Las proteínas B3 y PDI aisladas de plaquetas humanas se unen con el rotavirus ECwt in vitro

β3 and PDI proteins isolated from human platelets bind with ECwt rotavirus in vitro

Antecedentes. En la actualidad, no se dispone de integrina β3 de manera comercial y la PDI comercial tiene costos muy altos, lo cual dificulta el acceso a estas dos proteínas para realizar estudios conducentes a establecer si β3 y PDI interactúan con cepas de rotavirus silvestres. Objetivo. Explorar una metodología que permitiese aislar las proteínas β3 y PDI a partir de plaquetas humanas para generar anticuerpos policlonales en conejo contra la integrina β3 y evaluar la interacción entre las proteínas PDI y β3 con el rotavirus ECwt.

Material y métodos. Mediante la técnica de electroforesis preparativa en condiciones reductoras, se separaron las proteínas de un lisado de plaquetas humanas y posteriormente se electroeluyeron. Mediante las técnicas de coinmunoprecipitación, "Western blotting" y ELISA de captura se analizó la interacción del rotavirus ECwt con las proteínas β3, y PDI.

Resultados. Las proteínas totales de un lisado de plaquetas humanas se separaron mediante electroforesis en condiciones reductoras, se identificaron las proteínas β3 y PDI en un segmento del gel, utilizando anticuerpos comerciales en "Western blotting" y luego se aislaron estas dos proteínas del resto del gel. Posteriormente las proteínas se electroeluyeron del segmento del gel y se analizó su pureza. La proteína β3 se utilizó para generar anticuerpos policlonales en conejo. Igualmente, β3 y PDI eluidas se incubaron con el rotavirus ECwt y mediante la técnica de co-inmunoprecipitación y ELISA de captura encontramos que estas dos proteínas se unen in vitro. Esta misma unión se observó cuando se incubó las vellosidades aisladas de intestino delgado de ratón lactante con el rotavirus.

Conclusión. Se logró purificar parcialmente a partir de plaquetas humanas, utilizando electroforesis preparativa, cantidades relativamente altas de proteína β3 y PDI. El aislamiento de estas proteínas nos permitió generar un anticuerpo policlonal contra β3 y establecer que β3 y PDI se unen in vitro, luego de incubar las proteínas aisladas con el rotavirus ECwt, e in vivo, después de incubar el rotavirus con las vellosidades aisladas del intestino delgado de ratón lactante de la cepa ICR.

Background. Commercial integrin β3 is currently not available and commercial PDI is too expensive, which is making access difficult to these proteins needed for conducting experiments aimed at the establishment of possible interactions between integrin β3 and PDI and wild type rotavirus strains.

Objective. To explore a methodology allowing isolation of proteins β3 and PDI from human platelets to be used as antigens in the generation of rabbit polyclonal antibodies useful in the assessment of interactions between these proteins and rotavirus ECwt.

Materials and methods. Proteins β3 and PDI from human platelet lysates were separated using preparative electrophoresis under reducing conditions and then eluted. Interactions of these proteins with rotavirus ECwt were analyzed using co-immunoprecipitation, Western blotting and capture ELISA.

Results. Proteins from human platelet lysates were separated by preparative electrophoresis under reducing conditions. The identification of proteins β3 and PDI present in a gel slice was performed through their reaction with commercial antibodies in a Western blotting analysis. Protein purity was established after electroelution from a gel slice. Polyclonal antibodies against protein β3 were generated in rabbit. Incubation of eluted proteins β3 and PDI with rotavirus ECwt showed in co-immunoprecipitation and ELISA assays that these proteins bound virus in vitro. The same binding was showed to occur when rotavirus was incubated with isolated small intestinal villi from suckling mice.

Conclusions. Relatively high amounts of proteins β3 and PDI were partially purified from human platelets by preparative electrophoresis. The isolation of these proteins allowed the generation of polyclonal antibodies against β3 in addition to the establishment of the in vitro interaction of proteins β3 and PDI with rotavirus ECwt. This interaction was also demonstrated in vivo after incubating the virus with isolated small intestinal villi from suckling mice.