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Aislamiento e identificación de levaduras degradadoras de hidrocarburos aromáticos, presentes en tanques de gasolina de vehículos urbanos
Isolation and identification of aromatic hydrocarbon degrading yeasts present in gasoline tanks of urbans vehicles
DOI:
https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v19n2.70278Palabras clave:
Rhodotorula, Pichia anomala, naftaleno, fenantreno, pireno, tanques de combustible (es)Rhodotorula, Pichia anomala, naphthalene, phenanthrene, pyrene, fuel tanks (en)
Se obtuvieron aislamientos de levaduras a partir de muestreos en tanques de combustible de vehículos urbanos, con el objeto de evaluar su potencial actividad de degradación de hidrocarburos aromáticos derivados del petróleo. Se realizaron ensayos de crecimiento en medio mínimo mineral sólido utilizando distintos hidrocarburos (benceno, tolueno, naftaleno, fenantreno, y pireno). Los aislamientos que presentaron crecimiento notorio en alguno de los hidrocarburos aromáticos policíclicos fueron identificados mediante secuenciación Sanger de los marcadores moleculares ITS1 e ITS2 del ARNr. Se obtuvieron 16 aislados de levaduras, de las cuales tres presentaron crecimiento conspicuo con hidrocarburos aromáticos como única fuente de carbono. Las cepas identificadas pertenecen al género Rhodotorula y corresponden a las especies Rhodotorula calyptogenae (99,8% de identidad) y Rhodotorula dairenensis (99,8% de identidad). Dichas cepas presentaron crecimiento en benceno, tolueno, naftaleno, fenantreno. En este estudio se reporta por primera vez la presencia de levaduras del género Rhodotorula que habitan los ductos y tanques de gasolina de vehículos urbanos, así como su capacidad para utilizar distintos hidrocarburos aromáticos que son contaminantes para el medio ambiente. Estos resultados sugieren que dichas levaduras constituyen potenciales candidatos para la degradación de éstos compuestos, como parte de estrategias de biorremediación.
Yeast isolates were obtained from fuel tanks of vehicles in order to assess their potential use in the degradation of aromatic hydrocarbons. Growth assays were performed in minimum mineral medium using different aromatic hydrocarbons (benzene, toluene, naphthalene, phenanthrene, and pyrene) as the sole carbon source. Isolates that showed growth in any of the tested polycyclic aromatic hydrocarbons were identified by Sanger sequencing of the ITS1 and ITS2 rDNA molecular markers. A total of 16 yeasts strains were isolated, and three showed remarkable growth in media with aromatic hydrocarbons as the sole carbon source. These strains belong to the genus Rhodotorula, and correspond to the species Rhodotorula calyptogenae (99,8% identity) and Rhodotorula dairenensis (99,8% identity). These strains grew in benzene, toluene, naphthalene, phenanthrene and pyrene. This study demonstrates for the first time that yeasts of the genus Rhodotorula inhabit pipelines and fuel tanks of vehicles and that remove aromatic hydrocarbons that are environmental pollutants. Our results suggest that these yeasts are potential candidates for aromatic hydrocarbon degradation as part of bioremediation strategies.
Recibido: 18 de mayo de 2017; Aceptado: 27 de noviembre de 2017
RESUMEN
Se obtuvieron aislamientos de levaduras a partir de muéstreos en tanques de combustible de vehículos urbanos, con el objeto de evaluar su potencial actividad de degradación de hidrocarburos aromáticos derivados del petróleo. Se realizaron ensayos de crecimiento en medio mínimo mineral sólido utilizando distintos hidrocarburos (benceno, tolueno, naftaleno, fenantreno, y pireno). Los aislamientos que presentaron crecimiento notorio en alguno de los hidrocarburos aromáticos policíclicos fueron identificados mediante secuenciación Sanger de los marcadores moleculares ITS1 e ITS2 del ARNr. Se obtuvieron 16 aislados de levaduras, de las cuales tres presentaron crecimiento conspicuo con hidrocarburos aromáticos como única fuente de carbono. Las cepas identificadas pertenecen al género Rhodotorula y corresponden a las especies Rhodotorula calyptogenae (99,8% de identidad) y Rhodotorula dairenensis (99,8% de identidad). Dichas cepas presentaron crecimiento en benceno, tolueno, naftaleno, fenantreno. En este estudio se reporta por primera vez la presencia de levaduras del género Rhodotorula que habitan los ductos y tanques de gasolina de vehículos urbanos, así como su capacidad para utilizar distintos hidrocarburos aromáticos que son contaminantes para el medio ambiente. Estos resultados sugieren que dichas levaduras constituyen potenciales candidatos para la degradación de éstos compuestos, como parte de estrategias de biorremediación.
Palabras clave:
Rhodotorula, Pichia anomala, naftaleno, fenantreno, pireno, tanques de combustible.ABSTRACT
Yeast isolates were obtained from fuel tanks of vehicles in order to assess their potential use in the degradation of aromatic hydrocarbons. Growth assays were performed in minimum mineral medium using different aromatic hydrocarbons (benzene, toluene, naphthalene, phenanthrene, and pyrene) as the sole carbon source. Isolates that showed growth in any of the tested polycyclic aromatic hydrocarbons were identified by Sanger sequencing of the ITS1 and ITS2 rDNA molecular markers. A total of 16 yeasts strains were isolated, and three showed remarkable growth in media with aromatic hydrocarbons as the sole carbon source. These strains belong to the genus Rhodotorula, and correspond to the species Rhodotorula calyp-togenae (99,8% identity) and Rhodotorula dairenensis (99,8% identity). These strains grew in benzene, toluene, naphthalene, phenanthrene and pyrene. This study demonstrates for the first time that yeasts of the genus Rhodotorula inhabit pipelines and fuel tanks of vehicles and that remove aromatic hydrocarbons that are environmental pollutants. Our results suggest that these yeasts are potential candidates for aromatic hydrocarbon degradation as part of bioremediation strategies.
Key words:
Rhodotorula, Pichia anomala, naphthalene, phenanthrene, pyrene, fuel tanks.INTRODUCCIÓN
La contaminación ambiental por hidrocarburos derivados del petróleo se ha incrementado debido a su uso como combustible para vehículos, petroquímicos, plaguicidas y herbicidas, entre otros, dada la creciente demanda de la población mundial, la industrialización y la urbanización (Daverey & Pakshirajan, 2011). Algunos de estos hidrocarburos resultan ser contaminantes ya que se acumulan en los organismos vivos y pueden tener efectos carcinogénicos, además de permanecer en el agua y el suelo (Maliyekkal et al., 2004), aumentando el riesgo de contaminación ambiental (Goulart et al., 2014). En este sentido, es necesaria la búsqueda de alternativas para degradar estos compuestos mediante el desarrollo de estrategias como la biodegradación microbiana, mediante la cual se aprovecha la capacidad de los microorganismos para transformar compuestos contaminantes en otros menos tóxicos (Daverey & Pakshirajan, 2011), como dióxido de carbono y agua, a través de procesos de oxidación bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas (Goulart et al., 2014). En este sentido, se han identificado y caracterizado bacterias, hongos filamentosos y levaduras, para su uso en ambientes contaminados por hidrocarburos a niveles acuático y terrestre (Priya et al., 2016; Fan et al., 2014; Aydin et al., 2017; Ghazali et al., 2004; dell'Abate et al., 2006). Estos microorganismos tienen la capacidad de transformar mediante complejas estrategias metabólicas sustancias contaminantes como hidrocarburos, cuya presencia, en un ambiente con disponibilidad de agua y minerales, les provee un entorno que permite su desarrollo y crecimiento. Según Prince (2010), más de 1 50 géneros de bacterias contienen especies capaces de crecer con hidrocarburos como única fuente de carbono y energía, pero sólo unos pocos hongos y algas han sido estudiados (Markovetz et al., 1968; Walker et al., 1975;
Prenafeta-Boldú et al., 2001; Arriaga & Revah, 2005; Yemashova et al., 2007; Cerniglia y Sutherland, 2010). Sin embargo, se ha descubierto que ciertos hongos filamentosos poseen mecanismos para biodegradar estos compuestos, particularmente hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH por sus siglas en inglés) (Cerniglia & Sutherlan, 2010). En cuanto a las levaduras, hay pocos estudios al respecto, por lo cual, existe un interés reciente en profundizar sobre su capacidad para degradar componentes derivados del petróleo (Chen et al., 2002; Awe et al., 2008; Chrzanowski et al., 2008; Segura et al., 2008). Se ha probado que las levaduras pueden facilitar la degradación de hidrocarburos por parte de otros grupos microbianos, jugando así un rol importante en estos procesos (Hughes & Bridge, 2010), y así mismo, los hongos filamentosos y las levaduras poseen mejor capacidad de degradación en condiciones que favorecen su crecimiento, en comparación con las bacterias (Singh, 2006). Autores como Ahearn et al. (1971), han destacado la importancia de las levaduras en procesos de degradación in situ en ambientes marinos, por las ventajas que este grupo posee, tal como una mayor resistencia de las células vegetativas en condiciones de estrés, luz UV y salinidad, pH bajos y menor humedad o actividad de agua (Prenafeta-Boldu et al., 2001). En este sentido, se han caracterizado levaduras cuya capacidad degradadora de hidrocarburos alifáticos y aromáticos, así como mezclas complejas de éstos como el diesel (Chandran & Das, 2011), llama la atención. Estas en su mayoría constituyen parte de la microbiota autóctona de ambientes contaminados por crudo u otros hidrocarburos (suelos, tanques de almacenamiento de diésel, cuerpos de agua), donde se han identificado géneros como Candida, Pichia, Cryp-tococcus, Yarrowia (Hassanshahian et al., 2012), Meyerozyma, Rhodotorula, Wickerhamia y Rho-dosporidium (Goulart et al., 2014). Por otra parte, en cuanto a la presencia de microorganismos en tanques de combustible, se han reportado comúnmente casos de contaminación microbiológica en la industria aeronáutica y naval (Swift, 1988; Neihof, 1988; Yemashova et al., 2007). Los tanques resultan ser espacios que propician el crecimiento y reproducción de las células, al proveer una fuente constante de carbono (combustible), así como cierta humedad, lo que permite el desarrollo de biopelículas (Onuorah et al., 2015) que se acumulan en las paredes, fondo y ductos de entrada al tanque (Shennan, 1988). Algunos de los microorganismos más comúnmente encontrados en tanques de combustible de aviones pertenecen a bacterias de los géneros Bacillus y Pseudomonas, al igual que reductoras de sulfatos. En cuanto a los hongos, comúnmente se reportan a los géneros Penicilium, Cephalospo-rium y en particular, Hormoconis resinae y As-pergillus fumigatus (Itah et al., 2009). Adicionalmente, a pesar de que en su mayoría los aislamientos corresponden a hongos filamentosos, también se han reportado levaduras como Candida tropicalis (Onuorah et al., 2015), Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae (Itah et al., 2009) y Rhodotorula sp. (Rauch et al., 2006) entre otros. En tanques de gasolina de vehículos urbanos, los reportes de contaminación microbiana se concentran en el estudio realizado por Isola et al (2013) en el cual reportan la presencia de hongos del género Exophiala, pertenecientes al grupo llamado "Black fungi" o "Black yeast", conocidos por su alta resistencia a condiciones hostiles (Onofri et al., 2007) y por habitar ambientes inusuales (Zalar et al., 1999; Zhdanova et al., 2000; Sterflinger, 2005; Selbmann et al., 2008). En este estudio, se encontró que la aparición de estos microorganismos se daba principalmente en la parte exterior del ducto de ingreso del combustible hacia el tanque. Sin embargo, no existen otros reportes sobre la presencia de levaduras en dicho ambiente, por lo cual, el objetivo de este estudio fue aislar e identificar levaduras que habitan tanques de gasolina de vehículos urbanos, evaluando su potencial actividad de degradación de algunos hidrocarburos aromáticos derivados del petróleo, como parte de estrategias de biodegra-dación de estos compuestos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Toma de muestras y obtención de aislamientos
Se escogieron tres automóviles de antigüedad igual o mayor a 8 años, dado que el asentamiento de esporas en condiciones de baja humedad del tanque puede tomar un tiempo considerable, y teniendo en cuenta que ocurre únicamente durante los procesos de reabastecimiento de combustible (Isola et al., 2013). Para la toma de muestras del ducto y tanque de gasolina, se realizó un frotis de las paredes y/o del tubo de ingreso de la gasolina con hisopos de algodón estéril (uno por cada tanque), los cuales se introdujeron en tubos de ensayo con caldo nutritivo como medio de transporte. Las muestras fueron conservadas a 4°C hasta ser procesadas en el laboratorio. Para el cultivo de las levaduras, se tomó directamente una alícuota de 100 ML del caldo nutritivo que contenía el hisopo con la muestra, y se realizó una dilución seriada en solución salina de 10-1 a 10-3, sembrando alícuotas de 100 ML de la dilución de 10-3 en agar Sabouraud (SDA) (Oxoid, Inglaterra), suplementado con gasolina corriente al 1%. Esta se adicionó al medio después de que fue esterilizado, homogenizándola con éste en un vaso de precipitado con la ayuda de un agitador magnético, antes de servirlo en las cajas Petri, sin observar separación de la gasolina una vez se solidificó el agar. Para evitar el crecimiento de bacterias, se adicionó cloranfenicol al medio, en concentración de 0,2 g/ L. Las cajas Petri fueron puestas en incubación a 25 °C durante 10 días. Los cultivos que presentaron crecimiento de colonias de levaduras fueron sembrados en SDA, suplementado con gasolina corriente al 1% y cloranfe-nicol en la misma concentración. Se realizaron repiques de cada morfotipo obtenido, mediante la técnica de siembra por agotamiento en medio agar papa dextrosa (PDA) (Difco, EUA). Todos los aislamientos fueron nombrados con la letra del vehículo de donde fueron aislados, y otros caracteres alfanuméricos para su distinción. Se realizó observación microscópica de cada aislamiento mediante tinción con cristal violeta (Albor, Colombia).
Medio de cultivo y estandarización del inóculo.
Para evaluar el crecimiento de las levaduras en medios con hidrocarburos aromáticos, se empleó medio mínimo sólido con la siguiente composición: 1 g L -1 (NH4)2SO4, 0,8 g L -1 K2HPO4, 0,2 g L -1 KH2PO4, 0,2 g L -1 MgSO4-7H20. El medio se ajustó a pH 5.0, adicionando 250 ML de HCl 1 N y como agente solidificante se utilizó agarosa al 1%. Para estandarizar el inóculo a una densidad óptica (DO) determinada, se agregó una pequeña cantidad del aislamiento (equivalente a la punta de un asa microbiológica) en un tubo Eppendorf, adicionando 500 ML de buffer fosfato salino (PBS por sus siglas en inglés). Esto se colocó en pozos de mi-crotitulación, con el fin de realizar la medición de la densidad óptica, utilizando el espectrofotómetro TECAN Genios (TECAN US, Durham, NC).
Con las primeras mediciones, se realizó el ajuste haciendo una dilución del inóculo previamente medido, hasta que la densidad óptica se ajustara a 0.6 aproximadamente. Posteriormente, se realizaron tres lavados consecutivos de los inóculos con 500 ML de PBS en tubos Eppendorf, centrifugando a 8000 g durante 6 min, con el fin de eliminar cualquier traza de carbono del medio PDA en el que estaban las levaduras. El sobrenadante fue descartado, y el inóculo fue re suspendido en 500 ML de PBS para posterior siembra en el medio mínimo mineral.
Ensayos de crecimiento con hidrocarburos aromáticos.
Se realizaron ensayos de crecimiento de los aislamientos utilizando benceno y tolueno (Sigma, EUA), al ser éstos los hidrocarburos aromáticos más simples. Para ello, se siguió la metodología para ensayos con única fuente de carbono de Junca & Pieper, 2004, para lo cual se colocaron 50 ML del hidrocarburo en una punta de pipeteador estéril de 100 ML sellada, de tal manera que la fase de vapor pudiera ser aprovechada por las levaduras (figura 1). En cada caja de Petri, se sembraron tres micro gotas del inóculo estandarizado, e inmediatamente, se sellaron con papel Parafilm® y una película plástica para evitar al máximo la pérdida del vapor del hidrocarburo. Para evaluar el crecimiento de los aislamientos con hidrocarburos aromáticos policíclicos (naftaleno, fenantreno y pireno. Sigma, EUA), se realizó el mismo procedimiento descrito anteriormente, pero agregando 0,1 g del hidrocarburo en la tapa de la caja Petri. Los ensayos se dejaron en incubación de 10 a 15 días a 27°C. Simultáneamente, se sembraron inóculos estandarizados de los aislamientos en medio PDA con gasolina al 1%, con las mismas condiciones de incubación, con el fin de comparar el crecimiento en un medio rico en carbono. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Figura 1: Procedimiento para los ensayos de crecimiento con hidrocarburos aromáticos. A) Forma en que se agrega el h carburo en la punta sellada. B) Caja Petri con el aislamiento. C) Disposición de la punta con el hidrocarburo en la tapa ! caja Petri. D) Forma adecuada de cerrar la caja Petri con el hidrocarburo dentro de la punta.
Como control negativo del crecimiento con los hidrocarburos, se seleccionó la cepa Pichia pastoris CG512, proveniente del cepario de la Corporación CorpoGen (Bogotá, Colombia). Esta cepa se escogió debido a su incapacidad para crecer en los hidrocarburos estudiados. La cepa Pichia anomala CG649, proveniente del cepario de la Corporación CorpoGen (Bogotá, Colombia), fue utilizada como control positivo, por ser reportada previamente como degradadora de naftaleno y fenan-treno (Pan et al., 2004). Para la reactivación de estas cepas, se tomaron viales que estaban almacenados a -80° C, se sembraron por estriado en medio PDA con gasolina al 1% y se incubaron a 27°C de 24 a 48 horas. Todos los controles fueron sembrados simultáneamente en medio mínimo mineral con los distintos hidrocarburos a probar.
El crecimiento de los aislamientos con los hidrocarburos se evaluó cualitativamente, de acuerdo con los siguientes criterios:
Identificación molecular de los aislamientos obtenidos
La extracción del ADN de cada aislamiento se realizó mediante inoculación de una colonia de la levadura en 50 μl de PBS, centrifugada a 13000 g por 5 min, y re-suspendiendo el pellet en PBS. Posteriormente, se realizó lisis térmica mediante incubación a 95°C por 1 5 min. La suspensión fue centrifugada a 13000 g por 15 min, y se tomaron 2 ML del sobrenadante para amplificación directa por PCR de las regiones ITS1 e ITS2 del ARNr utilizando los iniciadores universales ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') e ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' ), reportados por (White et al., 1990) bajo las siguientes condiciones para 25 Ml de reacción : Taq DNA polimerasa Tucan Taq® 1 U/reacción (CorpoGen, Bogotá), dNTPs 100μ! (VBLABS ref ABMG050, Canadá), cloruro de magnesio 1,5 mM, tampón de reacción 1 X . Los parámetros de PCR fueron los siguientes: un ciclo de desnaturalización inicial a 94°C por 5 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 3 min, alineación a 55° C por un min, y un ciclo de extensión final a 72°C por 2 min. Los productos de PCR obtenidos fueron visualizados en gel de agarosa al 1,5 %, en cámara de electroforesis a 100 mV durante 45 min, y enviados a secuenciar mediante la técnica de Sanger (Macrogen,Corea) utilizando los mismos iniciadores para obtener secuencias directas y reversas de la región ITS1 a ITS2.
Identificación taxonómica
Las secuencias obtenidas fueron revisadas por calidad, removiendo ambigüedades. Las secuencias reversa y directa correspondiente a cada aislamiento fueron ensambladas empleando el software Geneious (4.8.5,) obteniendo una secuencia consenso. Estas fueron comparadas contra la base de datos del GenBank, utilizando el programa BLAST, (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y la base de datos UNITE (https://unite.ut.ee/analysis.php) para su identificación.
RESULTADOS
Obtención de aislamientos presentes en los tanques de combustible de vehículos automotores
Dos de los tanques tuvieron presencia de levaduras. Se obtuvieron un total de 16 aislamientos, los cuales fueron tolerantes a crecer en medio PDA suplementado con gasolina al 1%. Los aislamientos presentaron pigmentos naranjas rojizos, blancos y rosados, aspecto cremoso y brillante con los bordes de las colonias lisos, redondos, y elevación convexa. La observación microscópica de cada aislamiento permitió observar tamaño y forma de células levaduriformes (figura 2).
Figura 2: A). Tinción de Gram del aislamiento C1NR, identificado como R. dairenensis. Acercamiento de 50x por Microscopia óptica convencional. B). Aspecto de los aislamientos en medio PDA con gasolina al 1%.
Ensayos de crecimiento con hidrocarburos aromáticos
En los ensayos con hidrocarburos aromáticos, todos los aislamientos presentaron crecimiento notorio pero menor que en PDA, con benceno y tolueno. Tres de los aislamientos (C1C; C1NR; C3RCS) fueron escogidos para su identificación molecular por presentar crecimiento notorio o igual a su crecimiento en PDA (tabla 1) en al menos uno de los hidrocarburos policíclicos analizados. El aislamiento C1C presentó crecimiento notorio en pireno, y poco crecimiento en naftale-no y fenantreno. El aislamiento C1NR, presentó crecimiento notorio en fenantreno y pireno, y poco crecimiento en naftaleno. Una de las réplicas del aislamiento C3RCS presentó crecimiento notorio en pireno. Los demás aislamientos presentaron muy poco crecimiento o no presentaron crecimiento en absoluto en ninguno de los hidrocarburos policíclicos analizados.
Tabla 1: Resultados de los ensayos de crecimiento en medios mínimos minerales con distintos hidrocarburos aromáticos policíclicos.
La cepa P. anomala utilizada como control presentó el crecimiento más notorio en todos los hidrocarburos aromáticos analizados. Se reporta su crecimiento en pireno.
Identificación molecular de los aislamientos
Para los aislamientos seleccionados se obtuvieron productos de PCR del tamaño esperado para la región amplificada (600 pb aproximadamente) (Figura 3). De acuerdo con el análisis de BLAST y la base de datos UNITE, los aislamientos C1C, C1NR y C3RCS pertenecen al género Rhodotoru-la, con un porcentaje de identidad > 99%. En la Tabla 2 se observan los aislamientos con su respectiva identidad, al igual que el número de pares de bases con las cuales fue comparada, y el número de acceso de UNITE.
Figura 3: Visualización de los productos de PCR obtenidos, C1NR, C3RCS y P. anomala, mediante gel de agarosa al 1%. A: la; ־: control negativo.
Tabla 2: Resultado del análisis de BLAST para los aislamientos C1C, C1 NR, C3RCS y P. anómala.
DISCUSIÓN
En este estudio se obtuvieron 16 aislados de levaduras provenientes de tanques de gasolina de vehículos urbanos. Se reporta por primera vez la presencia de levaduras del género Rhodotorula en este ambiente. Las levaduras pueden vivir en depósitos de gasolina y biodiesel, aprovechando estos compuestos como su fuente de alimento y energía (Goulart et al., 2014). Su presencia en este ambiente sugiere adaptaciones para sobrevivir en condiciones hostiles, con baja disponibilidad de agua, donde los microorganismos estarían en contacto directo con el combustible, aprovechando los hidrocarburos aromáticos y alifáticos que se encuentran presentes en la gasolina, como lo sugiere Isola et al. (2013), quienes encontraron microorganismos levaduriformes del género Exophia-la, cuya aparición en tanques de gasolina de carros estaría justificada gracias a las adaptaciones extremo tolerantes que presenta este género en particular, a condiciones ambientales limitantes (Onofri et al., 2007). Sin embargo, no es claro el mecanismo de consumo de los hidrocarburos en este ambiente inusual. Para degradar los contaminantes, los microorganismos deben tener procesos metabólicos para optimizar el contacto entre las células microbianas y las sustancias orgánicas, como la producción de biosurfactantes, además de la producción de oxigenasas y peroxidasas, que se encargan de mediar la conversión de los contaminantes orgánicos paso a paso en productos intermedios del metabolismo (Atlas, 1981), como ácidos, cetonas, aldehídos, alcoholes, entre otros (Itah et al., 2009). Aunque tradicionalmente se ha documentado el consumo mediado por la producción de biosurfactantes, cuya utilidad resulta en un mayor aprovechamiento del hidrocarburo al aumentarse la disponibilidad de éste por medio de la emulsificación (Thavasi et al., 2009), se ha destacado recientemente (Ángeles et al (2017), que el modelo predominante de aprovechamiento de hidrocarburos en tanques de biorre-actores sería por contacto directo, al observarse que en ausencia de biosurfactantes, se presenta el mayor consumo de diésel por parte del consorcio bacteriano. En condiciones de baja humedad dentro del tanque, la incorporación de los hidrocarburos en las células por contacto directo sería más eficiente, al no haber una interfase predominante de agua-combustible, en donde pudiera llevarse a cabo el proceso de emulsificación. Por otro lado, se ha encontrado (Goulart et al., 2014) que R. mucilaginosa y R. diobovatum no producen biosur-factantes en un medio con gasolina como única fuente de carbono, lo cual podría dar indicios que, en los tanques, las levaduras identificadas no producirían estos compuestos, al estar permanentemente expuestas a este combustible. En cuanto a la presencia del género Rhodotorula en los tanques de gasolina, se han reportado en tanques de combustible de aviones (Rauch et al., 2006), así como en depósitos de almacenamiento con residuos de lubricantes aceitosos y suelos contaminados por hidrocarburos (Goulart et al., 2014). Sin embargo, la diversidad de levaduras degradado-ras de PAH reportadas para tanques de almacenamiento de hidrocarburos es aún muy limitada, conociéndose algunos géneros como Candida, Meyerozyma, Wickerhamia, Saccharomyces (Itah et al., 2009), Yarrowia (Mauersberger et al., 2001), Cryptococcus, Torulopsis y Trichosporon (Thurston et al., 1994). En el presente estudio se identificaron tres cepas del género Rhodotorula. Los aislamientos C1C y C3RCS corresponden a la especie R. calyptogenae, (99.8 % de identidad) y el aislamiento C1NR, corresponde a R. dairenensis (99.8% de identidad). Otras especies de este género como R. mucilaginosa (Goulart et al., 2014) y R. aurantiaca (Miranda et al., 2007), poseen la capacidad de degradar queroseno, gasolina y aceite diésel, así como algunos hidrocarburos alifáticos como decano, nonano y dodecano. En el presente estudio, los aislamientos crecieron en un medio con gasolina, lo cual indicaría su adaptación a habitar tanques en donde constantemente están en contacto con dicho combustible. Según los ensayos de crecimiento en medio mínimo mineral, R. calyptogenae y R. dairenensis fueron capaces de crecer en un medio con benceno, tolueno, naftaleno, fenantreno y pireno. El mayor crecimiento se observó con los dos primeros hidrocarburos (crecimiento notorio pero menor que en PDA y gasolina), sugiriendo que éstos microorganismos los utilizan como fuente de carbono en los tanques, al estar presentes en la gasolina. El crecimiento observado en los hidrocarburos policíclos sugiere que estas levaduras pueden degradar PAH de 5 anillos bencénicos, lo cual resulta ser ideal para procesos de biorremediación de contaminantes de mayor complejidad, cuya toxicidad y efectos carcinogénicos son de mayor peligro para el ambiente y los seres vivos. La cepa P. anomala, empleada como control positivo en los ensayos con única fuente de carbono, presentó el crecimiento más notorio en todos los hidrocarburos aromáticos analizados, lo cual es concordante con otros estudios que constatan su actividad degradadora de PAH como el dibenzo-furano (Romero et al., 2002), así como naftaleno, fenantreno, crizeno y dibenzotiofeno (Pan et al., 2004). Se reporta su crecimiento en pireno.
CONCLUSIONES
En este estudio se obtuvieron 16 aislados de levaduras provenientes de tanques de gasolina de vehículos urbanos. Se reporta por primera vez la presencia de levaduras del género Rhodotorula en este ambiente. Tres aislamientos identificados como R. calyptogenae y R. dairenensis crecieron en medios con benceno, tolueno, naftaleno, fe-nantreno y pireno, indicando su potencialidad para degradar éstos compuestos derivados del petróleo. Este estudio también reporta el crecimiento de P. anomala en pireno.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Nacional de Colombia por brindar los laboratorios y materiales para las primeras fases del proyecto, a la Corporación CorpoGen, por brindar parte de la financiación y las instalaciones y equipos para los análisis de crecimiento e identificación molecular de los aislamientos obtenidos. Finalmente, a las personas que se ofrecieron para disponer de sus vehículos para los muestreos. Este estudio obtuvo el reconocimiento como mejor trabajo de grado de pregrado a nivel Nacional y Regional en el año 2016, en el concurso anual de Innovación y Emprendimiento de Ecopetrol (Bogotá-Colombia), en la categoría de "Procesos de refinación y petroquímica".
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referencias
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CrossRef Cited-by
1. Karina Lopez-Lopez, Roxana Andrea Lozano Mahecha. (2022). Aislamiento y caracterización de bacterias endémicas colombianas con capacidad de degradar tolueno. Revista Colombiana de Biotecnología, 24(1), p.6. https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v24n1.98613.
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