Acta Biológica Colombiana

INTRODUCCIÓN

Los organismos vivos se diferencian de la materia inerte por la naturaleza química de sus componentes, que reciben el nombre de bio-moléculas. Entre ellas se encuentran cuatro grupos principales: los carbohidratos, los lípidos, los ácidos nucleicos y las proteínas. La maquinaria molecular que permite el funcionamiento celular esta formada, principalmente por proteínas (Watson et al., 2004). Las proteínas son esenciales y participan en cada uno de los procesos celulares y son elementos clave para los mecanismos de la replicación, transcripción y traducción del ADN, así como del proceso de división celular. Muchos procesos fisiológicos, incluidos las respuestas de los organismos a los diferentes estreses bióticos y abióticos, implican cascadas de señalización en la cual intervienen un amplio grupo de moléculas tales como hormonas, pequeños ARN no codificantes, segundos mensajeros como el calcio o el óxido nítrico u otras moléculas de bajo peso molecular, especies de oxígeno reactivas, etc. (Struk et al., 2019). La acción cooperativa y concertada de este conjunto de moléculas con las proteínas logra activar y regular los mecanismos implicados durante el crecimiento, desarrollo, diferenciación y adaptación de los seres vivos (Ben Rejebet al., 2014).

La complejidad biológica se deriva de un proceso combinatorio de interacciones entre las diferentes bio- moléculas, destacándose en particular la que se lleva a cabo entre proteínas (Watson et al., 2004). Aunque existen casos es que las proteínas pueden cumplir sus funciones de manera independiente, la mayoría de las veces cumplen sus tareas biológicas a través de la interacción con otras proteínas (Alberts, 1998). Para comprender a cabalidad la función de una proteína determinada, la información sobre su actividad bioquímica, su localización celular y abundancia debe ser complementada con el conocimiento de las proteínas que interactúan con ella. Incluso, para el caso de proteínas de función desconocida, la identificación de sus interactores puede ayudar a predecir su función (Lalonde et al., 2008). Las interacciones entre proteínas están determinadas por parámetros cinéticos y termodinámicos, los cuales definen interacciones de alta afinidad y que presentan alta estabilidad, mientras que otras proteínas interactúan de manera dinámica y se caracterizan por uniones de baja afinidad (Lalonde et al., 2008). La comprensión de las redes de interacciones proteicas es fundamental para entender, no solo su función, sino también a nivel más amplio, los procesos celulares básicos y las respuestas complejas a nivel del organismo (Lampugnani et al., 2018).

Uno de los casos particulares en las cuales sobresale la función e importancia que tiene la interacción entre proteínas es la que se establece durante la relación que presentan las plantas con los microorganismos que las rodean. Este tipo de relación se puede considerar como un diálogo molecular que depende de las interacciones que se establezcan entre las proteínas presentes en unos y otros (Yuan et al., 2021). Dependiendo de ello se establecerá la posibilidad o no, de activar una respuesta de inmunidad, que será efectiva o no para contener la proliferación del microorganismo.

Teniendo en cuenta la importancia que representa el conocimiento sobre las interacciones proteicas, son varias las estrategias que existen al día de hoy para su estudio. Estas involucran desde técnicas clásicas, hasta otras que implican los desarrollos de las ciencias ómicas y aproximaciones bioinformáticas y computacionales (Lalonde et al., 2008); (Lampugnani et al., 2018); (Struk et al., 2018).

En esta revisión se abordarán las principales metodologías para el estudio de las interacciones proteína – proteína tanto a escala individual como global, terminando con la presentación del caso de la relación que establecen plantas y microorganismos, y como en la base de esta relación subyacen las interacciones entre proteínas.

DOBLE HÍBRIDO DE LEVADURAS

El sistema de doble híbrido de levaduras se basa en la naturaleza modular que presentan los factores de transcripción (FT) eucariotas (Paiano et al., 2019). Los FT poseen dos dominios funcional y estructuralmente bien diferenciados. El dominio de unión al ADN (del inglés Binding Domain, BD) se caracteriza por presentar una conformación estructural característica y puede ser agrupados en diferentes tipos como dedos de zinc, cremalleras de leucina u homeodominio (Watson et al., 2004). El dominio de activación de la transcripción (del inglés Activation Domain, AD) no siempre poseen una conformación tridimensional definida y se agrupan teniendo en cuenta el contenido de aminoácidos (Watson et al., 2004). Si estos dos dominios interactúan físicamente pueden reconstituir un FT funcional, permitiendo la expresión del (los) gene(s) que se encuentra(n) bajo su control (Paiano et al., 2019). El BD corresponde a la parte de la proteína encargada de unirse a los elementos del promotor del gen blanco o UAS (del inglés Upstream Activation Sequences). Por otro lado, el AD se encarga de interactuar con la maquinaria de transcripción y así regular la producción de moléculas de ARNm (Lampugnani et al., 2018).

El mecanismo de acción modular de los FT permite construir plásmidos, en los cuales la secuencia codificante de cada uno de estos dos dominios es clonada de manera independiente (Fig. 1). En estos plásmidos se insertan cada una de las regiones codificantes de las proteínas bajo estudio (Finley y Mairiang, 2018). Así por ejemplo, si se quiere determinar si la proteína X interactúa con la proteína Y, la secuencia codificante de cada una de ellas se introduce de manera independiente, una en el plásmido que contiene el AD y la otra en el BD (Rodríguez-Negrete et al., 2014). Es importante tener en cuenta que la clonación debe hacerse manteniendo el marco de lectura de tal manera que se produzca una proteína fusión. Vale la pena considerar que el estudio se puede llevar a cabo no necesariamente con toda la proteína sino cubriendo regiones de ella o con aquellas porciones que representen dominios estructurales particulares (Finley y Mairiang, 2018). Una vez realizadas estas construcciones, se introducen los plásmidos en levaduras en donde ocurre el proceso de transcripción y traducción. Si las proteínas X y Y interactúan dentro de la misma levadura, se restablece la función del FT y se lleva a cabo la expresión de un gen reportero presente en el genoma de la levadura (Paiano et al., 2019) ( Fig. 1). Si, por el contrario, X no interactúa con Y, los dominios AD y BD no se encuentran físicamente cerca uno del otro y por lo tanto el FT no es reconstituido y no se expresa el gen reportero (Fig. 1). Como el experimento se realiza en levaduras e implica el uso de dos plásmidos, se le ha dado el nombre de ensayo de doble híbrido en levaduras (Y2H del inglés Yeast Two Hybrid).

El procedimiento para determinar si las proteínas X y Y interactúan inicia con la clonación de los genes que codifican para las proteínas X y Y en los plásmidos antes mencionados. Posteriormente cada uno de ellos es introducido en cepas de levadura particulares. Uno de ellos se introduce en una levadura tipo α mientras que el segundo plásmido se introduce en la levadura tipo β (Fig. 1) (Clontech, 2009). La introducción se puede hacer mediante electroporación o por transformación química (Rodríguez-Negrete et al., 2014). Para comprobar la presencia de los plásmidos de manera individual en cada tipo o cepa de levadura, estos plásmidos poseen genes marcadores que codifican para enzimas implicadas en el proceso de biosíntesis de algún aminoácido (Clontech, 2009). Para seleccionar aquellas levaduras que han recibido el plásmido, éstas se crecen en un medio que carece de los aminoácidos correspondientes. De esta forma solo las levaduras que reciben el plásmido que contiene el gen de biosíntesis del aminoácido que esta ausente en el medio, pueden crecer y formar colonias aisladas (Paiano et al., 2019).

Posteriormente, las levaduras a y β que contienen los dos plásmidos de manera individual se someten a un proceso de apareamiento, generando levaduras diploides (2n) de tipo a/β que portan los dos plásmidos (Clontech, 2009). Estas levaduras se crecen nuevamente en un medio que carece de los dos aminoácidos usados para selección, permitiendo corroborar la presencia de los dos plásmidos en la misma célula de levadura (Rodríguez-Negrete et al., 2014). Finalmente, para determinar la interacción de X y Y, generalmente el FT reconstituido permite la expresión de un par de genes adicionales que están involucrados en la biosíntesis de otro par de aminoácidos que no se encuentran presentes en el medio de crecimiento de las levaduras (Clontech, 2009). Si las levaduras crecen en este medio es porque las dos proteínas interactúan y reconstituyen el FT, permitiendo la expresión de los dos genes de biosíntesis de aminoácidos (Fig. 1). Sí por el contrario, las levaduras no son capaces de crecer en este medio carente de cuatro aminoácidos se concluye que no hay interacción (Rodríguez-Negrete et al., 2014). En ocasiones se emplea un gen reportero adicional no relacionado con la biosíntesis de aminoácidos. Se trata del gen reportero lacZ, el cual esta bajo el control de un promotor que es reconocido por el FT. De esta manera si hay interacción entre las proteínas X y Y las levaduras tendrán un color azul cuando se crecen en un medio que posee el sustrato X-gal, el cual es degradado por la enzima β-galactosidasa codificada por el gen lacZ (Xing et al., 2016).

Figura 1: Determinación de la posible interacción entre las proteínas X y Y empleando el sistema de doble híbrido de levaduras. Los genes que codifican para estas proteínas son clonados en plásmidos que contienen el BD y el AD respectivamente de un Factor de Transcripción (ver detalles en el texto).

El sistema de doble híbrido tal y como se ha descrito, permite contestar la pregunta ¿la proteína X interactúa con la proteína Y? En cuyo caso se conoce tanto la identidad (y secuencia) de las dos proteínas bajo estudio. Sin embargo, en ocasiones la pregunta biológica puede ser del tipo: conociendo la proteína X, ¿con quién interactúa? En este caso, también se puede emplear el sistema de Y2H. Para ello la secuencia que codifica para la proteína X se clona en uno de los plásmidos, puede ser el que contiene el AD, por ejemplo. En paralelo se construye una librería de ADNc en el segundo plásmido, en este caso el que contiene el BD (Xing et al., 2016) ( Fig. 2). De esta manera se puede realizar un tamizaje para determinar con cual de las proteínas codificadas por los ARNm presentes en la célula a partir del cual se realizó la librería de ADNc interactúa la proteína X. De esta manera se debe disponer de alguna información o premisa que permita establecer bajo que condiciones se debe extraer el ARN para construir la librería de ADNc y así aumentar la probabilidad de que el transcrito que codifica para la proteína interactuante este presente (Xing et al., 2016). En muchos casos es difícil asegurar esta situación y se puede recurrir a agrupar ARNs extraídos bajo diferentes condiciones o de diferentes tejidos. Como resultado se tiene un conjunto de levaduras cada una de las cuales contiene un plásmido en el cual se ha clonado un ARNm (ADNc) codificante para una proteína (Fig. 2). A este conjunto de levaduras (librería de ADNc en levadura), también por apareamiento se le incorpora el plásmido conteniendo el gen que codifica para la proteína X. Posteriormente estas levaduras se seleccionan en un medio que carece de los cuatro aminoácidos, tal como se describió anteriormente (Clontech, 2009). Solo las levaduras en las cuales se establece una interacción entre la proteína X y alguna de las codificadas por los ARNm presentes en la librería pueden crecer en el medio de selección (Fig. 2). Para identificar cuál es la proteína que interactúa, los plásmidos de estas levaduras se extraen, y empleando primers específicos del plásmido en el cual se ha clonado la librería de ADNc se puede secuenciar el inserto, determinando de esta manera cuál o cuáles son las proteínas que interactúan con X (Clontech, 2009).

Las grandes ventajas que ofrece el sistema Y2H es que es relativamente fácil de implementar en un laboratorio de biología molecular, los protocolos son sencillos y no requieren equipos costosos (Xing et al., 2016); (Lampugnani et al., 2018). Sin embargo, tiene limitaciones serías, siendo la más importante de ellas la necesidad de que las proteínas bajo estudio se localicen en el núcleo. Esto hace que por ejemplo proteínas de membranas no sean susceptibles de ser estudiadas por Y2H o que requieran ser modificadas para forzar su localización nuclear. Para resolver este tipo de dificultad se ha desarrollado el sistema de división de ubiquitina (“split ubiquitin”) en donde la interacción entre las dos proteínas de membrana reconstituye la ubiquitina, permitiendo la activación de una proteasa que libera un factor de transcripción (Struk et al., 2019). Otro caso lo constituyen las proteínas citoplasmáticas muy grandes que no pueden atravesar el poro nuclear y entonces tampoco son susceptibles de ser estudiadas bajo el Y2H. Aunque se puede trabajar con solo regiones o dominios de las proteínas es necesario asegurar que continúen siendo funcionales (Xing et al., 2016). Otra desventaja del sistema es que no permite identificar interacciones débiles o transitorias, así como tampoco permite la detección de los componentes dentro de un complejo multiproteico, aunque una nueva alternativa basada en Y2H ha sido recientemente desarrollada para superar esta ultima dificultad (Struk et al., 2019).

CO-IMMUNOPRECIPITACIÓN

La co-imunoprecipitación (Co-IP) es una metodología empleada en el estudio e identificación de interacciones proteicas que emplea anticuerpos dirigidos específicamente hacia la(s) proteína(s) de interés (Speth et al., 2014). En este caso se busca identificar ya sea si una proteína determinada interactúa con una proteína de interés o, alternativamente, saber cuales proteínas interactúan con dicha proteína.

Figura 2: Identificación de las proteínas que interactúan con la proteína X mediante análisis de doble híbrido. El gen que codifica para la proteína de interés se clona en uno de los plásmidos de doble híbrido, en este caso el BD (tal como se indicó en la Figura 1). En paralelo se construye una librería de ADNc a partir de ARNm extraído del tejido del organismo bajo estudio, en el vector que contiene el AD (ver detalles en el texto).

El experimento inicia con el lisado celular o con la mezcla de proteínas en la cual se presentan las interacciones proteicas nativas. Para mantener este tipo de interacciones es necesario estabilizar dichas interacciones, las cuales se pueden deshacer como consecuencia de la manipulación experimental (Barberini y Muschietti, 2017). La mezcla de proteínas es incubada con un primer anticuerpo dirigido hacia la proteína de interés. Posteriormente se realiza una centrifugación que va a precipitar el complejo del anticuerpo con la proteína objeto de estudio unida a todas las proteínas con quien interactúa. Las proteínas que no hagan parte de este complejo quedan en el sobrenadante, son lavadas y eliminadas mediante el empleo de detergentes adecuados y/o bajo condiciones de sales particulares (Xing et al., 2016). Posteriormente el precipitado es resuspendido y analizado de acuerdo a la pregunta que se tenga. Si el interés es saber si una proteína dada (Y en este caso) esta interactuando con la proteína de interés (X, por ejemplo), se realizará un western-blot empleando un anticuerpo que reconozca la proteína Y. Si se detecta una banda significa que al precipitar la proteína X con el anticuerpo anti-X se arrastró igualmente a la proteína Y, en consecuencia, se puede detectar en el western-blot con un anticuerpo anti-Y. Si el western-blot no muestra la presencia de la banda empleando el anticuerpo anti-Y significa que X y Y no interactúan (Barberini y Muschietti, 2017). Es necesario para todos estos casos incluir los adecuados controles negativos en los que se observe la correcta precipitación de la proteína y la presencia de las dos proteínas en los extractos celulares (Lampugnani et al., 2018).

Alternativamente se puede querer determinar la identidad de las proteínas que interactúan con X (Struk et al., 2019). Es decir, no se tiene información o sospecha de las proteínas con que X interactúa y en consecuencia no se pueden desarrollar anticuerpos dirigidos hacia dichas proteínas que se desconocen. En este caso se realiza de igual manera la precipitación de X con el anticuerpo especifico y el precipitado se analiza mediante estrategias de proteómica (Struk et al., 2019). Las proteínas precipitadas se digieren con tripsina y los productos son analizados mediante HPLC-acoplada a espectrometría de masas. El perfil espectrométrico permite determinar la secuencia parcial de la proteína identificando así la identidad de la proteína que interactúa con X (Kaboord y Per, 2008).

En muchos casos resulta difícil, laborioso y costoso disponer de anticuerpos monoclonales específicos para las proteínas que se quieren estudiar. Una vía para superar esta dificultad es desarrollar proteínas fusión que contengan etiquetas para las cuales ya se han desarrollado anticuerpos, y están disponibles comercialmente (Struk et al., 2019). Así, si por ejemplo se quiere evitar desarrollar anticuerpos específicos contra la proteína X, la secuencia codificante para esta proteína se clona en un plásmido que contenga la secuencia de la etiqueta (Struk et al., 2019). De tal manera que al producirse la proteína X esta llevará una pequeña porción de aminoácidos que serán reconocidos por un anticuerpo específico comercial (Barberini y Muschietti, 2017). Existen diferentes etiquetas para las cuales se han generado anticuerpos específicos, las más empleadas son HA (hemaglutinina), Myc, FLAG, His (cola de seis histidinas). De igual manera se pueden emplear las secuencias de marcaje fluorescente para las cuales también existen anticuerpos comerciales (Barberini y Muschietti, 2017). En este último caso las proteínas con etiquetas que permitan visualizar la proteína en la célula pueden ser utilizada en experimentos de Co-IP, ya que esas etiquetas permiten su detección con anticuerpos comerciales. En el caso de utilizar las proteínas, etiquetadas es necesario que las células las expresen, por lo cual las construcciones se realizan en plásmidos binarios que son introducidos en Agrobacterium y se llevan a cabo experimentos de expresión transitoria en hojas de tabaco (Lampugnani et al., 2018); (Struk et al., 2019) ( Fig. 3). De esta manera se emplea un sistema que recrea las condiciones más naturales posibles en donde se pueden llevar a cabo los procesos de modificaciones, localización, direccionamiento de las proteínas, así como se encuentran en el contexto celular en donde se encuentran los componentes requeridos para que se de la interacción (Struk et al., 2019). En este caso, transcurridas 48 horas de infiltración las hojas son colectadas y las proteínas extraídas para ser analizadas. En el caso que se quiera determinar si la proteína X interactúa con Y, cada una de ellas debe ser etiquetada de manera diferente. La construcción de X con una etiqueta, y la de Y con otra etiqueta, se transforman de manera independiente en Agrobacterium y pueden ser ya sea co-infiltradas de manera simultánea, o una posterior a la otra (Barberini y Muschietti, 2017). Para la precipitación se puede emplear el anticuerpo dirigido contra la etiqueta presente en la proteína X y para determinar la presencia de Y en el precipitado se emplea el anticuerpo dirigido contra la etiqueta que marca a la proteína Y, siendo visualizado de igual manera mediante un western-blot (Xing et al., 2016) ( Fig. 3).

En algunos casos no es posible utilizar un sistema heterólogo de expresión transitoria como el de tabaco, ya que las respuestas o fenotipos observados no corresponden con lo que se espera según la especie bajo estudio (Struk et al., 2019). En estos casos es necesario, o bien utilizar anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína que se quiere estudiar como se describió previamente, o alternativamente, generar plantas transgénicas que expresen de manera estable la construcción que contiene la proteína con la etiqueta (Struk et al., 2019).

Como se mencionó anteriormente, la gran ventaja de la Co-IP es que recrea las condiciones naturales de la célula en donde ocurre la interacción, sin embargo, esta técnica no solo permite dar información acerca de la interacción directa de las proteínas, sino que demuestra que ellas hacen parte de un complejo molecular. Adicionalmente, esta técnica solo permite confirmar interacciones estables y fuertes (Xing et al., 2016).

GST-PULL DOWN

Una variación a la técnica de Co-IP consiste en realizar el estudio de interacción en células de Escherichia coli, por ejemplo, que son fácilmente cultivables y manipulables. En este caso se trata de una purificación por afinidad, en la cual la proteína conocida es marcada con Glutatión-S-Transferasa (GST) el cual tiene alta afinidad por el Glutatión (GSH) Sepharose, la cual es una resina ampliamente empleada en cromatografía (Kim y Hakoshima, 2019). De esta manera el complejo de la proteína marcada con GST unida a sus proteínas interactuantes es capturado sobre las perlas que están inmovilizadas en el gluatatión. Una vez realizados los lavados correspondientes y la liberación de las proteínas de las esferas de glutatión las proteínas son analizadas por western-blot, el cual permite identificar la proteína marcada con GST como las proteínas con que interactúan si son conocidas (Struk et al., 2019). Si las proteínas interactuantes son desconocidas, se pueden realizar análisis de proteómica como los descritos en la sección de Co-IP. Dentro de las ventajas que caracterizan a esta técnica es que no requiere un equipo especializado y es relativamente fácil de estandarizar. Sin embargo, las interacciones débiles o transitorias no siempre pueden ser detectadas, y se requiere tener a disposición los anticuerpos adecuados (Lampugnani et al., 2018).

Figura 3: Determinación de la posible interacción entre las proteínas X y Y mediante Co-IP. Los genes que codifican para las proteínas X y Y son clonados en fusión con los epitopes para HA y FLAG respectivamente. A. Si las proteínas X y Y interactúan se debe detectar la presencia de la proteína marcada con a -FLAG. B. En el caso que las proteínas X y Y no interactúan se debe visualizar banda con a-HA pero no con a -FLAG (ver detalles en el texto).

CO-LOCALIZACIÓN

La co-localización es otra estrategia que permite considerar la mayor o menor probabilidad que tienen dos proteínas de interactuar. Es importante resaltar que si bien no permite demostrar una interacción física directa entre ellas dos, el hecho de que las dos proteínas se encuentren localizadas celularmente en el mismo compartimiento puede indicar una posible interacción. En este caso particular se deben generar proteínas fusión que permitan visualizar en que lugar de las células se ubican las proteínas. La manera de observar in vivo las proteínas dentro de la célula es utilizando marcajes con proteínas que a cierta longitud de onda emiten fluorescencia (Bolte y Cordelières, 2006). La primera proteína fluorescente identificada fue aquella que produce la medusa Aequorea victoria, la cual tiene un pico de excitación a 395nm dando una coloración verde brillante, por lo cual se ha denominado proteína verde fluorescente (GFP, del inglés Green Fluorescent Protein) (Chalfie, 1995). A partir de la identificación del gen responsable, se han desarrollado mutaciones que han permitido generar variantes de las proteínas que producen proteínas de colores como la EBFP (azul), ECFP (cian) y la YFP (amarillo) (Shaner et al., 2007). El procedimiento en este caso consiste en clonar en un plásmido el gen de interés justo al inicio o al final de la secuencia codificante correspondiente a alguna de las proteínas fluorescentes. De esta manera al expresarse dentro de las células vegetales se produce una proteína fusión la cual está marcada con fluorescencia ya sea en su extremo amino- o carboxi- terminal (Fig. 4). La orientación de esta etiqueta o marcaje es un factor importante para considerar ya que éste puede enmascarar algún péptido señal o superficies de interacción presentes en la proteína impidiendo la identificación de la correcta localización y/o la interacción con otras proteínas. La predicción bioinformática de la topología y la presencia de péptidos señal puede ayudar a tomar decisiones respecto a la posición del marcaje o etiqueta (Xing et al., 2016). El siguiente paso es introducir dicha construcción en las células vegetales. Para ello generalmente se emplea el sistema de expresión transitoria en tabaco. En este caso se emplea un plásmido binario el cual contiene la secuencia codificante de la proteína de interés fusionada a la secuencia de la proteína fluorescente en el ADN-T. Este plásmido binario se introduce en Agrobacterium y mediante infiltración en hojas de tabaco, el ADN-T es transferido y expresado de manera temporal. Generalmente 48 horas post-infiltración se toman las hojas para ser evaluadas mediante microscopia de fluorescencia (Xing et al., 2016). Para determinar la localización celular, ya sea en el núcleo, mitocondria, cloroplasto, o membrana, por ejemplo, se emplean proteínas marcadas a las que ya se conoce su localización celular. Usualmente la proteína de interés se marca con una fluorescencia, por ejemplo, verde, y la proteína marcadora con otra, amarillo, por ejemplo. De esta manera se pueden sobrelapar las dos imágenes y determinar si colocalizan por el color que emite (Zhong et al., 2017).

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN BIOMOLECULAR DE LA FLUORESCENCIA (BIFC)

Esta es una de las técnicas que mayor aceptación experimental ha logrado en las últimas dos décadas (Kodama y Hu, 2012); (Struk et al., 2019). Este ensayo se basa en la complementación estructural que se puede dar entre los extremos no fluorescentes N- y C- terminal de una proteína fluorescente (Xing et al., 2016); (Struk et al., 2019). La base de BiFC es similar a la del funcionamiento de los FT descritos en el ensayo de doble híbrido. En este caso se ha demostrado que las proteínas fluorescentes pueden ser divididas y los dos fragmentos, que no son fluorescentes, son fusionados a las dos proteínas de interés para las cuales se sospecha que hay interacción (Xing et al., 2016); (Struk et al., 2019). Si las proteínas de interés interactúan, los extremos N- y C- terminal de la proteína fluorescente se encuentran en cercanía y se reconstituye una proteína fluorescente funcional, la cual puede ser detectada a través de un microscopio de fluorescencia (Kodama y Hu, 2012); (Xing et al., 2016); (Struk et al., 2019).

Figura 4: Determinación de la posible interacción entre las proteínas X y Y mediante co-localización celular. Los genes que codifican para las proteínas X y Y son clonados en fusión con las proteínas fluorescentes GFP y RFP respectivamente, en vectores binarios. A. Si las proteínas interactúan, al superponer las imágenes se observará una emisión de fluorescencia diferente. B. Si las proteínas no interactúan no se producirá un nuevo tipo de fluorescencia.

Experimentalmente, la manera de proceder es similar a la descrita en las secciones anteriores. Es decir, las secuencias codificantes de las proteínas de interés, X y Y por ejemplo, son clonadas en plásmido binarios que contienen las secuencias codificantes correspondientes al extremo N- y C- terminal de la proteína fluorescente (Walter et al., 2004); (Xing et al., 2016). Estos plásmidos son introducidos en Agrobacterium, ya sea mediante ensayos de expresión transitoria en tabaco o por transformación genética estable, se puede hacer el seguimiento de la interacción, exponiendo las hojas donde se ha hecho la agroinfiltración al microscopio de fluorescencia (Xing et al., 2016). Actualmente el número de proteínas fluorescentes disponibles para los ensayos de BiFC es bastante amplio, las cuales difieren en sus propiedades y espectro de fluorescencia, dentro de las cuales se destacan YFP, CFP, RFP (Xing et al., 2016). De manera similar a la Co-IP, en este tipo de técnica se recrean las condiciones celulares donde ocurren las interacciones siendo esta su principal ventaja. La principal desventaja es que en muchas ocasiones existe una tendencia a re-ensamblarse los dos fragmentos de la proteína fluorescente de manera espontánea generando falsos positivos (Xing et al., 2016).

TRANSMISIÓN DE ENERGÍA DE RESONANCIA O TRANSFERENCIA DE ENERGÍA DE RESONANCIA DE FÖRSTER (FRET)

El método FRET se basa en el mecanismo que describe la transferencia de energía entre dos cromóforos o moléculas que son sensibles a la luz dándole un color característico a la molécula (Förster, 2012). En varios casos los cromóforos pueden ser proteínas fluorescentes, pero esto no significa que la energía que se transfiere sea fluorescente. En esta aproximación se mide la relación de la fluorescencia entre la molécula aceptora y la donante. Para ello, en un canal se mide la ganancia en la intensidad de la fluorescencia en la molécula aceptora y en otro canal la pérdida de la intensidad de la molécula donante. Dentro de las moléculas aceptora/donante empleadas se encuentran la pareja CFP y YFP, las cuales se describieron en la sección de localización celular (Förster, 2012).

De manera similar a la descripción hecha en las secciones precedentes, el enfoque experimental consiste en clonar en un plásmido la región codificante de una de las proteínas de interés para que quede en fusión con la región codificante de una de las proteínas fluorescentes, ya sea la aceptora o la donante, por ejemplo, con CFP (Xing et al., 2016); (Struk et al., 2019). En otro de los plásmidos se clona la proteína con la cual se sospecha que interactúa X, por ejemplo Y. Este plásmido contiene la secuencia de la otra proteína donor o receptor según corresponda, por ejemplo, YFP (Struk et al., 2019). Estas dos construcciones se pueden emplear en ensayos de expresión transitoria o también para transformar de manera transitoria protoplastos de células vegetales (Xing et al., 2016). Posteriormente y pasadas unas 16 horas en los canales correspondientes a cada fluorocromo y empleando microscopia se evalúa la ganancia/perdida en la intensidad de la fluorescencia de cada molécula, determinando así la cercanía (< 10 nm) o no entre las dos proteínas bajo estudio (Förster, 2012).

Una de las grandes ventajas de esta técnica es que gracias a que se realiza in vivo permite un análisis cuantitativo real de lo que ocurre en células vivas. Ya que las proteínas se expresan bajo condiciones celulares, se establece un ambiente fisiológico adecuado en donde se encuentran las condiciones y otros cofactores que permiten la interacción entre las proteínas. Además de esto, el uso de microscopía confocal permite identificar la localización celular exacta de la proteína y del compartimento celular preciso donde ocurre la interacción. Sin embargo, este último aspecto también determina el punto débil de la técnica, ya que requiere el uso de un equipo robusto como es el microscopio confocal (Struk et al., 2019).

APLICACIONES DEL ESTUDIO DE INTERACCIONES PROTEICAS DURANTE LA RELACIÓN PLANTA-BACTERIA

CONCLUSIONES

Durante las décadas de los 80 y 90, gracias a los estudios de mapeo genético y mutagénesis, fue posible caracterizar las primeras proteínas R y efectoras de plantas y patógenos, respectivamente. Posteriormente el conocimiento se focalizó en comprender las funciones celulares que cumplían estas proteínas, para finalmente poder tener una representación de la manera en que se establece el diálogo molecular entre plantas y patógenos. Gracias al estudio profundo de las interacciones que establecen las proteínas efectoras con las proteínas de las plantas, se han establecido los modelos de trabajo más importantes que permiten comprender el funcionamiento, la dinámica y la evolución de los mecanismos moleculares implicados en la relación que establecen plantas y patógenos.