Actividad antimicrobiana y cinética de fermentación de Weissella confusa contra Xanthomonas albilineans
Antimicrobial activity and fermentation kinetics of Weissella confusa against Xanthomonas albilineans
Palabras clave:
Bacterias acido lácticas, caña de azúcar, residuos de cosecha (es)Acid lactic bacteria, agricultural wastes, sugar cane. (en)
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Departamento de Ingeniería, Facultad de Ingeniería y Administración, Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira. Carrera 32 12 - 00 vía Candelaria. Autor para correspondencia: lserna@unal.edu.co
Se evaluó la actividad antimicrobiana de Weissella confusa, una bacteria ácido láctica, contra Xanthomonas albilineans, microrganismo productor de la escaldadura de la hoja en la caña de azúcar. Se midió la cinética de fermentación de la bacteria ácido láctica en sustrato comercial (MRS) y en residuos agrícolas de cosecha de caña de azúcar (RAC) provenientes de semilleros con 7 meses de edad. Se realizaron fermentaciones sumergidas a 32 °C, cada hora hasta 4 horas, a pH 6 y 100 r.p.m. de agitación. Cada hora se midieron la producción de biomasa, el consumo de sustrato y actividad antimicrobiana. Weissella confusa presentó actividad antimicrobiana contra la bacteria fitopatógena X. albilineans en ambos sustratos, los halos de inhibición presentaron diámetros de 18.94 y 16.77 mm, respectivamente. Weissella confusa, aunque no fue aislada de caña de azúcar, mostró excelente crecimiento en el sustrato RAC comparado con el sustrato comercial MRS; por tanto, puede ser un posible biocontrolador para la escaldadura de la hoja de caña de azúcar, no obstante, se deben evaluar sus mecanismos de acción e impactos biológico y económico en la producción de biomasa ácido láctica.
Palabras clave: Bacterias ácido lácticas, caña de azúcar, escaldadura de la hoja, residuos de cosecha.
The antimicrobial activity of Weissella confusa against Xanthomonas albilineans, microorganism that produces leaf scald in sugar cane, was evaluated. The fermentation kinetics of lactic acid bacteria in commercial substrate (MRS) and agricultural waste sugar cane harvest (RAC) was measured. Submerged fermentations were performed at 32 ° C for 4 hours, pH 6 and agitation of 100 rpm, and every hour the biomass production, substrate consumption and antimicrobial activity was measured. Weissella confusa showed antimicrobial activity against phytopathogenic bacteria X .albilineans in MRS and RAC as carbon sources, the inhibition halos diameters were 18.94 and 16.77 mm, respectively. Weissella confusa although not being isolated from sugar cane, showed excellent growth on the RAC substrate compared with the commercial substrate MRS. Therefore, it can be suggested W. confusa as a potential for biocontrol of leaf scald sugar cane, however, should be evaluated the mechanism of action and their biological and economic impacts. The RAC substrate becomes an economical alternative for the production of lactic acid biomass.
Key words: Acid lactic bacteria, agricultural wastes, sugar cane.
Xanthomonas albilineans es una bacteria patógena, flagelada, Gram negativa, G-, con capacidad para invadir el xilema del tejido vegetal y producir la fitotoxina albidicina. Esta bacteria bloquea la diferenciación de los cloroplastos y produce líneas blancas paralelas a la nervadura central de las hojas de la caña de azúcar, síntoma característico de la enfermedad "escaldadura de la hoja" (Hashimi y Birch, 2010). La enfermedad fue detectada por primera vez en 1911 en Australia y actualmente se encuentra difundida en Estados Unidos, México, Venezuela, Cuba, Honduras, y Colombia, entre otros (Contreras et al., 2004). La transmisión de X. albilineans ocurre sobre todo por las herramientas de corte y los equipos de riego (Blanco et al., 2010). Los métodos de control se basan principalmente en tratamientos térmicos y en el desarrollo de nuevas variedades de caña de azúcar (Victoria-Kafure y Guzmán, 1998; Huerta-Lara et al., 2003).
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son una alternativa posible para combatir la escaldadura de la hoja en caña de azúcar y han mostrado ser agentes antimicrobiales contra bacterias Gram positivas (G+) y Gram negativas (G-) así como contra algunos hongos. Jalali et al. (2012) probaron el efecto antagónico de especies de Lactobacillus contra X. campestris PTCC 1473, patógeno de cultivos como tomate y soya. Hamed et al. (2011) evaluaron in vivo la eficiencia de L. plantarum como tratamiento de control biológico contra Fusarium oxysporum en cultivos de tomate. El éxito de las BAL con efecto antimicrobial y antifúngico se debe principalmente a la producción de péptidos de síntesis ribosomal denominados bacteriocinas (González et al., 2003). Estas bacteriocinas son reguladas por el mecanismo de fluctuación de densidad celular quorum sensing, que consta de dos componentes principales: un péptido autoinductor, encargado de detectar la densidad celular a través de señales químicas, y un regulador de respuesta que sintetiza, transporta y regula la formación de bacteriocinas (Kleerebezem, 2004; Miller y Bassler, 2001).
Dentro del grupo de las BAL, el género Weissella ha sido identificado por su potencial como agente antimicrobial. Este género aprovecha la producción de Bacteriocin Like Inibitory Substances (BLIS, su sigla en inglés) que ha sido probado contra diferentes microrganismos, tanto Gram+ como Gram-, patógenos de plantas, animales y humanos entre ellos: Staphylococcus aureus, Streptococus agalactiae, Candida albicans, y Escherichia coli. (Espeche et al., 2009; Serna et al., 2010) Las BAL son microorganismos exigentes que requieren fuentes nutritivas complejas para su óptimo desarrollo (Savijoki et al., 2006). En la industria biotecnológica los sustratos para crecimiento microbiano representan, a menudo, la mayor parte de los costos de producción de biomasa y sus bioproductos (Kurbanoglu y Algur, 2002); entre ellos se encuentran las peptonas y otras fuentes de nitrógeno como el extracto de levadura (García et al., 2010).
El cultivo de la caña de azúcar produce residuos agrícolas de cosecha (RAC) con alto potencial de aprovechamiento como fuentes de sustrato. Según Serna y Rodríguez (2007) estos residuos tienen un contenido de agua aproximado de 75% y nutrientes como azúcares totales, nitrógeno, fósforo, potasio calcio y magnesio, elementos esenciales en los sustratos de fermentación para el crecimiento microbiano.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la cinética de la actividad antimicrobiana de W. confusa contra la bacteria fitopatógena X. albilineans y medir la cinética de consumo de sustrato y producción de biomasa cuando se utilizan el compuesto comercial (MRS) y residuos agrícolas de cosecha de caña de azúcar (RAC).
Aislamiento de Xanthomonas albilineans
El aislamiento de X. albilineans se hizo a partir de hojas y tallos de plantas de caña de azúcar variedad CC 85-92 de 5 meses de edad, recolectados en cultivos localizados en el Centro de Investigaciones de la Caña de A zúcar de Colombia ( Cenicaña). Estas muestras fueron transportadas a laboratorio y almacenadas en condiciones controladas de refrigeración.
Las muestras de hojas se lavaron con
una solución de hipoclorito de sodio al 2% y
agua destilada; a continuación fueron cortadas
en trozos de 1 cm2 y maceradas hasta
obtener un lixiviado para realizar diluciones
seriadas desde 100 hasta 10-6. Cada dilución
se sembró por agotamiento en placas de agar
nutritivo (Oxoid, Inglaterra) las cuales fueron
incubadas a 27 °C por 72 h. Las colonias
que presentaron las características morfológicas
típicas de X. albilineans (Cuadro 1)
fueron replicadas en el mismo medio hasta
obtener un cultivo puro. Las colonias presuntivas
de X. albilineans fueron sembradas
en medio, sólido empleando agar Wilbrink (5
g de bactopeptona, 10 g de sucrosa, 0.5 g de
K2HPO4.3H
Sustratos y condiciones de fermentación
Se utilizó una cepa de W. confusa crioconservada, obtenida en investigaciones de Serna et al. (2010). Esta cepa fue adaptada a cada uno de los sustratos (MRS y RAC) por tres generaciones utilizando 10% de inóculo con respecto al volumen de trabajo. Para la producción de W. confusa y medición de sus cinéticas de fermentación se realizaron seis fermentaciones en discontinuo, utilizando un sustrato comercial MRS (DeMan et al., 1960) y otro formulado con jugos de residuos agrícolas de cosecha de caña de azúcar (RAC). Los RAC provenían de semilleros con 7 meses de edad seleccionados como sustrato debido a que proveen una buena fuente de carbono, nitrógeno y vitaminas que contribuyen al crecimiento de las bacterias ácido lácticas, además pueden ser sustratos alternativos de bajo costo para la producción y comercialización del microorganismo (Godon et al., 1993; Brizuela, 1986). Con el fin de conseguir valores equivalentes de nitrógeno a los presentados en el sustrato comercial MRS, los RAC fueron suplementados con extracto de levadura. Los jugos provenientes de estos RAC se caracterizaron por su valor nutritivo mediante la determinación de elementos como nitrógeno total (Kjeldahl, 1883) y potasio, con uso de absorción atómica, y contenido de azúcares reductores mediante el método DNS (Ácido 3,5- dinitrosalicilico) (Miller, 1959). La fermentación se ajustó periódicamente a pH 6.0 utilizando una solución de NaOH 1M (Mol Labs® - Bogotá, Colombia).
Cinética de formación de biomasa, consumo de sustrato, producción de ácido láctico y rendimientos de biomasa
Para medir las cinéticas de formación de biomasa, el consumo de sustrato y la producción de ácido láctico se tomaron asépticamente muestras de 5 ml de fermentado de cada uno de los sustratos al comienzo (hora 0) y a 1, 2, 3 y 4 h de fermentación. Las muestras se centrifugaron a 5000 r.p.m. por 10 min a 4 °C (Eppendorf Centrifuge 5804R, Alemania) para separar la biomasa del sobrenadante.
La concentración de biomasa se estableció por peso seco (A.O.A.C, 1990). En el sobrenadante se determinó la concentración de azúcares reductores mediante la técnica de espectrofotometría ácido 3,5- dinitrosalicílico (Miller, 1959) (ThermoScientific Genesys 10UV, EE.UU.). La producción de ácido láctico se midió por reflectometría (Reflectoquant Merck - RQflex Plus 10, Alemania). El sobrenadante se filtró (0.45 µm) antes de la medición (Titan, EE. UU.).
Los parámetros cinéticos calculados fueron el rendimiento de biomasa (Yx/s) y el consumo de sustrato (CS) empleando las ecuaciones 1 y 2 siguientes, respectivamente.
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donde, SO es la concentración inicial de azúcares reductores (g/lt), S es la concentración final de azúcares reductores (g/lt), X0 es la concentración inicial de biomasa (g/lt), y X es la concentración final de biomasa (g/lt). Adicionalmente, se calculó la velocidad específica de crecimiento µ a partir de la pendiente de la fase exponencial de la curva de crecimiento de la BAL.
Cinética de la actividad antimicrobiana
Las pruebas de medición de la actividad antimicrobiana se realizaron al comienzo y a 1, 2, 3 y 4 h de fermentación en los sustratos descritos anteriormente. Para la medición se utilizó la metodología de difusión en agar descrita por Serna et al. (2010). Se utilizaron placas de agar nutritivo con 5 mm de espesor en las que se hicieron pozos centrales de 1.7 cm de diámetro con utilización de un sacabocado estéril. Las placas fueron sembradas masivamente utilizando 100 µl de suspensión de X. albilineans en una concentración de 1 x 108 UFC m/lt. De igual manera, se tomaron en forma aséptica círculos de agar MRS estéril de 5 mm de espesor y de 1.7 cm de diámetro que fueron depositados en los pozos centrales. Los círculos se inocularon con 60 µl de muestra del fermentado, tomado en cada sustrato los tiempos de fermentación. Las cajas se incubaron a 27 °C por 24 h y posteriormente se determinó la actividad antimicrobiana midiendo el diámetro de los halos de inhibición sobre el crecimiento del patógeno. Las pruebas de actividad antimicrobiana contra X. albilineans se realizaron por duplicado en cada uno de los tiempos de fermentación y para cada uno de los sustratos.
Análisis estadístico
Se utilizó un diseño unifactorial con tres repeticiones, usando como factor el tipo de sustrato con dos niveles, sustrato comercial MRS y RAC. Las variables de respuesta fueron la cinética de producción de biomasa, el consumo de sustrato y la actividad antimicrobiana. Las variables de respuesta se midieron al comienzo (tiempo 0) y a 1, 2, 3 y 4 h de fermentación. Se calculó, además, el rendimiento de biomasa (Yx/s) y la velocidad específica de crecimiento µ a partir de la pendiente de la curva de crecimiento en la etapa exponencial. Para el análisis de datos se utilizó el paquete estadístico SAS (SystemAnalysis Software) y la prueba estadística Tukey (P < 0.05) para la comparación de promedios.
En la Figura 1 se presentan la producción de biomasa y el consumo de W. confusa en los sustratos comerciales MRS y RAC. La producción de biomasa no presentó diferencias (P = 0.8882) entre los sustratos evaluados (Cuadro 2). En el sustrato RAC se produjo la mayor concentración de biomasa en la tercera y cuarta horas de fermentación, con concentraciones de 1.36 y 1.496 g/lt, respectivamente, mientras que en el sustrato comercial MRS se produjeron 1.17 y 1.38 g/lt de biomasa en los mismos tiempos de fermentación.
El consumo de sustrato presentó diferencias (P < 0.05) entre los sustratos y la interacción tiempo x sustrato. En el caldo MRS la tasa de consumo de sustrato fue lenta durante las primeras 3 horas de experimentación y se incrementó en la cuarta hora, con un consumo aproximado de 30% del contenido de azúcares. Por otra parte, en el RAC fue evidente un consumo de azúcares más acelerado al comienzo del proceso, con un consumo cercano de 45% del sustrato en la cuarta hora de fermentación. En el Cuadro 2 se incluyen los rendimientos de biomasa en relación con el sustrato (Yx/s)), siendo más altos en el sustrato MRS (0.15 g/g) cuando se comparan con los obtenidos en RAC (0.07 g/g). La velocidad específica de crecimiento µ fue más alta en el sustrato RAC (0.142/h) comparada con la del sustrato MRS (0.115/h). (Cuadro 3) Estos resultados indican que la concentración de biomasa fue igual en ambos sustratos; no obstante debido al mayor contenido de azúcares y al consumo más acelerado en RAC, la velocidad específica de crecimiento fue mayor, llegando a concentraciones de biomasa iguales a las obtenidas con el sustrato MRS al final de la fermentación. Lo anterior indica que el sustrato RAC puede ser una fuente de carbono competitiva para la producción de biomasa ácido láctica con potencial de uso como sustituto de los medios convencionales de crecimiento bacteriano.
Ossa et al. (2010) encontraron resultados similares a los del presente estudio cuando obtuvieron un aumento de la biomasa de L. plantarum al pasar de 10% para 30% p/v la concentración de azúcares. Serna y Rodríguez (2007) determinaron la producción de biomasa de Lactococcus lactis spp lactis, utilizando residuos de cosecha de caña de azúcar con concentraciones de azúcares de 90 y 60 g/lt, obteniendo producciones de biomasa de 2 y 1 g/lt, respectivamente (Serna y Naranjo, 2005).
En la Figura 2 se observa la actividad antimicrobiana de W. confusa contra X. albilineans en los sustratos utilizados. El análisis estadístico (Cuadro 2) indica que no existen diferencias entre sustratos (P = 0.1115). El mayor halo de inhibición se presentó en el sustrato comercial MRS con un diámetro de 18.94 mm a las 4 h de fermentación. En el sustrato RAC la mayor actividad antimicrobiana se presentó igualmente a las 4 h de fermentación, con un diámetro de 16.77 mm. Además, se observó que en el sustrato MRS la actividad antimicrobiana fue proporcional al tiempo de fermentación, cuando W. confusa alcanza su fase exponencial. Estos resultados evidencian que, W. confusa en medio MRS posee actividad antimicrobiana contra X. albilineans y que el efecto antagónico fue influenciado por el tiempo de fermentación en el sustrato comercial MRS, pero no en el sustrato RAC en el cual no se presentaron diferencias (P > 0.05) en fermentación entre la primera y la cuarta hora. Afdora et al. (2010) encontraron que durante la fase logarítmica se producen antibacterianos como ácido láctico y bacteriocinas, por tanto, durante ella se alcanza la concentración máxima de estos metabolitos.
En varias investigaciones se ha observado antagonismo del género Weissella contra varios tipos de microrganismos patógenos por medio de la producción de bacteriocinas; así, Pal y Ramana (2010) encontraron actividad antimicrobiana de una bacteriocina purificada de W. paramesenteroides contra varias bacterias G+ y G- como E. coli, P. aureginosa, Salmonella typhimurium y Vibrio parahaemolyticus. Chavasirikunton et al. (2006) revelaron antagonismo de la bacteriocina de W. confusa CP3-1 contra B. cereus. Srionnual et al. (2007) hallaron efecto inhibitorio de una bacteriocina producida por W. cibaria contra bacterias patógenas G+, y LeBlanc y Todorov (2011), obtuvieron actividad antimicrobiana de bacteriocinas de Weissella sp. contra varios microrganismos patógenos.
Algunos biotratamientos con base en bacteriocinas derivadas de bacterias ácido lácticas han sido probados para el tratamiento de microorganismos perjudiciales al hombre (Roldán et al., 2011; Estrada et al., 2005); no obstante, no existe información de bacterias ácido lácticas con actividad antimicrobiana contra microorganismos fitopatógenos. Hasta la fecha, el biocontrol de estos se hace por medio de bacterias G-, por ejemplo: Reinoso et al. (2006) y Reyes et al. (2011) encontraron que Basillus subtilis controla P. carotovorum y Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid causantes, respectivamente, de la pudrición blanda en la papa y la pudrición del maíz. Gluconacetobacter diazotrophicus posee actividad antimicrobiana contra X. albilineans (Piñon et al., 2002; Arencibia et al., 2006), por tanto, el presente trabajo abre un nuevo campo de investigación y aplicación para las bacterias ácido lácticas.
- Se encontró que W. confusa posee actividad antimicrobial contra X. albilineans, independiente del tipo de sustrato que se utilice, MRS o RAC.
- El sustrato de residuos del cultivo de caña de azúcar (RAC) demostró ser una buena fuente para el crecimiento para W. confusa comparado con el sustrato comercial MRS.
- El efecto de supresión de X. albilineans fue influenciado por el tiempo de incubación. En ambos tipos de sustrato la mayor concentración de biomasa ocurrió en la tercera y cuarta horas de fermentación.
- En el futuro, las investigaciones deben estar dirigidas hacia la evaluación de nuevas bacterias ácido lácticas contra fitopatógenos, estudios de los mecanismos de inhibición, desarrollo de metodologías para el control biológico de enfermedades en plantas y formulación de sustratos de crecimientos de bajo costo.
Al Centro de Investigaciones de la Caña de Azúcar de Colombia (Cenicaña) y al Ingenio Manuelita por el apoyo logístico brindado para esta investigación. Al Programa Virginia Gutiérrez por el apoyo a uno de los jóvenes investigadores.
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