Predicción a escala genómica de Componentes de Saccharomyces cerevisiae mediante Análisis de Balance de Flujos
Keywords:
analisis de balance de flujos, reconstrucción a escala genómica, iMM904, S. cerevisiae, flux balance analysis, genome scale reconstructions (es)Downloads
Título en ingles: Prediction of genome scale of Saccharomyces cerevisiae by flux balance analysis
Resumen: El microorganismo Saccharomyces cerevisiae cuenta con gran número de modelos biológicos conocidos como reconstrucciones, las cuales pueden ser a escala genómica. De estas reconstrucciones a escala genómica provienen los modelos matemáticos, también llamados modelos estequiométricos. Una de las técnicas más usadas para estudiar estos modelos es el Análisis de Balance de Flujos (FBA). El proposito del FBA es predecir el crecimiento del microorganismo bajo estudio, y la producción y consumo de componentes como el etanol, CO2 glicerol, sucinato, acetato y piruvato. Para determinar si las predicciones obtenidas mediante FBA son únicas se utiliza la técnica de Análisis de Variabilidad Flujos (FVA). El presente trabajo muestra los resultados de aplicar el FBA a la reconstrucción reciente del microorganismo S. cerevisiae, la denominada iMM904 y los compara con un conjunto de datos experimentales presente en la literatura. Este trabajo también estudia la existencia de múltiples predicciones FBA utilizando la técnica FVA. Los resultados ilustran que es posible predecir el crecimiento del microorganimo S. cerevisiae, con errores entre el 11% y 28%; la producción de CO2, con errores entre el 0.3% y 4.5% y la producción de etanol, con errores entre el 11% y 13%.
Palabras clave: analisis de balance de flujos, reconstrucción a escala genómica, iMM904, S. cerevisiae.
Abstract: Several biological models, named reconstructions, are used for the study of the S. cerevisiae microorganism. The reconstructions can be genomic scaled. Mathematical models are generated from the reconstructions and they are called stoichiometric models. The flux balance analysis (FBA) is one of the tools used for the analysis of these models. The FBA attempts to predict the evolution of the microorganism and the consumption and production of components like glucose, ethanol, glycerol, succinate, acetate and pyruvate. A Flux variability analysis (FVA) is used to determine the uniqueness of the FBA predictions. This paper shows the results of applying FBA to the iMM904 reconstruction of S. cerevisiae and compares them with experimental data from literature. The results in this paper show that it is possible to predict the evolution with errors between 11% and 28% ; the production of CO2 with errors between 0.3% and 4.5%; and the production of ethanol with errors between 11% and 13%, using FBA for the iMM904 model.
Keywords: flux balance analysis, genome scale reconstructions, iMM904, S. cerevisiae
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
Predicción a escala genómica de Componentes deSaccharomyces cerevisiae mediante Análisis de Balance de Flujos
Prediction of genome scale of Saccharomyces cerevisiae by flux balance analysis
César Augusto Vargas García1, Henry Arguello Fuentes2, Rodrigo Gonzalo Torres Sáez3.
1 Ms(c) Ingeniería de Sistemas e Informática, Universidad Industrial de Santander, caugusto.vargas@gmail.com.
2 PhD(c) Electrical and Computer Engineering, Docente Asistente Escuela de Ingeniería de Sistemas e Informática, Universidad Industrial de Santander. henarfu@uis.edu.co
3 PhD Bioquímica, Docente Asistente Facultad de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander,rtorres@uis.edu.co
Recibido: febrero 16 de 2012 Aprobado: junio 20 de 2012
Resumen
El microorganismo Saccharomyces cerevisiae cuenta con gran número de modelos biológicos conocidos como reconstrucciones, las cuales pueden ser a escala genómica. De estas reconstrucciones a escala genómica provienen los modelos matemáticos, también llamados modelos estequiométricos. Una de las técnicas más usadas para estudiar estos modelos es el Análisis de Balance de Flujos (FBA). El proposito del FBA es predecir el crecimiento del microorganismo bajo estudio, y la producción y consumo de componentes como el etanol, CO2glicerol, sucinato, acetato y piruvato. Para determinar si las predicciones obtenidas mediante FBA son únicas se utiliza la técnica de Análisis de Variabilidad Flujos (FVA). El presente trabajo muestra los resultados de aplicar el FBA a la reconstrucción reciente del microorganismo S. cerevisiae, la denominada iMM904 y los compara con un conjunto de datos experimentales presente en la literatura. Este trabajo también estudia la existencia de múltiples predicciones FBA utilizando la técnica FVA. Los resultados ilustran que es posible predecir el crecimiento del microorganimo S. cerevisiae, con errores entre el 11% y 28%; la producción de CO2, con errores entre el 0.3% y 4.5% y la producción de etanol, con errores entre el 11% y 13%.
Palabras clave: analisis de balance de flujos, reconstrucción a escala genómica, iMM904, S. cerevisiae.
Abstract
Several biological models, named reconstructions, are used for the study of the S. cerevisiae microorganism. The reconstructions can be genomic scaled. Mathematical models are generated from the reconstructions and they are called stoichiometric models. The flux balance analysis (FBA) is one of the tools used for the analysis of these models. The FBA attempts to predict the evolution of the microorganism and the consumption and production of components like glucose, ethanol, glycerol, succinate, acetate and pyruvate. A Flux variability analysis (FVA) is used to determine the uniqueness of the FBA predictions. This paper shows the results of applying FBA to the iMM904 reconstruction of S. cerevisiae and compares them with experimental data from literature. The results in this paper show that it is possible to predict the evolution with errors between 11% and 28% ; the production of CO2 with errors between 0.3% and 4.5%; and the production of ethanol with errors between 11% and 13%, using FBA for the iMM904 model.
Key words: flux balance analysis, genome scale reconstructions, iMM904, S. cerevisiae.
Introducción
Debido a que las reservas de petróleo disminuyen rápidamente y dados los actuales problemas ambientales producidos por el uso de combustibles fósiles, el etanol se ha convertido en una fuente alternativa de energía renovable y limpia (Bai et al., 2008). La producción de etanol es realizada por microorganismos como S. cerevisiae(conocida como levadura de cerveza). El uso de S. cerevisiae y no de otros microorganismos para la producción de etanol se debe a su tolerancia al etanol y a su capacidad de producción de biomasa para el consumo animal (Bai et al., 2008).
Una forma de almacenar la información estructural de S. cerevisiae es a través de los modelos estequiométricos (Llaneras y Picó, 2008), extraídos de reconstrucciones a escala genómica. Estas reconstrucciones han venido mejorando el nivel de detalle en la descripción de este microorganismo. Este nivel de detalle está representado por la cantidad de genes, reacciones y componentes incluidos en la reconstrucción. (tabla 1).
Las reconstrucciones base de la literatura son la iFF708 (Förster et al.,2003), iND750 (Duarte et al., 2009) e iMM904 (Mo et al., 2009). La más reciente de estas reconstrucciones base, la iMM904 se basa en el modelo iND750. Incluye mayor detalle en la descripción de S. cerevisiae comparado con las reconstrucciones iFF708 e iND750, producto de nueva información genética, bioquímica y fisiológica. Además, cuenta con una reacción de crecimiento modificada que mejora las predicciones de letalidad con respecto a sus antecesoras (Mo et al., 2009). A partir de la iFF708, iND750 e iMM904 se han realizado nuevas reconstrucciones de S. cerevisiae tales como la iLL672 (Kuepfer et al., 2005), la iIN800 (Nookaew et al., 2008), la iZ900 (Zomorrodi y Maranas, 2010) y la Yeast 4.0 (Herrgard et al., 2008).
La técnica más utilizada para el estudio de los modelos estequiométricos extraídos de estas reconstrucciones es el Análisis de Balance de Flujos - FBA (Kauffman et al., 2003), (Lee et al., 2006), (Raman y Chandra, 2009), (Orthet al., 2010), (Gianchandani et al., 2010). Esta técnica ha cobrado interés debido a que no requiere información de la dinámica del sistema (Kauffman et al., 2003). En cambio, el FBA requiere de una función que represente el objetivo biológico del sistema estudiado. El estudio de funciones objetivo se ha realizado utilizando modelos estequiométricos simples y a escala genómica del microorganismo E-coli (Schuetz et al., 2007), (Feist y Palsson, 2010) y otros microorganismos (Gong et al., 2009), (Gong y Yu, 2010). También se ha estudiado modelos estequimétricos reducidos de S. cerevisiae (Burgard y Maranas, 2003), (Gianchandani et al., 2008). Sin embargo hasta la fecha no se han explorado nuevas funciones objetivo del FBA usando redes a escala genómica de S. cerevisiae.
El trabajo realizado en (Famili et al., 2003) fue uno de los primeros sobre predicción de consumo y producción de componentes, como el etanol, del organismo S. cerevisiae utilizando FBA y un modelo estequiométrico extraído de la reconstrucción a escala genómica iFF708. Las capacidades de los modelos extraídos de iFF708 e iND750 han sido estudiadas en los trabajos (Famili et al., 2003) y (Hjersted y Henson, 2009) y se han realizado estudios posteriores como en (Bro et al., 2006) y (van Berlo et al., 2011) utilizando estos modelos. En contraste el modelo iMM904 carece de estudios como el de (Famili et al., 2003) y (Hjersted y Henson, 2009). A la fecha no existen trabajos de FBA que utilicen el modelo iMM904.
Es posible que el Análisis de Balance de Flujos produzca más de una solución (Lee et al., 2000). La enumeración de estas soluciones es computacionalmente costosa en modelos a escala genómica. Una alternativa computacionalmente viable para el estudio de estas soluciones es el Análisis de Variabilidad de Flujos - FVA. El primer trabajo que realiza un Análisis de Variabilidad de Flujos es el de (Mahadevan y Schilling, 2003).
La literatura actual carece de un trabajo que estudie la producción y consumo de los componentes etanol, glicerol, CO y acetato de S. cerevisiae a través de FBA y FVA utilizando el modelo extraído de la reconstrucción iMM904. Aunque existe un estudio sobre este modelo (Mo et al., 2009), son necesarios trabajos que exploren otros componentes además de la glucosa, tales como el etanol el cual es importante en la producción de biocombustibles.
El estudio de este modelo es importante debido a que la reconstrucción iMM904 es la más detallada dentro de las reconstrucciones que han sido base para las reconstrucciones actuales (Mo et al., 2009). También se requiere la validación de la capacidad de predicción de la técnica FBA utilizando dicho modelo. Esto permite determinar la aplicabilidad de este modelo en futuros trabajos sobre el organismo S. cerevisiae, y además muestra cuales son los problemas de predicción, con el fin de proponer futuros estudios para solucionarlos.
El uso de FBA con modelos extraídos de reconstrucciones genómicas ha permitido evaluar genes esenciales de crecimiento, reducción, o no esenciales; y por tanto permite la identificación de objetivos en el desarrollo de medicamentos usados en tratamientos como el de la tuberculosis (Raman et al., 2005). Otra de las aplicaciones del FBA y modelos genómicos es la predicción de respuesta de microorganismos ante eliminación o reducción de expresión genética. Estas predicciones son usadas para realizar ingeniería metabólica con el fin de obtener bioproductos deseados (Manichaikul et al., 2009). Usar la reconstrucción iMM904 permite estudiar S. cerevisiae a un nivel de detalle mucho mayor que los modelos iFF708 e iND750.
El objetivo del presente artículo es comparar los resultados obtenidos al aplicar la técnica de FBA utilizando el modelo estequiométrico iMM904, contra resultados experimentales de este organismo. Además se busca comparar los resultados de aplicar FVA contra mediciones experimentales. En este artículo se describen y utilizan las técnicas FBA y FVA sobre el modelo estequiométrico de la iMM904. La capacidad de predicción es representada por los errores entre las predicciones de crecimiento y producción de los componentes CO2 y etanol del organismoS. cerevisiae, y los correspondientes valores experimentales.
Este artículo está organizado de la siguiente forma: la sección de métodos explica el modelo estequiométrico y describe las técnicas FBA y FVA, y el por qué de la existencia de múltiples soluciones de un FBA. La sección de resultados muestra el resultado de aplicar las técnicas FBA y FVA al modelo estequiométrico obtenido de la reconstrucción iMM904. La sección final indica las conclusiones del presente trabajo.
Materiales y métodos
Modelo estequiométrico
En el modelo estequiométrico, la variación de la cantidad de un componente a través del tiempo vjE , se define como una combinación lineal
donde vj son las velocidades de reacción que lo afectan, Sj, y N es el coeficiente estequiométrico que indica la cantidad requerida o producida del componente ni en la reacción con velocidad vj, y N es el número de reacciones del sistema. De la misma manera, el conjunto de variaciones de todos los componentes ni donde i=1,...,M se representan por medio del sistema de ecuaciones lineales
donde n = [ n1, ..., nM]T es el vector de cantidades de los componentes del sistema estudiado, es una matriz de dimensiones, la cual se conoce como la matriz estequiométrica, y es el vector de velocidades de reacción (vector de distribución de flujos o vector de flujos). En todo modelo estequiométrico el número de componentes es menor que el número de reacciones, es decir M < N.
La figura 1 muestra un ejemplo de un modelo estequiométrico. El sistema está compuesto por cuatro componentes cuyas cantidades son: ρ1, ρ2, n1, n2 y cuatro reacciones cuyas velocidades son: ν1, ν2, ν3 y ν4. ρ1 y ρ2 son respectivamente la entrada y la salida del sistema y se conocen como componentes externos. n1 y n2representan componentes internos. Este sistema puede representarse mediante un grafo cuyos nodos corresponden a los componentes n1 y ρw w = 1, ..., w, y cuyas aristas corresponden a las reacciones vj (figura 1(a)).
El conjunto de reacciones que describe el sistema se muestra en la figura 1(b). En este sistema una reacción es un proceso que afecta un conjunto de componentes, así como una arista es una conexión entre un conjunto de nodos en un grafo. Las reacciones se clasifican en internas y externas. Las reacciones internas incluyen solo componentes internos y las externas afectan tanto componentes internos como externos. La cantidad de cada uno de los componentes que involucra cada reacción se muestra en la figura 1(b); por ejemplo, la reacción que ocurre a la velocidad v1 toma una unidad del componente ρ1 y produce dos unidades de n1 .
Para construir la matriz S‾ se usa la matriz de incidencia S‾ de dimensiones (W + M) × N, mostrada en la figura 1(c). Las primeras W filas de S‾ corresponden a los componentes ρ w, y las restantes corresponden a los componentes n1 . Las columnas de S‾ corresponden a las reacciones con velocidades vj .
En la figura 1(c) la columna 1 de la matriz s‾ corresponde a la reacción con velocidad v1 . Esta columna fue construida tomando los coeficientes que aparecen en la figura 1(b). En esta reacción no participan los componentes ρ2 y n2, por tanto S‾2,1=S‾4,1=0 . El componente ρ1 se encuentra en la parte inicial de la flecha que representa la reacción v1 por lo tanto el valor de S‾1,1 es igual al coeficiente que acompaña a ρ1con signo negativo, es decir S‾1,1=-1 . El componente n1 se encuentra en la parte final de la flecha que representa a v1, por lo tanto S‾3,1 es igual al coeficiente que acompaña a n1 con signo positivo, es decir S‾3,1=2 .
En general, si S‾w+i,j<0 entonces vj consume ¦ S‾w+i,j ¦ unidades del componente ni, si S‾w+i,j>0 entonces la reacción vj produce el componente n1 S‾w+i,j unidades, y si S‾w+i,j=0 el componente ni no participa en la reacción vj . De forma análoga, S‾w+i,j representa la participación del componente ρw en la reacción vj .
La matriz S se obtiene eliminando las primeras W filas de S‾ que corresponden a componentes externos. La figura 1(d) muestra la matriz S resultado de eliminar las filas w = 1,2 de S‾, que corresponden a los componentes ρ1 y ρ2 . En S se cumple que M < N (M = 2 y N = 4). Finalmente, la figura 1(e) muestra el vector de velocidades de reacción v .
Análisis de balance de flujos - FBA
Para estimar el comportamiento de un sistema usando el modelo estequiométrico, se asume estado estacionario del sistema el cual se representa por medio de la ecuación
donde OM es un vector de longitud M cuyos elementos son todos cero. La ecuación matricial (3) define un sistema de ecuaciones lineales subdeterminado con infinitas soluciones. Para delimitar el espacio solución de la ecuación (3) se definen los límites de cada una de las velocidades de reacción del sistema mediante
donde αj y βj son los límites inferior y superior de vj . Por último se establece una función objetivo
donde c = [c1, ..., cN] y es el vector que define el objetivo del sistema. Si la reacción vj está en la función objetivo f entonces cj ≠ 0. En caso contrario cj = 0.
Dados la matriz S, los vectores α = [α1,…, αN], Β = [Β1,…, ΒN] y c, se busca un vector que sea solución del problema de programación lineal
la búsqueda de soluciones al problema (6) se conoce como FBA.
La figura 2 muestra un sistema biológico y las definiciones correspondientes a la formulación FBA. Los elementos externos son ρ 1, ρ2, ρ3, ρ4 y los internos son n1, n3, n4 y n5. El grafo que describe el sistema se muestra en lafigura 2(a). La matriz estequiométrica S se define en la figura 2(b). α, β y c se muestran en la figura 2(c). El valor negativo de α1 indica que la dirección de la reacción con velocidad v1 puede ser en cualquiera de dos sentidos: consumo del elemento n1 con un valor máximo β1=5, o producción de éste con valor mínimo α1=-2. Un valor negativo de vj indica que lo que se produce en una reacción se consume y lo que se consume se produce. En general si αj<0 entonces la reacción con velocidad vj se denomina reversible. Si por el contrario αj ≥0 entonces vjes irreversible, debido a que conserva la dirección con la que aparece el grafo (Raman y Chandra, 2009).
El vector de coeficientes c define la función objetivo del sistema de la figura 2. En este ejemplo el vector contiene valores diferentes de 0 en las posiciones correspondientes a las reacciones externas v1 y v2 . Esto indica que el objetivo del sistema es la maximización de las velocidades de las reacciones que producen los elementos ρ2 y ρ4 . En el caso de la figura 2, la función objetivo se puede expresar como = cTv = v2 + v4. La solución v mostrada en la figura 2(c) se obtuvo a través de programación lineal utilizando el paquete matemático MatLab . La figura 2(d) muestra de forma gráfica la interpretación de este resultado. Por último la figura 2(e)muestra el código utilizado en MatLab para obtener esta solución.
Soluciones del FBA
El conjunto de ecuaciones lineales Sv = 0M y de inecuaciones lineales αj ≤ νj ≤ Βj definen el poliedro convexo, cerrado y acotado
Como lo demuestra (Gass, 1985), todo poliedro convexo, cerrado y acotado tiene la representación
donde uk k = 1,..., se conoce como los puntos extremos o vértices del poliedro P. Un punto uk es extremo si no existen dos puntos a y b ε P tales que uk = θa + (1 - θ)b . Esta representación de P se conoce como la representación V.
El teorema estudiado en (Gass, 1985) indica que el vector que resuelve la ecuación (6) es el punto extremo uQ, Q?{1, ,L} tal que cTuQ > cTuk con k≠Q . En caso de existir múltiples soluciones, los vectores que resuelven la ecuación (6) son los puntos extremos uQr, Qr &e12:50 09/10/2012psilon;{1, ,L} r = 1, ,R tales que cTuQr > cTukcon k ≠ Qr y . Más aún, los vectores de la forma
también son solución de la ecuación (6).
Los teoremas anteriormente descritos son equivalentes a establecer que, el punto extremo con el mayor valor de función objetivo es solución única de la ecuación (6). Si existe más de un punto extremo con el máximo valor de función objetivo posible, la ecuación (6) tiene infinitas soluciones, todas descritas por combinaciones lineales convexas de estos puntos extremos.
La existencia de más de una solución se ilustra a través del estudio de los puntos extremos del problema de lafigura 2. Se obtuvieron L=35 puntos extremos mediante el Método de Descripción Doble (cdd) (Fukuda and Prodon, 1996), con implementación disponible para uso en MatLab. En la figura 3 se muestran los valores de cTuk, k = 1,...,L. El máximo valor de cTuk es 5, el cual corresponde a los puntos u24, u33, u34 y u35 .
En la figura 4 se muestran los puntos uQr, r=1,...,4 con Q1=24, Q2=33, Q3=34 y Q4=35, que son los puntos extremos solución de la ecuación (6). El vector solución v mostrado en la figura 2 se puede expresar como la combinación lineal convexa de los puntos extremos uQr indicados en la figura 3. Esto se indica en la figura 4. Para encontrar los valores λr mostrados en la figura 4, se hizo λ=U+v, donde λ =[λ1,..., λ4]T, U = [uQr1,..., uQ4 U+ es la pseudoinversa de U y v es el vector solución encontrado en la figura 2.
Análisis de variabilidad de flujos - FVA
Debido a la existencia de múltiples soluciones de (6), se requiere determinar el intervalo de posibles valores de vj . El Análisis Variabilidad de Flujos (Mahadevan y Schilling, 2003) consiste en optimizar el valor de vj mediante dos problemas de optimización separados. La primera optimización consiste en minimizar vj a través de
y la segunda optimización consiste en maximizar vj resolviendo
Las simulaciones realizadas buscan determinar la capacidad de predicción del FBA usando el modelo estequiométrico obtenido de la reconstrucción iMM904. Para este fin, se compara las velocidades de reacciones de consumo/producción de componentes obtenidas a través del FBA, con las respectivas mediciones experimentales. El conjunto de mediciones experimentales usado en este trabajo fue tomado de (Nissen et al., 1997) y se presenta en la tabla 2. Consta de 4 experimentos bajo condiciones anaeróbicas, en los cuales varía la velocidad de crecimiento (gw) del sistema. A cada velocidad de crecimiento, le corresponde la velocidad de producción de dióxido de carbono (CO2), etanol (eth), glicerol (gly), sucinato (succ), acetato (ace) y consumo de glucosa (glc).
La reconstrucción iMM904 cuenta con 1228 componentes internos y 1577 reacciones. Está disponible en formato SimPheny (Mo et al., 2009).
Se define v<reacción>, como la velocidad de reacción de nombre <reacción>, con j igual al índice de la columna de S que corresponde a la reacción . Los valores α<reacción> y β<reacción> definen los límites de la reacción v<reacción> . El valor c<reacción> define el coeficiente que acompaña a v<reacción> en la función objetivo. La correspondencia entre nombres de reacción en la iMM904 y velocidades v<reacción> usados en las simulaciones del presente trabajo se muestran en la tabla 3. Las reacciones listadas son externas, salvo vgw y vATPM . Por convención, en la reconstrucción iMM904 todas las reacciones externas producen componentes externos.
El modelo estequiométrico S1228×1577 se construye utilizando el paquete COBRA disponible para MatLab® (Schellenberger et al., 2011). La reconstrucción iMM904 también cuenta con información sobre las capacidades del sistema representadas por los vectores α y β . Excluyendo algunas reacciones, los límites de vj son αj=-1000 (mmol/gDWh) para reacciones reversibles, αj=0 (mmol/gDWh) para irreversibles y βj=-1000 (mmol/gDWh) . La función objetivo incluida en esta reconstrucción es la maximización del crecimiento del sistema, representada por c, con cgw=1 y para toda reacción diferente a la de crecimiento. Este vector c se interpreta como que el objetivo es la maximización de crecimiento del sistema. La reconstrucción iMM904 incluye la función objetivo cTv descrita anteriormente debido a que es la más aceptada en la literatura (Feist y Palsson, 2010) . El modelo está disponible para MatLab® y COBRA**** .
**** http://www.eecsgroup.com/CV_Research_files/cb_iMM904.mat
Las condiciones de las mediciones experimentales de la tabla 2 requieren modificación de algunas restricciones FBA que establece por defecto la reconstrucción iMM904. La condición anaerobia significa que el medio en el que se encuentra carece de oxigeno. En el FBA esto equivale a establecer αEX_02(e) βEX_02(e)=1. Debido al estado anaerobio es necesario que el sistema tenga acceso a componentes que en ausencia de oxigeno no se pueden producir. Por defecto las reacciones correspondientes a estos componentes solo producen y no consumen, es decir dichas reacciones son irreversibles. Para permitir que el sistema tenga acceso a componentes fundamentales se convierten en reversibles.
El mantenimiento interno de energía del sistema, representado en el modelo por vAPTM se conserva igual al provisto por la reconstrucción. La lista de restricciones por defecto de la iMM904 y las restricciones del FBA establecidas en este trabajo se presentan en la tabla 4. Esta lista no incluye todas las restricciones, solo aquellas relevantes para el conjunto de datos experimentales de la tabla 2.
Cada una de las cuatro condiciones experimentales expuestas en la tabla 2 establece una entrada de glucosa. Esta entrada es representada fijando αEX_glc(e) y βEX_glc(e) a cada uno de los valores experimentales. Por defecto todas las reacciones externas de la iMM904 producen componentes externos. La reacción vEX_glc(e) es externa y produce el componente de glucosa (glc(e)). El valor experimental de glucosa que aparece en la tabla 2 es de consumo y no producción por tanto, el valor de αEX_glc(e) y βEX_glc(e) es el valor experimental con signo negativo.
Por cada condición experimental de la tabla 2 se realizó un FBA y un FVA. Se determinó el error entre la predicción de las velocidad de reacción vj y el correspondiente valor experimental vjE mediante ¦ (vj-vjE)/vjE ¦ X 100%. También se midió la variabilidad de cada una de las reacciones en cada una de las condiciones experimentales. Esta variabilidad se obtuvo restando el valor mínimo del máximo de la reacción obtenidos resolviendo las ecuaciones (10) y (11) para aquellas con información experimental disponible.
También se realizó un FVA fijando el valor de la función objetivo f=vgw al valor de crecimiento de cada condición experimental del sistema. Al fijar la función objetivo al valor experimental de crecimiento se busca determinar los efectos de un estado subóptimo del sistema sobre la variabilidad de las demás reacciones con valor experimental.
Las simulaciones se realizaron en un equipo con procesador Intel Core i3® y memoria RAM de 4GB DDR3. Los problemas de programación lineal de este trabajo fueron solucionados utilizando el paquete de software libre GLPK (Makhorin, 2011) con interfaz disponible para MatLab® a través del paquete COBRA.
Resultados
Los resultados obtenidos se muestran en la figura 6. Las reacciones con las mejores predicciones mediante FBA en las cuatro condiciones experimentales son, en orden de exactitud CO2, con errores entre 0.3% y 4.5% ; etanol, entre 11% y 13% ; y crecimiento, entre 11% y 28% (figura 5). La predicción del crecimiento es superior al registrado en cada condición experimental de la tabla 2 (figura 5(a)).
La predicción de glicerol en todas las condiciones experimentales es de 0 (mmmol/gDWh) . El valor experimental del glicerol en todas las condiciones comparadas está entre 0 y 6 (mmmol/gDWh) . Esto implica que el error de predicción de glicerol excede el 100%. La predicción de sucinato en todas las condiciones experimentales está entre 0 y 2 (mmmol/gDWh) . Los valores experimentales de sucinato en todas las condiciones están entre 0.03 y 0.07 (mmmol/gDWh) . Por lo tanto, el error en la predicción de sucinato supera el 100%. Observaciones similares a las anteriores muestran que el error en las predicciones de acetato y piruvato exceden el 100%.
La exactitud de las predicciones de CO2 son mejores que las registradas en (Famili et al., 2003). Las predicciones de etanol tienen una exactitud similar a las registradas en dicho trabajo. Es importante resaltar que (Famili et al., 2003) es el único estudio de S. cerevisiae mediante FBA y modelos genómicos que incluye un FVA.
La figura 5 muestra también los resultados de variabilidad de las soluciones FBA para cada condición experimental. Se considera que no hay variabilidad cuando la diferencia entre el valor máximo y mínimo de una reacción en una predicción es inferior a aX10-5 (Mahadevan y Schilling, 2003). Si no hay variabilidad en las velocidades de reacción estudiadas quiere decir que todas las soluciones posibles tienen los mismos valores de velocidades de reacción estudiadas. Si todas las velocidades vj no tienen variabilidad entonces la solución es única. A mayor variabilidad, mayor número de soluciones al problema FBA. La variabilidad de las reacciones con mediciones experimentales osciló entre 2X10-5 y 3.48 . Las reacciones vEX_gly(e) y vEX_ace(e) tuvieron variabilidad únicamente en la condición experimental 2 . La reacción vEX_pyr(e) no tuvo variabilidad en las condiciones 1 y 3 . La figura 5(c) muestra que el valor experimental de vEX_gly(e) no está entre las predicciones máxima y mínima. Las predicciones máxima y mínima del sucinato, acetato y piruvato solo contienen los valores de la condición experimental 2 (figuras 5(d), 5(e) y 5(f)).
La figura 6 muestra los resultados de realizar FVA fijando el valor de función objetivo al valor experimental de vgw. La variabilidad aumentó, oscilando entre 0.81 y 36.54 (mmol/gDWh) para las reacciones con valor experimental. A diferencia de la figura 5, los valores de las condiciones experimentales están entre el valor mínimo y máximo de cada reacción. Estos resultados requieren un valor de crecimiento diferente al óptimo para explicar el comportamiento experimental de vEX_gly(e), vEX_succ(e), vEX_ace(e) y vEX_pyr(e) . Este valor de crecimiento es subóptimo comparado con el obtenido por el FBA. Lo anterior implica que fijar el crecimiento a un valor subóptimo, permite que la diferencia entre la predicción FBA de crecimiento vgw y su respectivo valor experimental pueda ser utilizada en la producción de componentes como el glicerol vEX_gly(e) .
Aunque la exactitud de las predicciones es similar a la encontrada en la literatura, los FVA realizados en este trabajo muestran que se requiere una función objetivo que permita al FBA explicar completamente el comportamiento experimental. Es necesario un estudio de la técnica FBA y la reconstrucción iMM904 utilizando propuestas alternativas de funciones objetivo.
Conclusiones
Las reacciones con las mejores predicciones FBA dentro del conjunto de datos de (Nissen et al., 1997) son producción de CO2 vEX_co2(e), con errores entre el 0.3% y el 4.5%; producción de etanol vEX_etoh(e), con errores entre el 11% y 13% y crecimiento vgw con errores entre el 11% y 28%. El FBA y la reconstrucción iMM904 predice la producción de CO2 con una exactitud superior a la registrada en la literatura, para las condiciones experimentales de (Nissen et al., 1997). La predicción de etanol obtenida es similar a trabajos anteriores.
Los resultados de los FVA realizados en este trabajo permitieron determinar que el FBA y la reconstrucción iMM904 falla en la predicción de glicerol vEX_gly(e), sucinato vEX_succ(e), acetato vEX_ace(e) y piruvato vEX_pyr(e)bajo las condiciones experimentales descritas en (Nissen et al., 1997). La no variabilidad en la predicción de estos componentes soporta esta afirmación. El aumento de la variabilidad obtenida al realizar el estudio de FVA con un valor subóptimo de función objetivo confirma este resultado.
Este trabajo detalló la formulación FBA aplicada a la reconstrucción iMM904. A diferencia de los trabajos encontrados en la literatura, este trabajo explica cada una de las restricciones utilizadas en el FBA y mostró su equivalencia en las condiciones experimentales utilizadas. Este trabajo describió y mostró la importancia de utilizar el FVA para el análisis de resultados arrojados por el FBA.
Referencias bibliográficas
1 Bai, F. W., Anderson, W. A., & Moo-Young, M. 2008. Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks. Biotechnology Advances, 26(1), 89-105.
2 Bro, C., Regenberg, B., Forster, J., & Nielsen, J. 2006. In silico aided metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for improved bioethanol production. Metabolic Engineering, 8(2): 102-111.
3 Burgard, A. P., & Maranas, C. D. 2003. Optimization-Based Framework for Inferring and Testing Hypothesized Metabolic Objective Functions. Wiley Periodicals.
4 Duarte, N. C., Herrgård, M. J., & Palsson, B. O. 2004. Reconstruction and Validation of Saccharomyces cerevisiae iND750, a Fully Compartmentalized Genome-Scale Metabolic Model. Genome Research, 14(7): 1298 -1309.
5 Famili, I., Förster, J., Nielsen, J., & Palsson, B. O. 2003. Saccharomyces cerevisiae phenotypes can be predicted by using constraint-based analysis of a genome-scale reconstructed metabolic network. Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(23):13134 -13139.
6 Feist, A. M., & Palsson, B. O. 2010. The biomass objective function. Current opinion in microbiology, 13(3): 344-349.
7 Förster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., & Nielsen, J. 2003. Genome-Scale Reconstruction of theSaccharomyces cerevisiae Metabolic Network. Genome Research, 13(2): 244 -253.
8 Fukuda, K., & Prodon, A. 1996. Double description method revisited. In M. Deza, R. Euler, & I. Manoussakis (Eds.), Combinatorics and Computer Science, Lecture Notes in Computer Science (Vol. 1120, pp. 91-111).
9 Gass, S. I. 1985. Linear programming: methods and applications. New York, Courier Dover Publications, 36 p.
10 Gianchandani, E., Oberhardt, M., Burgard, A., Maranas, C., & Papin, J. 2008. Predicting biological system objectives de novo from internal state measurements. Bioinformatics, 9(1): 43.
11 Gianchandani, E. P., Chavali, A. K., & Papin, J. A. 2010. The application of flux balance analysis in systems biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine, 2(3): 372-382.
12 Gong, Zhaohua, Liu, C., Feng, E., & Zhang, Q. 2009. Computational method for inferring objective function of glycerol metabolism in Klebsiella pneumoniae. Computational Biology and Chemistry, 33(1): 1 - 6.
13 Gong, Z, & Yu, Y. 2010. Infer objective function of glycerol metabolism in Klebsiella pneumoniae basing on bilevel programming. Journal of Systems Science and Complexity, 334-342.
14 Herrgard, M. J., Swainston, N., Dobson, P., Dunn, W. B., Arga, K. Y., Arvas, M., Buthgen, N., et al. 2008. A consensus yeast metabolic network reconstruction obtained from a community approach to systems biology. Nat Biotech, 26(10): 1155-1160.
15 Hjersted, J. L., & Henson, M. a. 2009. Steady-state and dynamic flux balance analysis of ethanol production by Saccharomyces cerevisiae. Systems Biology, 3(3): 167-79.
16 Kauffman, K. J., Prakash, P., & Edwards, J. S. 2003. Advances in flux balance analysis. Current Opinion in Biotechnology, 14(5): 491-496.
17 Kuepfer, L., Sauer, U., & Blank, L. M. 2005. Metabolic functions of duplicate genes in Saccharomyces cerevisiae. Genome Research, 15(10): 1421 -1430.
18 Lee, J. M., Gianchandani, E. P., & Papin, J. A. 2006. Flux balance analysis in the era of metabolomics. Briefings in Bioinformatics, 7(2): 140 -150.
19 Lee, S., Phalakornkule, C., Domach, M. M., & Grossmann, I. E. 2000. Recursive MILP model for finding all the alternate optima in LP models for metabolic networks. Computers and Chemical Engineering.
20 Llaneras, F., & Picó, J. 2008. Stoichiometric modelling of cell metabolism. Journal of Bioscience and Bioengineering, 105(1): 1-11.
21 Mahadevan, R., & Schilling, C. H. 2003. The effects of alternate optimal solutions in constraint-based genome-scale metabolic models. Metabolic Engineering.
22 Makhorin, A. 2011. GLPK (GNU Linear Programming Kit), v. 4.47. Retrieved fromhttp://www.gnu.org/software/glpk/
23 Manichaikul, A., Ghamsari, L., Hom, E. F. Y., Lin, C., Murray, R. R., Chang, R. L., Balaji, S., et al. 2009. Metabolic network analysis integrated with transcript verification for sequenced genomes. Nature Methods, 6(8): 589-592.
24 Mo, M., Palsson, B., & Herrgard, M. 2009. Connecting extracellular metabolomic measurements to intracellular flux states in yeast. Systems Biology / BMC, 3(1): 37.
25 Nissen, T. L., Schulze, U., Nielsen, J., & Villadsen, J. 1997. Flux Distributions in Anaerobic, Glucose-Limited Continuous Cultures of Saccharomyces Cerevisiae. Microbiology, 143(1): 203 -218.
26 Nookaew, I., Jewett, M., Meechai, A., Thammarongtham, C., Laoteng, K., Cheevadhanarak, S., Nielsen, J., et al. 2008. The genome-scale metabolic model iIN800 of Saccharomyces cerevisiae and its validation: a scaffold to query lipid metabolism. Systems Biology, 2(1): 71.
27 Orth, J. D., Thiele, I., & Palsson, B. U. 2010. What is flux balance analysis? Nature biotechnology, 28(3): 245-8.
28 Raman, K., & Chandra, N. 2009. Flux balance analysis of biological systems: applications and challenges. Brief Bioinform, 10(4): 435-449.
29 Raman, K., Rajagopalan, P., & Chandra, N. 2005. Flux Balance Analysis of Mycolic Acid Pathway: Targets for Anti-Tubercular Drugs. Computational Biology, 1(5), e46.
30 Schellenberger, J., Que, R., Fleming, R. M. T., Thiele, I., Orth, J. D., Feist, A. M., Zielinski, D. C., et al. 2011. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0. Nat. Protocols, 6(9): 1290-1307.
31 Schuetz, R., Kuepfer, L., & Sauer, U. 2007. Systematic evaluation of objective functions for predicting intracellular fluxes in Escherichia coli. Molecular Systems Biology.
32 Van Berlo, R. J. P., de Ridder, D., Daran, J.-M., Daran-Lapujade, P. a S., Teusink, B., & Reinders, M. J. T. 2011. Predicting metabolic fluxes using gene expression differences as constraints. Transactions on computational biology and bioinformatics, 8(1): 206-16.
33 Zomorrodi, A., & Maranas, C. 2010. Improving the iMM904 S. cerevisiae metabolic model using essentiality and synthetic lethality data. Systems Biology, 4(1): 178.
How to Cite
APA
ACM
ACS
ABNT
Chicago
Harvard
IEEE
MLA
Turabian
Vancouver
Download Citation
Article abstract page views
Downloads
License
Copyright (c) 2012 Revista Colombiana de Biotecnología
![Creative Commons License](http://i.creativecommons.org/l/by/4.0/88x31.png)
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Authors who publish in the journal are welcome to code Creative Commons 4.0 Attribution, non-commercial, no derivatives. That is, that even as the Colombian Journal of Biotechnology of free access, users can download the information contained in it, but should give attribution or recognition of intellectual property, should use it as is, without derivation and should not be used with commercial purposes. Creative Commons This work is under a Creative Commons Attribution 4.0 License International. You are free: Share - copy and redistribute the material in any media or format Adapt - remix, transform and create from the material for any purpose, including commercial. The licensor can not revoke these freedoms while complying with the terms of the license. Under the following conditions: Attribution - You must properly acknowledge authorship, provide a link to the license and indicate whether changes have been made <. You can do this in any reasonable manner, but not in a way that suggests that support the licensor or receives for his use. No additional restrictions - You can not apply legal terms or technological measures that legally restrict realize what the license allows. notices: You do not have to comply with the license for those elements of the material in the public domain or where their use is permitted by the application of an exception or a limit. No guarantees are given. The license can not provide all the necessary permits for the intended use. For example, other rights such as advertising, privacy, or moral rights may limit the use of the material.