Posible presencia de un gen R1 en germoplasma de Solanum tuberosum Grupo Phureja

Phytophthora infestans causa la gota, que es la enfermedad en la papa de mayor importancia económica a nivel mundial. La obtención de cultivares resistentes al patógeno es una estrategia necesaria para su control, por lo cual la identificación de genes de resistencia a P. infestans (Rpi) es fundamental para apoyar los programas de mejoramiento. La introgresión de Rpi desde especies silvestres o nativas dentro de cultivares es una vía para desarrollar cultivares con resistencia. S. phureja tiene notables características culinarias y nutricionales, e igualmente ha sido identificada como una fuente de resistencia a la gota, lo cual la sitúa en una posición de interés desde el punto de vista de recurso genético con fines de mejoramiento. Se caracterizaron genotípicamente 88 accesiones de S. phureja con marcadores moleculares tipo SCAR, el gen R1 de resistencia a P. infestans, el gen candidato StAOS2 y un marcador tipo CAPS ligados a loci para resistencia a P. infestans en Solanum tuberosum. Se presentó polimorfismo en los marcadores Prp1 y R1. La amplificación del marcador R1 mostró el alelo de 1.400 pb, característico del gen R1 en 17 accesiones de la colección de S. phureja, lo cual sugiere que estas accesiones posiblemente podrían tener un gen homólogo al gen R1 identificado en S. demissum.

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EDITORIAL

La difusión de los esfuerzos de la comunidad científica y del gremio de productores agrícolas en pro de la modernización de nuestra agricultura depende en buena parte de una adecuada labor de difusión de los avances investigativos y de implementación tecnológica. A esta labor ha venido contribuyendo Agronomía Colombiana de un modo cada vez más activo. Por ello tenemos el gusto de informar a nuestros lectores que este año nuestra revista ha sido incluida en el sistema de información científica "Redalyc" (Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal). Este portal permite la consulta directa de todos los artículos publicados en la revista.

En este contexto, resulta grato para Agronomía Colombiana presentar los avances recientes de los distintos campos de la ciencia agronómica tropical en el contexto de Colombia y Latinoamérica. Así pues, esperamos que su divulgación sea para investigadores, agricultores y en general, para los profesionales afines al agro, de gran provecho y utilidad.

Es así que en el campo del "Fitomejoramiento, recursos genéticos y biología molecular" tenemos el gusto de presentar tres interesantes logros. En relación con el cultivo de la papa, uno de los pilares de la alimentación en nuestro país y en el mundo, el presente número incluye un importante trabajo que reporta el descubrimiento de un gen que se cree confiere resistencia a la gota (Phytophtora infestans) en el Grupo Phureja de este cultivo.

Igualmente, resulta grato reportar la identificación de una serie de materiales de fríjol reventón –producto que tiene una variedad de aplicaciones industriales potenciales, incluida la preparación de crispetas– con características agronómicas y de procesamiento que resultan bastante promisorias. Finalmente, tenemos una importante revisión sobre el estado de nuestro conocimiento acerca de la adaptación de cultivos –específicamente la soya– a las condiciones de la altillanura colombiana, la cual constituye para nosotros un gran polo de expansión agrícola, en la medida en que se consiga soslayar el obstáculo impuesto por la toxicidad del aluminio de sus suelos.

En nuestra sección de "Fisiología de cultivos" tenemos, por una parte, un análisis del metabolismo de carbohidratos de la palma de aceite cuando es afectada por la enfermedad conocida como "marchitez letal" (de etiología desconocida), la cual ha comenzado a presentarse en la región palmera del río Upía en los llanos orientales de Colombia. Los cambios metabólicos encontrados parecen asociar la enfermedad a la presencia de fitoplasmas. A su vez, y en cuanto a otro cultivo que ha cobrado gran impulso en el país, tenemos una revisión acerca de un campo poco investigado: la relación entre la nutrición mineral y la ruta de síntesis de los edulcorantes presentes en estevia.

A estos se suma un experimento sobre la fenología de la uchuva en condiciones de salinidad, que indica que esta es al parecer una especie moderadamente tolerante a la sal, lo cual resulta importante dado el proceso actual de salinización de tierras a nivel mundial. Tenemos también una revisión sobre la dormancia de la papa –la cual resulta particularmente interesante dado que en Colombia la papa criolla tiene un gran potencial de exportación, que se ve limitado por la rápida brotación de los tubérculos– que aborda los mecanismos fisiológicos que regulan este proceso. Como una contribución a nuestra viticultura, presentamos una caracterización fisicoquímica del fruto de la vid para vino 'Pinot Noir', actualmente cultivada en el departamento de Boyacá. Dicho análisis ha facilitado una evaluación a fondo del momento óptimo de cosecha para esta variedad en esta región. Cerramos esta sección con un estudio que, dada la prevalencia del cultivo de clavel en sistemas sin suelo, a partir de un estudio fenológico analiza la distribución de recursos a los distintos órganos de la planta cultivada en distintos sustratos y en suelo. Encontraron que en este último la planta destina menos fotoasimilados al botón floral.

En cuanto a la "Protección de cultivos", este número de nuestra revista trae avances novedosos y muy importantes, que, si son adecuadamente aprovechados por investigadores y agricultores, auguran provechosos beneficios agrícolas. En primer lugar, tenemos cuatro aportes al cultivo de la papa, dos en el campo de la virología, provenientes del Instituto de Biotecnología, y dos relacionados con el manejo de plagas y enfermedades por medio de aceites esenciales, realizados por el Grupo de Investigación en Papa de la Facultad de Agronomía; ambas instituciones pertenecientes a la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá.

El mencionado grupo ha experimentado con una serie de plantas de la familia Lamiaceae como fuente de aceites esenciales, los cuales, en el primero de estos estudios han sido objeto de ensayos in vitro contra Phytophthora infestans; y en el segundo contra Tecia solanivora en condiciones de laboratorio. Dado que estas son quizás las dos mayores amenazas para este cultivo en nuestro país, en ambos casos es muy grato tener el privilegio de informar que los resultados son promisorios.

En cuanto a los trabajos sobre virología, es al tiempo estimulante y preocupante presentar los resultados de dos prospecciones sobre la presencia de una serie de virus específicos de la papa en la Colección Central Colombiana de este tubérculo. Afortunadamente, junto con los materiales infectados se encuentran en ella otros que hasta el momento no han mostrado la presencia de ningún patógeno de los estudiados.

Todavía dentro de esta sección, hemos incluido una prospección acerca de la distribución de la mosca Anastrepha spp. –una importante plaga frutícola de nuestro país– en el departamento de Tolima, como resultado del trabajo de varios lustros de recolección de información académica. Igualmente valiosa resulta la evaluación in vitro de una serie de isotiocianatos contra Rhizoctonia solani, acompañada de una importante consideración acerca de los métodos estadísticos utilizados para calcular las concentraciones necesarias para la eficacia de estos compuestos. Finalmente, en el campo del manejo integrado de plagas, cerramos la descripción de esta sección con un experimento que observa la susceptibilidad a plaguicidas del insecto Neoseiulus californicus, el cual tiene uso potencial en el control biológico de Tetranychus urticae, una notable plaga del cultivo de rosa bajo invernadero.

En "Suelos, fertilización y manejo de aguas" tenemos cuatro nuevos aportes. El primero de ellos busca contribuir a la toma de decisiones agrícolas a nivel regional, a través de un método de prospección de la presencia de cultivos de arroz basado en imágenes satelitales, el cual alcanza una exactitud superior al 70%. El segundo trabajo constituye un aporte al conocimiento y la técnica de análisis mineralógico de nuestros suelos, ya que caracteriza los contenidos arcillosos de estos en el valle del río Cauca –uno de los más fértiles del país– y evalúa el modelo de determinación utilizado.

Dentro de esta misma sección, el trabajo que publica los nomogramas de uso de la inyectora "Unidrench®" permite al agricultor la adaptación de las variantes mecánicas de este equipo a sus necesidades específicas de aplicación de agroquímicos. Para terminar, este aparte nos presenta un importante estudio que demuestra y documenta la provechosa influencia de la separación de basuras en la fuente, una práctica cultural poco difundida en la sociedad colombiana, sobre el compostaje de residuos sólidos municipales.

Nuestra sección "Economía y desarrollo rural" contiene dos investigaciones. La primera reporta las causas por las cuales los caficultores de Cundinamarca –específicamente del municipio de El Colegio– no han renovado sus cafetales, a pesar de su vejez. El segundo aporte nos informa que la construcción y puesta en funcionamiento del Distrito de Riego del Valle del Alto Chicamocha y Firavitoba (en el departamento de Boyacá), ha dado los resultados esperados en términos del aumento de la productividad y la producción, y la consecuente mejora del ingreso y el empleo en la región. Cerramos así la presentación del presente número de Agronomía Colombiana, el cual esperamos sea no sólo de su agrado, sino de gran provecho para nuestra pujante agricultura.

Gerhard Fischer
Editor

 

FITOMEJORAMIENTO, RECURSOS GENÉTICOS Y BIOLOGÍA MOLECULAR

  Posible presencia de un gen R1 en germoplasma de Solanum tuberosum Grupo Phureja    Possible presence of a gene R1 in germplasm of Solanum tuberosum Phureja Group   Diana Carolina Ballesteros¹, Gustavo Gómez¹, María Cecilia Delgado¹, María Fernanda Álvarez¹, Deissy Juyó¹, David Cuéllar¹ y Teresa Mosquera^{1, 2}

¹ Departamento de Agronomía, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá (Colombia).
² Autor de correspondencia. tmosquerav@unal.edu.co

Fecha de recepción: 18 de febrero de 2010. Aceptado para publicación: 28 de julio de 2010

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RESUMEN

Phytophthora infestans causa la gota, que es la enfermedad en la papa de mayor importancia económica a nivel mundial. La obtención de cultivares resistentes al patógeno es una estrategia necesaria para su control, por lo cual la identificación de genes de resistencia a P. infestans (Rpi) es fundamental para apoyar los programas de mejoramiento. La introgresión de Rpi desde especies silvestres o nativas dentro de cultivares es una vía para desarrollar cultivares con resistencia. S. phureja tiene notables características culinarias y nutricionales, e igualmente ha sido identificada como una fuente de resistencia a la gota, lo cual la sitúa en una posición de interés desde el punto de vista de recurso genético con fines de mejoramiento. Se caracterizaron genotípicamente 88 accesiones de S. phureja con marcadores moleculares tipo SCAR, el gen R1 de resistencia a P. infestans, el gen candidato StAOS2 y un marcador tipo CAPS ligados a loci para resistencia a P. infestans en Solanum tuberosum. Se presentó polimorfismo en los marcadores Prp1 y R1. La amplificación del marcador R1 mostró el alelo de 1.400 pb, característico del gen R1 en 17 accesiones de la colección de S. phureja, lo cual sugiere que estas accesiones posiblemente podrían tener un gen homólogo al gen R1 identificado en S. demissum.

Palabras clave: Phytophthora infestans, resistencia a gota, caracterización molecular, marcadores diagnóstico, Solanum phureja.

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ABSTRACT

Phytophthora infestans causes late blight in potato. This disease is the most destructive worldwide. Developing cultivars resistant to the pathogen is the most important strategy for its control, so identification of resistance genes (Rpi) is fundamental to support breeding programs. Introgression of Rpi from wild or native species within cultivars can be a good way to develop resistant cultivars. S. phureja has important culinary and nutrional traits and has been identified as a source of resistance to late blight. 88 accessions of S. phureja were genotypically characterized with molecular SCAR markers, the resistance gene R1 for P. infestans, the candidate gene StAOS2 and a CAPS marker linked to loci for resistance to P. infestans in Solanum tuberosum. Polymorphism was presented in Prp1 and R1 markers. The R1 marker amplification showed the 1,400 pb allele, which represents the R1 gene allele in 17 S. phureja accessions suggesting that these accessions could possibly have a homologous gene to the R1 gene identified in S. demissum.

Key words: Phytophthora infestans, late blight resistance, molecular characterization, diagnostic markers, Solanum phureja.

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Introducción

La papa, después del trigo y el arroz, constituye el tercer cultivo alimenticio más importante, con una producción mundial de 325 millones de toneladas para 2007 (FAO, 2010) y es el principal alimento no cereal en el mundo (Park et al., 2009a). Este cultivo ocupó el cuarto lugar en la producción agropecuaria colombiana en el año 2003 con 1,9 millones de toneladas (Espinal et al., 2005), y el tercer lugar en área sembrada, alrededor de 160.000 ha (Villarreal et al., 2007).

La papa es afectada por el Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, que causa la enfermedad conocida en Colombia como gota. Es la enfermedad más destructiva del cultivo y puede ocasionar la pérdida total del mismo. La gota afecta tanto el follaje como el tubérculo (Fig. 1) (Bradshaw et al., 2006). La gota causa reducción de 10-15% de la producción global anual. Las pérdidas y los costos estimados para el control de la enfermedad exceden anualmente los cinco billones de dólares (Park et al., 2009b). En Colombia, los fungicidas para el control de gota representan el 6% de los costos de producción total (Villarreal et al., 2007). Los fungicidas son el medio más efectivo para el control de la enfermedad, pero producen daño ambiental (Ghislain et al., 2001); por tanto, la obtención de cultivares resistentes a gota constituye un criterio fundamental en los programas de mejoramiento genético.

La papa criolla pertenece al Grupo Phureja, es diploide, aunque Ghislain et al. (2006) reportaron que algunos materiales de S. phureja exhibieron triploidia y tetraploidia. Colombia es el principal productor de papa criolla en Latinoamérica (Ligarreto y Suárez, 2003); también se cultiva en Ecuador, Bolivia y Centroamérica. Esta especie presenta periodo vegetativo corto, carece de periodo de reposo del tubérculo y tiene alto valor nutritivo (Escallón et al., 2005). S. phureja ha sido identificada como una fuente efectiva de resistencia a gota (Estrada, 2004; Sliwka et al., 2006; Mosquera, 2007; Ñústez et al., 2008; Sliwka et al., 2010), y dado que presenta otros rasgos de interés agronómico, se le considera un importante recurso para fines de mejoramiento genético. La posibilidad de encontrar en S. phureja genes novedosos de resistencia a P. infestans ha sido ya reportada por Sliwka et al. (2006, 2010), quienes identificaron un gen mayor de resistencia, Rpi-phu, el cual confiere un amplio espectro de resistencia a gota. Este locus fue mapeado en el cromosoma IX. El efecto de este locus sobre resistencia se estimó evaluando la resistencia a nivel de foliolos, de discos de tubérculos y tubérculos completos, durante cinco años.

En papa se han descrito dos tipos de resistencia a gota (Umaerus y Umaerus, 1994). Una, la resistencia poligénica o general, se basa especialmente en un locus de efecto mayor para rasgos cuantitativos (QTL, Quantitative Trait Locus) y algunos QTL de efecto menor (Constanzo et al., 2005; Simko et al., 2006). La otra, es la resistencia de tipo específico, basada en el efecto de genes mayores de resistencia (R) de efecto dominante (Gebhardt y Valkonen, 2001; Bormann et al., 2004).

Durante la primera mitad del siglo XX se descubrieron once genes R (R1-R11) derivados de la especie S. demissum. Algunos de ellos fueron introducidos en papas cultivadas (Niederhauser et al., 1954; Stewart y Bradshaw, 2001). El primer mapeo de un gen para resistencia a P. infestans fue adelantado por Leonards-Schippers et al. (1994) y posteriormente este gen, el R1, fue clonado y caracterizado (Ballvora et al., 2002). Este gen mapea en el cromosoma V. Otros genes derivados de S. demissum fueron mapeados en diferentes posiciones del genoma. El gen R2 localizó en el cromosoma IV (Li et al., 1998). Nueve genes R: R3a, R3b y R5 a R11 localizaron en el cromosoma XI (ElKharbotly et al., 1994; Huang et al., 2004; Huang, 2005; Bradshaw et al., 2006). Estudios de mapeo fino de R3 revelaron que su resistencia la confieren dos genes fuertemente ligados, R3a y R3b, específicos para diferentes patógenos (Huang et al., 2004; Huang, 2005). Recientemente Huang (2005) encontró que los genes R5, R8, R9, R10 y R11 son versiones alélicas del R3.

La resistencia de todos los genes R en papas cultivadas, provenientes de S. demissum, ha sido sobrepasada por P. infestans. Estos genes R (R1, R2, R3 y R4) son ejemplos de resistencia no durable (Malcolmson y Black, 1966; Umaerus y Umaerus, 1994). Por esta razón, se plantea que la resistencia parcial conferida por QTL es más durable que la resistencia conferida por genes mayores R (Turkensteen, 1993).

El problema con resistencia parcial en S. tuberosum está referido a su fuerte correlación con madurez tardía (Wastie, 1991). Por otra parte, la ubicación de los QTL, con frecuencia, corresponde a regiones con clusters de genes R (Grube et al., 2000; Gebhardt y Valkonen, 2001). Tomando en consideración estos hechos, los esfuerzos recientes en la identificación de fuentes de resistencia se han concentrado en genes R que confieran resistencia de amplio espectro, es decir, genes derivados de diversas fuentes silvestres de Solanum. Por ejemplo, a partir de S. berthaultii, se introgresó el gen R_pi-ber mapeado en el cromosoma X (Ewing et al., 2000; Rauscher et al., 2006).

También se presentan genes de resistencia a P. infestans en otras especies, que no se pueden cruzar directamente con S. tuberosum, tales como el Rpi1 de S. pinnatisectum en el cromosoma VII (Kuhl et al., 2001), el gen Rpi-mocl de S. mochiquense en el cromosoma IX (Smilde et al., 2005), de S. bulbocastanum, los genes RB y Rpi-blb1 mapearon en el cromosoma VIII (Naess et al., 2000; Song et al., 2003, van der Vossen et al., 2003), Rpi-blb2 mapeó en el cromosoma VI (van der Vossen et al., 2005) y Rpi-blb3 mapeó en el cromosoma IV y forma parte de un cluster con R2 y Rpi-abpt y un gen parecido a R2 de origen desconocido (Park et al., 2005a; Park et al., 2005b). Los genes RB y Rpi-abpt se están utilizando en programas de mejoramiento genético apoyados en hibridación somática y valiéndose de cruzamientos puente (Song et al., 2003; Park et al., 2005b).

Los diferentes materiales genéticos de papa poseen genes que contribuyen a generar resistencia a P. infestans, y genes que controlan otros rasgos de interés agronómico; por tanto, la estimación del potencial genético de diversos materiales —como silvestres, clones avanzados de mejoramiento, cultivares y materiales nativos— es una vía que puede permitir encontrar genes novedosos.

Para estimar el potencial genético, se requiere identificar marcadores moleculares diagnóstico. Gebhardt y Valkonen (2001) presentaron una exhaustiva revisión sobre la organización en el genoma de papa de los genes que controlan resistencia, y consolidaron información para construir un mapa en el que localizaron QTL y genes R, al igual que los marcadores asociados con ellos. Estudios posteriores han identificado nuevos marcadores moleculares (Gebhardt et al., 2004; Pajerowska et al., 2008; Pajerowska et al., 2009).

Estos marcadores fueron identificados en materiales genéticos de S. tuberosum. Sin embargo, el fondo genético de S. phureja es diferente (Mosquera, 2007), por lo cual se deben realizar análisis para determinar su polimorfismo y su asociación o ligamiento con el carácter de resistencia.

Un número de loci que confieren resistencia cuantitativa (QRL) y alrededor de 40 genes mayores para resistencia han sido mapeados sobre el mapa molecular de papa (Simko et al., 2007).

Esta investigación tuvo como objetivo evaluar en accesiones de la colección de S. phureja el polimorfismo de marcadores moleculares identificados en estudios previos en S. tuberosum por su ligamiento o asociación con el rasgo de resistencia a P. infestans.

   

Materiales y métodos

Material vegetal
En esta investigación se emplearon 88 accesiones de la colección de S. phureja con que cuenta la Universidad Nacional de Colombia (Tab. 1).

Extracción de DNA
La extracción de DNA se realizó a partir de 100 mg de tejido foliar fresco y joven. El tejido se maceró en nitrógeno líquido. Se siguió el protocolo suministrado por DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA). La calidad y pureza del DNA se evaluaron con el espectrofotómetro NanoDrop^® ND-1000 V3.2 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). Luego de cuantificar el DNA, su concentración se ajustó a 50 ng µL^-1.

Caracterización genotípica
Se analizaron marcadores moleculares tipo SCAR (Prp1, CosA, GP179, BA47f2), el gen marcador R1, el gen candidato StAOS2 y un marcador tipo CAPS (GP21). Estos marcadores se seleccionaron porque han sido ligados a loci para resistencia a P. infestans en Solanum tuberosum. Los marcadores empleados, con excepción de Prp1 y StAOS2, mapean en el hot spot de resistencia a enfermedades localizado en el cromosoma V. Se evaluó la presencia/ausencia de fragmentos de tamaños específicos esperados para cada marcador (Tab. 2) en los genotipos evaluados.

La reacción de PCR para cada uno de los marcadores se realizó con 50 ng de DNA genómico.

Los marcadores R1, CosA, GP179 y BA47f2 fueron amplificados en las siguientes concentraciones: buffer (44,64 mM KCl, 8,92 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl₂ y pH de 8,3) 0,17 mM dNTPs, 0,59 mM de cada primer, 0,004% BSA, 2,3 mM MgCl₂ y una unidad de Taq Polimerasa (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Las condiciones para la amplificación fueron: desnaturalización inicial por 2 min a 93°C, 40 ciclos de 45 s a 93°C, 45 s a 55°C, que correspondió a la temperatura de anillamiento, 90 s a 72°C, y un ciclo de extensión final por 10 min a 72°C.

La reacción de amplificación para el marcador Prp1 se realizó usando: buffer (64,5 mM KCl, 12,9 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl₂ y pH de 8,3); 0,26 mM dNTPs, 0,4 mM de cada primer, 0,004% BSA, 1,93 mM MgCl₂ y una unidad de Taq Polimerasa (Invitrogen Corporation).

Las condiciones para la PCR fueron: desnaturalización inicial por 2 min a 94°C, 40 ciclos de 45 s a 92°C, 45 s a 55°C, correspondiente a la temperatura de anillamiento, 45 s a 72°C, y un ciclo de extensión final por 8 min a 72°C.

Las mismas concentraciones de buffer, dNTP y BSA empleadas para la amplificación del marcador Prp1 se usaron para la reacción del marcador StAOS2. Para este marcador se emplearon 0,23 mM de cada primer, 1,43 mM de MgCl₂ y una unidad de Taq Polimerasa (Invitrogen Corporation).

El programa de amplificación seguido fue: desnaturalización inicial por 3 min a 95°C, 35 ciclos de 45 s a 92°C, 40 s a 59°C, 90 s a 72°C, y un ciclo para la extensión final de 10 min a 72°C.

La reacción para el marcador GP21 se realizó usando las mismas condiciones del marcador StAOS2, con excepción de la concentración de cada uno de los primers, la cual fue de 0,6 mM.

Las condiciones para la PCR fueron: desnaturalización inicial por 2 min a 93°C, 39 ciclos de 45 s a 93°C, 45 s a 55°C, 80 s a 72°C, y un ciclo de extensión final de 8 min a 72°C.

Para el CAPS, la secuencia amplificada se digirió de forma separada con las enzimas AluI y RsaI (BioLabs^®, Ipswich, MA). Las reacciones se llevaron a cabo usando 2 unidades de la enzima respectiva, 1X NE-buffer 4 (20 mM Tris-acetato, 50 mM potasio-acetato, 10 mM magnesio-acetate, 1 mM dithiothreitol y pH 7,9). La reacción de digestión se llevó a cabo a 37°C, durante 2 h, y posteriormente se elevó la temperatura a 67°C para inactivar las enzimas.

Los productos de amplificación se analizaron en geles de agarosa al 2% y se visualizaron empleando bromuro de etidio. Las imágenes se capturaron con el documentador de geles Molecular Imager^® Gel Doc^TM XR+ (Bio-Rad Laboratories, Philadelphia, PA). Los alelos obtenidos se compararon con los esperados y se analizó para cada material su presencia/ausencia y se correlacionaron con datos de evaluación fenotípica.

 

Resultados

Marcador Prp1: mostró alelos de tamaños de 250 pb, 550 pb y 850 pb. El alelo marcador Prp1₂₅₀ no estuvo presente en 14 de las 88 accesiones evaluadas (Fig. 2). La accesión número Col 74 únicamente mostró el alelo de 250 pb.

Marcador CosA: generó un fragmento monomórfico de aproximadamente 280 pb (Fig. 3). En las accesiones evaluadas no se presentó el alelo característico de CosA de 210 pb ligado con el gen R1. Fragmento que ha sido asociado con resistencia a P. infestans y madurez tardía en S. tuberosum (Gebhardt et al., 2004).

Marcador GP179: generó fragmentos monomórficos de 550 pb y 1200 pb para todas las accesiones evaluadas (Tab. 3).

Marcador GP21: es un marcador tipo CAPS (Claved Amplified Polymorphic Sequence). La restricción del producto de PCR se realizó con las enzimas AluI y RsaI. Se obtuvieron tres alelos de 1.400 pb, 900 pb y 500 pb con la enzima AluI, mientras que con la enzima RsaI se obtuvo un fragmento de 1.200 pb, y no se presentó polimorfismo (Tab. 3).

Marcador BA47f2: presentó fragmentos monomórficos de 180 pb, 400 pb y 500 pb. No se presentó el fragmento de tamaño esperado de 650 pb reportado para S. tuberosum (Tab. 3).

Gen marcador R1: la amplificación de este marcador generó algunos productos menores de diferentes tamaños junto con el principal producto, el fragmento de 1.400 pb, el cual se encontró en 17 de las accesiones evaluadas. Este fragmento correspondería a un fragmento característico del gen R1 de resistencia, la banda encontrada concuerda con el control positivo BA87d17BACR1 (donado por A. Ballvora) (Fig. 4).

Gen que codifica para Allene Oxide Sintasa 2 (StAOS2): se encuentra localizado en el cromosoma XI. Es un gen candidato para resistencia cuantitativa a P. infestans y a la bacteria Erwinia carotovora. El alelo de tamaño 679 pb fue ligado al incremento de resistencia. En este estudio se obtuvo un fragmento de 600 pb (Fig. 5).

Los marcadores evaluados, Prp1 y R1, presentaron polimorfismo. En el caso del marcador R1, se presentó polimorfismo para diferentes alelos, los cuales fueron designados de acuerdo con el tamaño del fragmento obtenido, así: R1₁₇₅₀, R1₁₅₀₀, R1₁₄₀₀, R1₁₂₀₀, R1₆₀₀, R1₃₀₀, y R1₂₂₀ (Tab. 3).

 

Discusión

No se encontró polimorfismo para los marcadores CosA, GP179, GP21 y BA47f2, lo que puede ser debido al fondo genético diferente de S. phureja y a que estos marcadores fueron diseñados para cultivares modernos de S. tuberosum (Ghislain et al., 2001).

El marcador Prp1 mapea en el cromosoma IX; es un importante marcador para identificar resistencia debido a que la infección de papa producida por P. infestans da como resultado la activación de genes que codifican proteínas para señales de respuesta, tales como la proteína codificada por el gen Prp1-1, el cual codifica para una auxina sensible a glutatión-S-transferasa. En el caso de este gen, la acumulación de mRNA derivada de la familia de los genes Prp1 es selectivamente inducida por el ataque del patógeno y no en respuesta a estímulos abióticos, a diferencia de la mayoría de otros genes involucrados con señales de respuesta (Hahn y Strittmatter, 1994).

Los marcadores GP21 y GP179 se encuentran separados entre sí por una distancia de 3 cM (Gebhardt et al., 2004). Entre estos dos marcadores se encuentra el gen R1. El marcador GP179 generó dos fragmentos monomórficos de 550 pb y de 1.200 pb. Los fragmentos esperados para el marcador GP179 en S. tuberosum son de 500 pb y 570 pb, siendo polimórfico el de 570 pb correlacionado con el gen R1 (Gebhardt et al., 2004). En estudios previos realizados por Oberhagemann et al. (1999) y Mosquera (2007), quienes trabajaron con poblaciones experimentales contrastantes, los primeros autores entre especies silvestres, y el segundo con S. phureja, encontraron también tamaños de fragmentos diferentes a los reportados para S. tuberosum.

Estos resultados pueden significar que es muy diverso el germoplasma del Grupo Phureja, lo cual puede ser confirmado en el estudio realizado por Ghislain et al. (2006), en donde se emplearon marcadores nSSR (microsatélites nucleares) como indicadores de ploidía en especies diploides, empleando 128 accesiones de la especie S. phureja y revelando que 25 accesiones de las 128 eran triploides y tetraploides. Por otra parte, las diferencias en los fragmentos pueden ser debidas a que este marcador fue diseñado para S. tuberosum y no para S. phureja.

El marcador BA47f2 mapea en el intervalo genético GP21-GP179, en el cromosoma V (Rickert et al., 2003). El marcador BA47f2 se encuentra a una distancia genética de 0,1 cM del locus R1, correspondiendo a una distancia física de aproximadamente 300 Kb (Ballvora et al., 2002). El fragmento de 650 pb generado por el marcador BA47f2 en S. demisum fue asociado con incremento de resistencia a gota (Gebhardt et al., 2004). Los materiales genéticos analizados en el presente estudio no amplificaron el fragmento asociado con resistencia a gota. Es de señalar que este marcador también se presenta débil en S. tuberosum y algunas veces no amplifica el fragmento esperado.

El gen marcador R1 mapea en el cromosoma V; su amplificación mostró varios alelos polimórficos (Tab. 3). Es necesario evaluar su presencia/ausencia en contraste con evaluaciones fenotípicas de carácter cuantitativo para determinar si la presencia del alelo R1₁₄₀₀ se puede asociar con resistencia a gota, y también evaluar los otros alelos polimórficos para este marcador.

Se destaca en los resultados la presencia del alelo marcador R1₁₄₀₀, que corresponde con el control positivo para presencia del alelo R1, gen mayor que fue clonado y caracterizado, y que co-localiza con el QTL mayor y más estable mapeado para resistencia a gota (Ballvora et al., 2002; Bormann et al., 2004; Ballvora et al., 2007).

Un alelo ligado altamente con resistencia a gota y con madurez tardía en S. tuberosum es el alelo CosA₂₁₀, el cual mapea en el cromosoma V. Este alelo marcador está asociado con el gen de resistencia R1. CosA cosegrega con el gen R1, en materiales genéticos que derivan su resistencia de la especie silvestre S. demissum. También se ha encontrado el fragmento CosA en las especies S. dulcamara y S. microdontum (Gebhardt et al., 2004). Este alelo es informativo para identificar posible resistencia generada por el gen R1 (Bormann et al., 2004). En esta investigación no se encontró co-segregación del alelo marcador R1₁₄₀₀ con el alelo CosA₂₁₀; este resultado puede indicar que el fragmento encontrado en las 17 accesiones de S. phureja, corresponde a una secuencia homóloga a R1 o también puede ser debido al fondo genético diferente de S. phureja en comparación con la fuente original de S. demissum.

Díaz et al. (2003) caracterizaron genotípicamente plantas de S. tuberosum, con los marcadores R1 y R2, y emplearon como control negativo plantas de S. phureja en las cuales no encontraron presencia del alelo marcador para R1.

Es necesario conocer sobre la funcionalidad de R1₁₄₀₀ en cuanto a resistencia de tipo específica, para lo cual se adelantan los correspondientes experimentos, así como el análisis de secuencia del alelo encontrado para estas accesiones de S. phureja.

El gen que codifica para Allene Oxide Sintasa 2 (StAOS2) localiza en el cromosoma XI, y es el primer gen reportado que tiene control sobre resistencia cuantitativa a gota (Pajerowska et al., 2008; Pajerowska et al., 2009). Estos mismos autores, en estudios sobre variabilidad alélica, identificaron para el alelo de 679 pb SNP, que pudieron asociar con resistencia y susceptibilidad a los patógenos P. infestans y a la bacteria Erwinia carotovora. El presente estudio amplificó un alelo de 600 pb, el cual está siendo estudiado para relacionar posibles variantes alélicas con el carácter de resistencia.

Ñústez et al. (2008) reportaron las accesiones de S. phureja con alta resistencia y susceptibilidad a gota. Las accesiones susceptibles en campo fueron las identificadas como Col102, Col87 y Col62. Estas accesiones presentaron el alelo Prp1₂₅₀. Sin embargo, las accesiones Col101, Col96, Col61, Col41 y Col2, que fueron también reportadas por Ñústez et al. (2008) como susceptibles en campo, en este estudio no presentaron el alelo 250 pb. Por tanto, este alelo no se puede asociar con estos datos al carácter de susceptibilidad. Algunas accesiones susceptibles, como las Col87 y Col2, presentaron el alelo R1₁₄₀₀, el cual se encuentra asociado con resistencia en S. tuberosum. Según este resultado no es claro que el alelo R1₁₄₀₀ esté confiriendo resistencia. Es necesario hacer el estudio funcional para dicho fragmento y contrastar los resultados con evaluaciones fenotípicas de carácter cuantitativo que permitan correlacionar con mayor precisión los datos moleculares con los fenotípicos.

De acuerdo con Ñústez et al. (2008), las accesiones Col131, Col30, Col5 y Col3 presentaron resistencia en campo; sin embargo, en ellas no se presentó el alelo de 250 pb para el marcador Prp1, aunque sí se presentó el alelo de 1.400 pb en las accesiones Col131 y Col5 para el marcador R1.

La presencia del fragmento de 1.400 pb en 17 accesiones del Grupo Phureja de la colección de S. phureja se constituye en una posible y nueva evidencia de la presencia de genes mayores de resistencia en S. phureja. Mosquera (2007) reportó un QTL mayor mapeado en el cromosoma IV, y aunque no hay evidencia en dicho estudio de que el efecto del QTL sea debido a un gen mayor que co-localiza en el intervalo reportado, no se puede descartar la presencia de un gen de esta naturaleza. También Sliwka et al. (2006) reportaron inicialmente la presencia de un nuevo locus mayor que mapea en el cromosoma IX, Rpi-phu1, el que confiere resistencia a gota y proviene de S. phureja. Posteriormente, Sliwka et al. (2010) reportaron el primer gen mayor de resistencia a P. infestans en germoplasma de S. phureja Rpi-phu1, el cual está asociado al alelo marcador GP94₂₅₀. Se destaca que el gen Rpi-phu1, se ha introducido en los programas de mejoramiento, y el alelo marcador se está empleando en selección asistida para resistencia a gota.

Se recomienda hacer la caracterización fenotípica para el gen R1 para las accesiones que presentaron el alelo de 1.400 pb del gen R1, y profundizar en el análisis para determinar si se trata de un gen homólogo al gen R1 derivado de S. demisum. También se aconseja realizar evaluaciones fenotípicas de carácter cuantitativo para evaluar resistencia, que permitan hacer asociaciones precisas de los datos genotípicos con los datos fenotípicos.

Nuevos enfoques metodológicos se están usando para identificar genes que confieran resistencia a P. infestans evaluando diferentes materiales genéticos (Mirjam et al., 2010). Pese a todas estas investigaciones, aún es necesario continuar en la búsqueda de genes que confieran amplio espectro de resistencia para poder emplearlos en programas de mejoramiento genético.

La presente investigación es la primera que evalúa accesiones de la colección colombiana de S. phureja, con marcadores que han sido reportados como ligados o asociados a QTL y genes mayores de resistencia a P. infestans, como aproximación a un estudio de asociación genética conducente a identificar marcadores moleculares diagnóstico para resistencia a gota.

 

Agradecimientos

Al doctor Agim Ballvora, del Max Planck Institute, Colonia, por la donación del BA87d17BACR1, control positivo para el gen R1. Esta investigación está enmarcada dentro del proyecto "Identificación de marcadores moleculares asociados a resistencia a Phytophthora infestans mediante estudio de asociación rasgo-marcador en Solanum phureja (2008S72170-6187)". Los autores agradecen al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, Bogotá por la financiación.

 

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