones diferentes de Colombia: La Virginia (Ri-saralda), Lloró (Chocó) y Sabaletas (Valle del Cau­ca). El tejido se mantuvo en frío durante el tiempo de muestreo y hasta llegar al laboratorio donde se alma­cenó a -80 °C para su posterior uso. Las extraccio­nes de ADN se realizaron por el método de Boiteaux et al. (1999), con pequeñas modificaciones, como si­gue: se maceró el material vegetal con nitrógeno lí­quido, se incubaron 100 mg de cada muestra con 1,5 mL de buffer de extracción a 65 °C durante 60 minu­tos, se completó el volumen a 2 mL con cloroformo: alcohol isoamílico 24 : 1 y se mezcló por inversión. Se repitió la extracción orgánica dos veces más. Se centrifugó durante 10 minutos a 10000 rpm a 4 °C y se recuperó la fase acuosa en un nuevo tubo, se adi­cionaron 2/3 del volumen de isopropanol frío, se in­cubó durante 2 horas a -20 °C y se centrifugó a
10000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. El precipitado se lavó con 1 mL de etanol al 76 % y 10 mM de ace­tato de amonio; se dejó secar y se resuspendió en 200 ¡x\- de buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Se adicionaron 5,mL de RNasa A (10 mg/mL), se incubó durante 30 minutos a 37 °C y se precipitó con 400 /j,L de etanol absoluto y 20,mL de acetato de sodio 3 M, se dejó a -20 °C durante 30 minutos y se centrifugó a 12000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. El precipitado se lavó con etanol al 70%, se dejó secar y se resus­pendió en 200 fiL de TE.
Análisis por AFLP. Se tomaron tres muestras mas­culinas y tres femeninas para evaluar las 64 posibles combinaciones de iniciadores contenidos en el estu­che comercial "AFLP Analysis System I" (Invitrogen), siguiendo las instrucciones. Los productos de amplifi­cación se observaron en geles de acrilamida al 6% y 7 M de úrea, teñidos con nitrato de plata usando el estu­che comercial "Silver Sequence DNA Staining Rea-gents" (Promega).
Después de identificar los marcadores ligados al sexo, se analizaron 57 muestras (4 procedentes de La Virginia, 17 del Chocó y 36 de Sabaletas), de las cuales 30 eran hembras y 27 eran machos. Para esta evaluación por AFLP se prepararon muestras indivi­duales y "bulks" a partir de los ADN por sexo para ha­cer un análisis tanto individual como de los dos gru­pos de ADN. Una vez evaluados y confirmados los marcadores con estas muestras, se repitió el procedi­miento completo y por duplicado (desde la extracción de ADN) con otras 40 plantas de un muestreo doble ciego para evaluar la efectividad y confiabilidad de la técnica.
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1b
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Figura 1. a) Flor femenina de borojó. b) Flor masculina de borojó. c) Fruto de borojó.
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Caracterización del marcador y diseño de inicia­dores. Se secuenciaron, tanto manualmente como a partir de productos clonados, tres fragmentos liga­dos al sexo de la combinación EAAC-MCAA. En am­bos casos los fragmentos se aislaron a partir del gel de poliacrilamida seco adicionando 10 |jL de TE so­bre las bandas, luego se cortaron con una cuchilla nueva y se trituraron sobre un portaobjetos, se incu­baron en 30 |llL de TE por 5 minutos en agua hirvien­do y se centrifugaron por 2 minutos a 8000 rpm. Se tomaron 5 |jL del sobrenadante para reamplificar los fragmentos. Para la secuenciación manual, el pro­ducto de reamplificación se corrió en un gel de acrila-mida al 12% el cual se purificó siguiendo el mismo protocolo anterior. Con 10 |jL de este producto se obtuvo la secuencia parcial de un fragmento de aproximadamente 290 pb de longitud, usando el es­tuche comercial Silver Sequence DNA Sequencing. Para clonar fragmentos, el producto de reamplifica­ción se purificó usando columnas Millipore®, de allí se tomaron 3 |jL para clonar en el vector pGEM-T del estuche comercial pGEM-T Easy Vector(Promega). Posteriormente se obtuvo la secuencia total del frag­mento con el iniciador sentido pUC/M13 del estuche comercial Silver Sequence DNA Sequencing. Los resultados se visualizaron en geles de poliacrilamida al 6% y 7 M de úrea, teñidos con nitrato de plata.
Con base en la información de la secuencia, y usando el programa Gene Runner, se diseñaron dos iniciadores específicos para la amplificación selectiva por reacción en cadena de la polimerasa de un marca­dor ligado al sexo en plantas de borojó.
RESULTADOS
Identificación de marcadores ligados al sexo. De
las 64 combinaciones de iniciadores AFLP evalua­das por su potencial para servir como marcadores específicos de sexo, las combinaciones EAAC-MCAA y EACC-MCAT detectaron diferencias espe­cíficas entre machos y hembras de borojó. Dos de los fragmentos sólo aparecieron en el patrón de ban­das de individuos machos, uno por cada combina­ción. La longitud aproximada de los fragmentos fue de 290 pb (figura 2). La presencia de los marcadores específicos para sexo masculino fue consistente en los dos grupos de ADN formados para machos y hembras; además, la técnica fue altamente repro-ducible ya que 40 muestras que fueron procesadas por duplicado arrojaron patrones de bandas iguales.
Dentro del grupo de muestras del estudio doble cie­go, uno de los resultados de diagnóstico de sexo no fue consistente con la descripción fenotípica. Esto le confiere a la técnica de AFLP para el diagnóstico del sexo de Borojoa patinoi una sensibilidad de 94,7 % y una especificidad de 100%.
Secuenciación de marcador y diagnóstico de sexo por PCR. Se obtuvo una secuencia parcial de 210 nu-cleótidos a partir de secuenciación directa, y una se­cuencia total de 292 nucleótidos a partir de la secuen­ciación del fragmento clonado de la combinación E-AAC/M-CAA (figura 3). Con esta secuencia se llevó a cabo una búsqueda general de homología de se­cuencias en el GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) mediante el algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990) encontrándose alineamientos significativos con se­cuencias específicas del cromosoma X y Y de la plan­ta dioica Rumex acetosa. Asimismo, a partir de esta secuencia se diseñaron los iniciadores BM1a y BM1b para PCR.
Una vez estandarizada la reacción de PCR, se amplificaron muestras de 56 plantas adultas y 74 plántulas del vivero de la Universidad Tecnológica de Pereira, cuyo sexo había sido determinado por AFLP. Se obtuvo una sola banda de la longitud esperada (173 pb) en las plantas masculinas y sólo una de las plantas adultas femeninas presentó una banda positiva para PCR (figura 4). Los ADN de to­mate (Lycopersicum sculentum) y morera (Morus alba) usados como control no presentaron bandas amplificadas.
DISCUSIÓN
En términos de sexo en especies dioicas, es a menudo beneficioso hacer selección sobre un género, como se hace por ejemplo en cultivos de espárrago, kiwi y pa­paya, en los cuales se prefieren los clones femeninos sobre los masculinos. Sin embargo, en muchas espe­cies perennes es imposible determinar el sexo hasta que el organismo sea reproductivamente maduro, lo que puede tomar de 1 a 20 años de edad y, como re­portan Alstrom-Rapaport et al. (1998), la incapacidad para determinar el sexo en estados tempranos puede crear problemas en esquemas de mejoramiento, en particular cuando se desea hacer selección de paren-tales superiores o cuando toda la progenie está com­puesta de plantas de sexo desconocido.
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usen menos reactivos y materiales buscando la reducción de costos.
Asimismo, tienen una consi­derable aplicación a nivel de inves­tigación básica porque serán el punto de partida para futuros estu­dios sobre la base genética del
Figura 2. Gel de poliacrilamida al 6% con el patrón AFLP para la combinación E-AAC/M-CAA. La flecha indica el fragmento presente sólo en plantas macho de borojó.
sexo, no sólo en esta especie sino en vegetales en general. La se­
Una solución a esta condición ha sido el uso de técnicas de biología molecular para el diagnósti­co de sexo en plantas agronómicamente importan­tes. En la actualidad se ha avanzado hacia el dise­ño de Regiones Amplificadas de Secuencia Caracterizada (SCARS) para hacer evaluaciones a gran escala, como lo reportan Gill et al. (1998) en kiwi (Actinidia chinensis), para identificar el sexo con propósitos de mejoramiento, y Parasnis et al. (2000) para identificar el sexo de plántulas de papa­ya (Carica papaya).
Aunque la utilización de técnicas moleculares represente un costo directo para agricultores o pro­pietarios de viveros comerciales, en mayor proporción se pueden reducir costos indirectos como inversión de recursos y tiempo para el mantenimiento de plan­tas femeninas. Además, al momento de efectuar un transplante en un cultivo podría mantenerse una relación deseada de hembras y machos. Después de 5 años de edad, una planta hembra de borojó produ­ce 12 a 30 frutos por año, por tanto el incremento en el número de árboles que produzcan frutos por hectárea de tierra puede incrementar directamente la produc­ción de frutos de borojó, haciendo el cultivo más rentable.
cuencia de 292 nucleótidos de uno de los marcadores presenta una región de similitud en 30 nucleótidos con una se­cuencia específica de los cromosomas X y Y de la especie Rumex acetosa depositada en el GenBank. Nuestras futuras investigaciones tienen como objeti­vo clonar los marcadores para extender la secuencia y expresar el gen correspondiente en un vector ade­cuado que permitirá la caracterización de su posible función en las plantas masculinas.
CONCLUSIONES
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa desarrollada para identificar el sexo de plantas de bo­rojó desde estados tempranos de su desarrollo, es una herramienta efectiva para planificar el cultivo de la fruta y conseguir un mayor rendimiento. Por otra parte, no se sabe si las técnicas tradicionales de ma­nejo de los cultivos, que incluyen eliminación de plan­tas macho antes de su reproducción y propagación clonal de hembras, tienen algún efecto sobre la diver­sidad genética de la especie. Usando la PCR para identificar el sexo de las plantas, pueden establecerse cultivos con una relación machos : hembras que no
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Los marcadores moleculares li­gados al sexo en B. patinoi identifica­dos en este estudio tienen una consi­derable aplicación práctica. La conversión de AFLP, una técnica cos­tosa, en una mucho más barata como PCR, hace más fácil la aplicación de estos resultados para determinar el sexo de plantas de borojó en estados tempranos de desarrollo y a gran es­cala. Actualmente se está trabajando en la implementación de un protocolo de extracción de ADN en el que se
Figura 3. Gel de poliacrilamida al 6% con la secuencia obtenida a partir del frag­mento E-AAC/M-CAA clonado en el vector pGEM-T.
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Figura 4. Gel de acrilamida al 12% con productos de amplificación de PCR usan­do los iniciadores BM1 a y BM1b. Los carriles 1 a 9 contienen ADN de plantas ma­cho. Los carriles 11 a 18 contienen ADN de plantas hembra.
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afecte la diversidad genética del borojó y que repre­sente ganancia económica para los productores.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología "Francis­co José de Caldas"-Colciencias, y a la Universidad Tecnológica de Pereira por la financiación de este proyecto.
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Cómo citar

APA

Giraldo, C. I., Rengifo, L., Aguilar, E. y Alegría, Álvaro H. (2004). Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares. Revista Colombiana de Biotecnología, 6(2), 9–14. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/532

ACM

[1]
Giraldo, C.I., Rengifo, L., Aguilar, E. y Alegría, Álvaro H. 2004. Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares. Revista Colombiana de Biotecnología. 6, 2 (jul. 2004), 9–14.

ACS

(1)
Giraldo, C. I.; Rengifo, L.; Aguilar, E.; Alegría, Álvaro H. Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares. Rev. colomb. biotecnol. 2004, 6, 9-14.

ABNT

GIRALDO, C. I.; RENGIFO, L.; AGUILAR, E.; ALEGRÍA, Álvaro H. Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares. Revista Colombiana de Biotecnología, [S. l.], v. 6, n. 2, p. 9–14, 2004. Disponível em: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/532. Acesso em: 11 feb. 2025.

Chicago

Giraldo, Clara Inés, Lucero Rengifo, Enrique Aguilar, y Álvaro H. Alegría. 2004. «Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares». Revista Colombiana De Biotecnología 6 (2):9-14. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/532.

Harvard

Giraldo, C. I., Rengifo, L., Aguilar, E. y Alegría, Álvaro H. (2004) «Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares», Revista Colombiana de Biotecnología, 6(2), pp. 9–14. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/532 (Accedido: 11 febrero 2025).

IEEE

[1]
C. I. Giraldo, L. Rengifo, E. Aguilar, y Álvaro H. Alegría, «Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares», Rev. colomb. biotecnol., vol. 6, n.º 2, pp. 9–14, jul. 2004.

MLA

Giraldo, C. I., L. Rengifo, E. Aguilar, y Álvaro H. Alegría. «Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares». Revista Colombiana de Biotecnología, vol. 6, n.º 2, julio de 2004, pp. 9-14, https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/532.

Turabian

Giraldo, Clara Inés, Lucero Rengifo, Enrique Aguilar, y Álvaro H. Alegría. «Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares». Revista Colombiana de Biotecnología 6, no. 2 (julio 1, 2004): 9–14. Accedido febrero 11, 2025. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/532.

Vancouver

1.
Giraldo CI, Rengifo L, Aguilar E, Alegría Álvaro H. Determinación del sexo en borojó (Borojoa patinoi, Cuatrecasas) mediante marcadores moleculares. Rev. colomb. biotecnol. [Internet]. 1 de julio de 2004 [citado 11 de febrero de 2025];6(2):9-14. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/532

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