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Aislamiento y caracterización parcial de actinomicetos de suelos con actividad antimicrobiana contra bacterias multidrogo-resistentes
Isolation and partial characterization of soils actinomycetes with antimicrobial activity against multidrug-resistant bacteria
DOI:
https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v19n2.64098Palabras clave:
Actinobacterias, Streptomyces, metabolitos antimicrobianos (es)Actinobacteria, Streptomyces, antimicrobial metabolites (en)
Con el objetivo de evaluar la actividad antimicrobiana frente a bacterias multi-drogo resistentes, se estudiaron 234 cepas de actinobacterias aisladas de suelo de Argentina y Perú. Se seleccionaron 13 cepas sobre la base de su actividad antagonista contra Staphylococcus aureus meticilina-resistente (SAMR) y Enterococcus resistente a vancomicina (EVR-van A y van B). La presencia de los genes NRPS, PKS-I y PKS-II fueron investigados por técnicas de PCR. Entre las 13 actinobacterias seleccionadas, la cepa AC69C mostró la mayor actividad en las pruebas de difusión en medio sólido y se evaluó posteriormente la producción de metabolitos antagonistas en medios líquidos. Los mejores resultados se lograron en caldo de fermentación con carbohidratos, al usarse en combinación almidón y glucosa. Se obtuvieron actividades antimicrobianas de 640 unidades arbitrarias (UA), 320 UA, 320 UA y 80 UA contra EVR-van A, EVR-van B, Listeria monocytogenes ATCC7644 y SAMR, respectivamente. La amplificación por PCR del gen ARNr 16S y el análisis filogenético subsecuente de la cepa AC69C exhibieron una homología del 100 % con Streptomyces antibioticus NRRL B-1701. No fue posible establecer una correlación entre los genes amplificados y la actividad antimicrobiana de las 13 cepas seleccionadas. Los resultados de este trabajo demuestran la amplia distribución de las actinobacterias en suelo y la importancia del aislamiento de cepas para la búsqueda de nuevos metabolitos activos contra bacterias multi-drogo resistentes de origen clínico.
Two hundred and thirty four actinobacteria strains were isolated from Argentinian and Peruvian soil in order to evaluate the antimicrobial activity against multidrug resistant bacteria On the basis of their antagonist activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and two vancomycin-resistant Enterococcus (EVR-Van A and EVR Van B),13 strains were selected. The presence of NRPS, PKS-I and PKS-II genes were also investigated by PCR techniques. Among the 13 selected actinobacteria, strain AC69C displayed the higher activity in diffusion tests in solid medium and was further evaluated for the production of antagonist metabolites in liquid media. The best results were obtained using fermentation broth with carbohydrates, when starch and glucose were used in combination. Antimicrobial activities of 640 arbitrary units (AU), 320 AU, 320 AU and 80 AU were obtained against EVR-Van A, EVR-Van B, Listeria monocytogenes ATCC7644 and MRSA, respectively. PCR amplification of 16S rRNA gene and subsequent phylogenetic analysis of AC69C strain displayed a 100 % homology with Streptomyces antibioticus NRRL B-1701. It was not possible to establish a correlation between the amplified genes and antimicrobial activity of the 13 selected strains. The results of this work show the wide distribution of actinobacteria in soil and the importance of the isolation of strain to screen novel active metabolites against multidrug resistant bacteria of clinical origin.
Recibido: 18 de abril de 2017; Aceptado: 4 de diciembre de 2017
Resumen
Con el objetivo de evaluar la actividad antimicrobiana frente a bacterias multi-drogo resistentes, se estudiaron 234 cepas de actinobacterias aisladas de suelo de Argentina y Perú. Se seleccionaron 13 cepas sobre la base de su actividad antagonista contra Staphylococcus aureus meticilina-resistente (SAMR) y Enterococcus resistente a vancomicina (EVR-van A y van B). La presencia de los genes NRPS, PKS-I y PKS-II fueron investigados por técnicas de PCR. Entre las 13 actinobacterias seleccionadas, la cepa AC69C mostró la mayor actividad en las pruebas de difusión en medio sólido y se evaluó posteriormente la producción de metabolitos antagonistas en medios líquidos. Los mejores resultados se lograron en caldo de fermentación con carbohidratos, al usarse en combinación almidón y glucosa. Se obtuvieron actividades antimicrobianas de 640 unidades arbitrarias (UA), 320 UA, 320 UA y 80 UA contra EVR-van A, EVR-van B, Listeria monocytogenes ATCC7644 y SAMR, respectivamente. La amplificación por PCR del gen ARNr 16S y el análisis filogenético subsecuente de la cepa AC69C exhibieron una homología del 100 % con Streptomyces antibioticus NRRL B-1701. No fue posible establecer una correlación entre los genes amplificados y la actividad antimicrobiana de las 13 cepas seleccionadas. Los resultados de este trabajo demuestran la amplia distribución de las actinobacterias en suelo y la importancia del aislamiento de cepas para la búsqueda de nuevos metabolitos activos contra bacterias multi-drogo resistentes de origen clínico.
Palabras clave:
Actinobacterias, Streptomyces, metabolitos antimicrobianos.Abstract
Two hundred and thirty four actinobacteria strains were isolated from Argentinian and Peruvian soil in order to evaluate the antimicrobial activity against multidrug resistant bacteria On the basis of their antagonist activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and two vancomycin-resistant Enterococcus (EVR-Van A and EVR Van B),13 strains were selected. The presence of NRPS, PKS-I and PKS-II genes were also investigated by PCR techniques. Among the 13 selected actinobacteria, strain AC69C displayed the higher activity in diffusion tests in solid medium and was further evaluated for the production of antagonist metabolites in liquid media. The best results were obtained using fermentation broth with carbohydrates, when starch and glucose were used in combination. Antimicrobial activities of 640 arbitrary units (AU), 320 AU, 320 AU and 80 AU were obtained against EVR-Van A, EVR-Van B, Listeria monocytogenes ATCC7644 and MRSA, respectively. PCR amplification of 16S rRNA gene and subsequent phylogenetic analysis of AC69C strain displayed a 100 % homology with Streptomyces antibioticus NRRL B-1701. It was not possible to establish a correlation between the amplified genes and antimicrobial activity of the 13 selected strains. The results of this work show the wide distribution of actinobacteria in soil and the importance of the isolation of strain to screen novel active metabolites against multidrug resistant bacteria of clinical origin.
Key words:
Actinobacteria, Streptomyces, antimicrobial metabolites.Introducción
Los actinomicetos conforman un grupo ubicuo y heterogéneo de microorganismos Gram positivos, representan entre el 20 y 60 % de la población microbiana total del suelo, también pueden encontrarse en ambientes acuáticos tanto dulces como marinos (Kennedy et al., 2009; Hakvåg et al., 2008; Leiva et al., 2004). Son considerados microorganismos saprófitos, cumplen un importante rol en la descomposición de la materia orgánica y el ciclo del carbono mediante la producción de diversas enzimas hidrolíticas y ligninolíticas (Usha et al., 2011; Hogan, 2010).
La actividad metabólica de los actinomicetos, frecuentemente está acompañada por la producción de metabolitos secundarios (MS) de gran diversidad química, que desempeñan un papel primordial en el mantenimiento, señalización y colonización de su hábitat (González et al., 2005).
Las cepas del género Streptomyces, son productoras de la mayoría de los antibióticos de uso frecuente en clínica humana y/o animal. Se ha estimado que las especies de Streptomyces producen más del 50 % de los compuestos bioactivos microbianos que se han descubierto en los últimos 50 años (Berdy, 2012).
La mayoría de los antibióticos son MS extracelulares que normalmente son secretados al medio de cultivo y sirven como precursores para la biosíntesis de agentes anticancerígenos, fármacos, inmunorreguladores, antivirales y agentes antiparasitarios (Prashith et al., 2010).
La mayoría de los compuestos bioactivos sintetizados por actinomicetos corresponden a diversas estructuras químicas, como aminoglucósidos (estreptomicina y kanamicina), glicopéptidos (vancomicina), macrólidos (eritromicina), β-lactámicos (penicilinas, cefalosporinas), nucleósidos (puromicina), péptidos de síntesis no ribosomal (gramicidina, bacitracina), policétidos (actinorrudina, anfotericina), entre otros (Nanjwade et al., 2010).
Los antibióticos peptídicos de síntesis no ribosomal son producidos como MS por diversos microorganismos, siendo sintetizados por una o más péptido sintasas no ribosomal (NRPS) (Ayuso-Sacido & Genilloud, 2004).
Dentro de los MS con actividad antibiótica sintetizados por Streptomyces spp., se destaca un grupo de compuestos denominados policétidos y péptidos de síntesis no ribosomal, entre los cuales se encuentran sustancias de aplicación en medicina y biotecnología (Nikolouli & Mossialos, 2012).
La resistencia antimicrobiana ha emergido como uno de los principales retos en la salud pública, debido a la aparición de patógenos multidrogo-resistentes (MDR), aunado a la presencia de nuevos antibióticos (León et al., 2011). Esta resistencia se da por la aplicación de antibióticos de amplio espectro contra infecciones bacterianas, lo que ejerce una presión de selección (Cornejo Avendaño & Ramírez Rosales, 2012). Los microorganismos MDR presentan una resistencia adquirida a múltiples clases de antibióticos no relacionados entre sí, debido a su exposición secuencial o adquisición de elementos genéticos mediadores de resistencia (Cornejo Avendaño & Ramírez Rosales, 2012).
La aparición de resistencia obliga a desarrollar nuevos antibióticos con mayor eficacia y seguridad tanto para la salud humana como para el medio ambiente (León et al., 2011), ya que algunos de los existentes aunque son efectivos, presentan efectos colaterales. En este sentido, la búsqueda de compuestos activos contra hongos, virus o cepas bacterianas resistentes a antibióticos, es de suma importancia.
En este estudio se evaluó el efecto antimicrobiano de actinomicetos aislados de suelos de Argentina y Perú sobre cepas de bacterias multidrogo-resistentes.
Materiales y Métodos
Origen de las muestras
Se recolectaron de 5-10 g de muestras de suelo a una profundidad entre 2-8 cm, se colocaron en bolsas de polietileno estéril y se conservaron a temperatura ambiente hasta su procesamiento.
Las muestras de suelo se recolectaron en Argentina, principalmente en las provincias de Misiones, La Rioja, Mendoza, Rio Negro y Chubut, mientras que el resto de las muestras se obtuvieron de Perú, de los departamentos Amazonas, Lima, Loreto, Madre de Dios y San Martín.
Aislamiento de los actinomicetos
El aislamiento de los actinomicetos se realizó a partir de un gramo de suelo, se colocó en 9 ml de agua estéril (dilución 10-1). Posteriormente, se las sometió a dos pre-tratamientos: uno físico que consistió en un calentamiento a 70 ºC durante 15 min (Jiménez, 2011) y otro químico en el cual se empleó fenol al 1,5 % por 2 h (Bredholt et al., 2008). Luego, se realizaron diluciones seriadas hasta obtener una dilución final 1 x 10-3 g/ml de muestra. De cada dilución se sembraron 100 µl en cajas de Petri con Agar Caseína Almidón (ACA), empleado como medio no selectivo para actinobacterias (Zucchi et al., 2011; Pinto et al., 2010), Agar Extracto de Levadura (EL), un medio estándar para el aislamiento y caracterización de Streptomyces (Espinosa, 2011), y Agar Sintético de Gause`s (SG) recomendado como medio oligotrófico para el aislamiento de actinomicetos bioactivos (Dong-sheng et al., 2014). A todos los medios se les adicionó cicloheximida (10 µg/ml), nistatina (20 µg/ml) y ácido nalidíxico (20 µg/ml). Las cajas de Petri se incubaron en posición invertida a 28 ºC durante 7-30 días. Se seleccionaron colonias con características de actinomicetos y se conservaron a 4 ºC en medios sólidos de ACA y EL, suplementados con glicerol al 10 % (Jiménez, 2011).
Caracterización morfológica de los actinomicetos
Las cepas de actinomicetos se identificaron de acuerdo a sus características de crecimiento macroscópicas tales como textura, forma, color del micelio aéreo y del sustrato, y la producción de pigmentos difusibles en el medio de cultivo. Además, de observaciones microscópicas mediante la tinción de Gram.
Microorganismos patógenos indicadores
Se utilizaron cepas de patógenos MDR como indicadoras de la actividad antimicrobiana de los actinomicetos, Enterococcus resistentes a vancomicina (ERV) (fenotipos Van A y Van B), Staphylococcus aureus meticilino resistente (SAMR), Listeria monocytogenes ATCC7644 (LM), Klebsiella pneumoniae carbapenemasa tipo A (KPC), K. pneumoniae betalactamasa de espectro extendido (BLEE) y Pseudomonas aeruginosa carbapenemasa tipo B (metalo carbapenemasa) (PAC), provenientes de muestras clínicas del Hospital Zonal de la ciudad de Trelew.
Determinación de la actividad antibacteriana
La actividad antimicrobiana se determinó con el método de “doble capa” (Westerdahl et al., 1991), modificado por León & García-Tello (1998). Previamente se realizó una selección de los actinomicetos sobre la base de su actividad antimicrobiana contra ERV y SAMR; posteriormente de las cepas seleccionadas se determinó su actividad antagonista frente al resto de los patógenos mencionados anteriormente.
Caldo de fermentación y prueba de su actividad inhibitoria
La producción de metabolitos bioactivos, de los actinomicetos seleccionados, se evaluó en tres medios líquidos: con hidratos de carbono (CFHC) (León et al., 2011), sin hidratos de carbono (CF) (León et al., 2007) y ISP 1 (International Streptomyces Proyect).
La reactivación de los actinomicetos se realizó a 28 ºC durante 3 días en 3 ml de caldo tripticasa soja (TS) (Britania, Argentina), posteriormente el contenido se utilizó para inocular los caldos líquidos descritos anteriormente. Una vez sembrado el inóculo se incubó en constante agitación (150 rpm) durante 7 días. Posteriormente el cultivo se centrifugó a 4.000 rpm durante 20 min, para obtener el sobrenadante libre de células que se conservó a -20 ºC hasta su uso.
Título de la actividad antimicrobiana
La determinación cuantitativa de la actividad de los sobrenadantes se realizó por el método de difusión en placa (Vallejo et al., 2014). Los resultados se expresaron como unidades arbitrarias/ml. Las unidades arbitrarias (UA) equivalen a la inversa de la mayor dilución con actividad antimicrobiana (halo de inhibición), dividido por los mililitros de sobrenadante sembrados (UA=1/dilución/ml sembrados).
Extracción de ADN
Las cepas de actinomicetos seleccionadas se incubaron de manera estática en caldo TS a 28 ºC durante 3 días. Posteriormente se centrifugaron a 12.000 g durante 5 min y el ADN se purificó utilizando el kit comercial Wizard Genomics Promega (Madison, Wisconsin, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Identificación genotípica
Mediante la reacción de PCR se amplificó el gen que codifica ARNr 16S con un termociclador Mastercycler® (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), usando los cebadores universales para procariotas 27F (5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´) y 1492R (5´-TACGGYTACCTTG TTACGACTT-3´). Los productos de la amplificación del PCR se enviaron a Macrogen Inc. (Seúl, Corea) para su secuenciación. Los electrofenogramas, se analizaron y editaron utilizando el programa BioEdit Sequence Alignment Editor. La identificación de las secuencias se determinó mediante la herramienta SeqMatch de la base de datos Ribosomal Database Project (RDP) (Cole et al., 2005), el porcentaje de similitud se obtuvo a través del parámetro S_ab score (Izquierdo Altarejos, 2015).
Análisis filogenético
El árbol filogenético se construyó con el programa MEGA 6.06 (Tamura et al., 2013) de acuerdo al método estadístico Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987), utilizando el método de sustitución de Tamura-Nei y con un valor de bootstrap de 1000 réplicas. El alineamiento múltiple de las secuencias se realizó mediante la herramienta Clustal W (Thompson et al., 1994). Las secuencias para la construcción del árbol filogenético pertenecen a cepas de colección y fueron obtenidas de la base de datos del RDP. Se escogió arbitrariamente a la secuencia de la cepa Bacillus subtilis como grupo externo.
Detección de genes de metabolitos secundarios
Para la amplificación de los genes PKS I y NRPS se usaron los cebadores y protocolos descritos por Ayuso-Sacido & Genilloud (2004); mientras que la amplificación del PKS II se realizó de acuerdo con Ketela et al. (1999). Se realizó electroforesis en gel de agarosa para comparar el tamaño de las bandas amplificadas con el marcador de peso molecular MA12 Ladder de masa (100-2000 pb). Para tal fin, se preparó un gel de agarosa al 1% m/v en buffer TAE (Tris, ácido acético, EDTA a pH 8), la electroforesis se llevó a cabo en una cámara horizontal a 70 V durante 1 h. Luego de finalizada la corrida, el gel se colocó durante 20 min en una solución de buffer TAE y bromuro de etidio (0,5 μg/ml); posteriormente se observó el gel con luz UV en un transiluminador.
Resultados y Discusión
Se aislaron 234 cepas presumiblemente diferentes, se comprobó la conveniencia de usar distintos medios como estrategia para el aislamiento de actinobacterias. Se determinó que la mayoría de las cepas aisladas en el medio EL pertenecían al género Streptomyces sin embargo, el aislamiento de una cepa del género Actinomadura (L73M), demostró que el medio no es estrictamente selectivo para el género citado (Soler Hernández, 2012).
El pre-tratamiento con fenol, recomendado para inhibir el crecimiento de estreptomicetos y obtener otros géneros (Bredholt et al., 2008) no resultó adecuado para ese propósito; debido a que las dos cepas (ACF82B y ACF82D) seleccionadas a partir de esta técnica pertenecieron al género Streptomyces.
Las colonias de actinomicetos exhibieron características diferentes en los medios empleados, ya que el desarrollo y morfología de los microorganismos depende de las fuentes de carbono y nitrógeno que componen cada medio de cultivo (Correa, 2008).
La actividad antimicrobiana de las cepas aisladas se evaluó contra las cepas patógenas SARM y ERV, mediante la prueba de la doble capa. Del total de cepas aisladas, 43 exhibieron actividad antagonista frente a SARM mientras que, 23 y 22 cepas mostraron antagonismo frente a ERV Van A y Van B, respectivamente.
Se seleccionaron 13 cepas (AC1B, AC12B, AC21B, AC45C, AC47A, L60A, L67A, L67G, AC69C, L73M, ACF82B, ACF82D y AC87B) sobre la base de su actividad frente a los tres patógenos evaluados.
Las 13 cepas de actinomicetos seleccionadas se evaluaron contra los patógenos restantes, siete cepas mostraron actividad antimicrobiana frente a L. monocytogenes y tres cepas (AC21B, AC45C y L67A) produjeron sustancias antimicrobianas para bacterias Gram positivas (L. monocytogenes) y negativas (K. pneumoniae KPC y K. pneumoniae BLEE). Las cepas AC12B, AC47A y L67G solo inhibieron los microorganismos indicadores ERV (Van A y Van B) y SARM. Ninguna de las cepas seleccionadas exhibió actividad antagónica contra P. aeruginosa. Los resultados de la actividad inhibitoria obtenidos en este estudio resultan comparables a los reportados en trabajos previos para el género Streptomyces (Kouadri et al., 2014; Silambarasan et al., 2012; Valli et al., 2012). La diferencia de actividad antagónica de los actinomicetos contras las bacterias Gram positivas y negativas puede deberse a la estructura celular de los Gram negativos, donde la membrana externa de polisacáridos actúa como una barrera y la ausencia de la misma en las Gram positivas puede aumentar la susceptibilidad de dicha célula a los compuestos antimicrobianos (Silambarasan et al., 2012; Valli et al., 2012). (Srivibool & Sukchotiratana, 2006) sugieren que un halo de gran actividad antimicrobiana indica más eficacia o mayor difusión de la sustancia o ambos, y la ausencia del halo indica una resistencia completa.
La producción de metabolitos bioactivos se realizó en medio líquido utilizando la cepa AC69C que exhibió la mayor actividad inhibitoria en medio sólido contra los patógenos Gram positivos evaluados (figura 1a). La actividad inhibitoria se determinó por duplicado mediante la prueba de difusión en placa. Se evaluaron los sobrenadantes de la cepa AC69C, derivados de los distintos caldos de fermentación, frente a las cepas indicadoras Gram positivas (figuras 1b, 1c y 1d). El medio CFHC resultó el más eficiente para la producción de metabolitos inhibitorios, seguido por el CF y por último el medio ISP 1 (tabla 1).
Figura 1:: a) Actividad antimicrobiana de los actinomicetos AC69C y AC45C frente a Listeria monocytogenes ATCC7644 (LM), mediante la técnica de la doble capa. Título de la actividad antimicrobiana de la cepa AC69C frente a ERV (fenotipo Van A) en: b) caldo de fermentación con hidratos de carbono (CFHC), c) caldo de fermentación sin hidratos de carbono (CF) y d) caldo ISP1 (International Streptomyces Proyect).
*ERV: Enterococcus resistente a vancomicina (fenotipos Van A y Van B); LM: Listeria monocytogenes ATCC 7644; SAMR: Staphylococcus aureus meticilino resistente. CFHC: Caldo de fermentación con hidratos de carbono; CF: Caldo de fermentación sin hidratos de carbono; caldo ISP 1: International Streptomyces Proyect.Tabla 1: Actividad inhibitoria del actinomiceto AC69C mediante la prueba de difusión en placa.
Unidades Arbitrarias (UA)/ml
Cepas Indicadoras
CFHC
CF
ISP 1
ERV (Van A)
640
320
40
ERV (Van B)
320
320
40
LM
320
80
0
SAMR
80
40
0
Los resultados obtenidos con los medios empleados demuestra que la habilidad de los microorganismos para producir antibióticos no es una característica constante, sino que puede ser incrementada o disminuida, dependiendo de las condiciones de fermentación en las cuales se desarrollan (Kouadri et al., 2014; Uzcátegui Negrón et al., 2013). La composición y las concentraciones de los componentes en los medios de cultivo están estrechamente relacionadas con las capacidades metabólicas del organismo productor que influyen en la biosíntesis de las moléculas bioactivas (Fourati-Ben Fguira et al., 2005).
La identificación genotípica de cepas de actinomicetos seleccionadas, se realizó utilizando las secuencias de ADNr 16S derivadas de los electrofenogramas. La mayoría de las cepas presentaron una alta homología con el género Streptomyces, excepto la cepa L73M con mayor porcentaje de identidad con el género Actinomadura. Estos resultados se corroboraron mediante un análisis filogenético, utilizando las especies válidas para cada género, como especie fuera del grupo se eligió a B. subtilis. En el árbol se observa tres grupos, el primero perteneciente al género Streptomyces, el segundo al género Actinomadura y el tercero al grupo externo. La cepa AC69C se identificó como S. antibioticus con un 100% de actividad (Figura 2). Las cepas AC45C, L67A y L60A no fue posible identificarlas a nivel de especie, por lo que podrían ser nuevas especies. Sin embargo, para comprobar esto será necesario realizar hibridaciones DNA:DNA y diversas pruebas confirmatorias tales como menaquinonas, ácidos grasos, lípidos polares, contenido en G+C, entre otras (Soler Hernández, 2012). La alta abundancia del género Streptomyces coincide con lo reportado por varios autores, destacando que este género representa el 70-95 % de los actinomicetos de suelo (Sagardoy & Mandolesi, 2004). Ninguna de las cepas de actinomicetos se relacionó filogenéticamente con especies patógenas.
Figura 2: Árbol filogenético construido según el método estadístico Neighbor-joining basado en la relación entre las secuencias del gen ARNr 16S de cepas aisladas de actinomicetos (▲). Los números internos de nodos corresponden a los valores de soporte de bootstrap ((60 %). Entre paréntesis se muestran los números de acceso al GenBank. La secuencia de gen ARNr 16S de la cepa B.subtilis fue elegida arbitrariamente como secuencia externa al grupo. (Barra, 0,02 sustituciones por posición de nucleótidos).
Se evaluó la presencia de los genes PKS I, PKS II y NRPS en las cepas seleccionadas. Las cepas AC45C, L67G, ACF82B, y ACF82D exhibieron el producto de amplificación del gen NRPS, las cepas L67A y ACF82B amplificaron el gen PKS-I, ninguna amplificó el gen PKS-II.
Ayuso-Sacido & Genilloud (2004) detectaron entre 56,7 % y 79,5 % de genes PKS-I y NRPS respectivamente en actinomicetos; mientras que en Streptomyces los genes PKS-I y NRPS se detectaron con mayor frecuencia (79 % y 97 % respectivamente). En cambio, en cepas de Streptomyces aisladas de muestras de suelos tropicales se detectaron genes PKS-I en mayor proporción (72,4 %), con respecto a los NRPS (60,0 %) y PKS-II (69,2 %) (Ayuso et al., 2005). Al analizar los resultados de este trabajo se determinó que no existe una relación entre la actividad antimicrobiana y la presencia de los genes (NRPS, PKS-I y PKS-II) de los actinomicetos seleccionados. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Kouadri et al., en el 2014 para aislados de Streptomyces marinos, donde no observaron dicha relación al analizar las amplificaciones de los genes NRPS y PKS-II. En cambio, los resultados difieren a los obtenidos en otras investigaciones, donde comprobaron que el porcentaje de las amplificaciones de NRPS y PKS-I (excepto para PKS-II) resultaron ser al menos dos veces mayor en el grupo de cepas activas comparado con las inactivas (Ayuso et al., 2005). Los cebadores NRPS y PKS-I amplifican secuencias altamente conservadas de los dominios de adenilación asociados con NRPS y dominios de cetosintasa (KS) asociados con el gen PKS-I (Ayuso-Sacido & Genilloud, 2004). La ausencia de la amplificación de los genes en alguna de las cepas aisladas puede indicar la carencia del gen o bien, que estas secuencias conservadas presentan una mayor tasa de variación a la esperada, comprobando que los cebadores utilizados no son los óptimos para amplificar la región de estudio. El genoma de Streptomyces presenta varios grupos de genes NRPS y PKS, esto puede indicar que un gran número de componentes potencialmente bioactivos aún están sin identificar (Kouadri et al., 2014). Para determinar el efecto bactericida frente a los patógenos MDR o si se trata de algún compuesto estructuralmente nuevo, sería necesario la purificación de los compuestos activos así como la evaluación de la capacidad sinérgica de los componentes con diferentes solventes (León et al., 2011).
Conclusión
El gran número de aislamientos obtenidos de muestras de Argentina y Perú demuestran la gran ubicuidad de las actinobacterias. El uso de diferentes medios de cultivo es una estrategia recomendable para lograr un mayor número de aislamientos.
La actividad inhibitoria sobre cepas MDR representa un parámetro conveniente para la selección de actinobacterias productoras de nuevos metabolitos bioactivos.
La detección de los genes PKS I, PKS II y NRPS no permitió resultados concluyentes sobre su relación con la producción de metabolitos activos.
Las pruebas in-vitro realizadas a la cepa AC69C demostraron la capacidad de producir compuestos bioactivos contra patógenos tipificados como MDR de importancia clínica. Son necesarios estudios adicionales tales como variables físico-químicas, componentes del medio y estudios genéticos que permitan determinar su potencial uso en diversos campos de la biotecnología microbiana.
Agradecimiento
Los autores agradecen el apoyo financiero provisto por el Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva (MINCyT) y el Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC), Proyectos bilaterales.
Referencias bibliográficas
Referencias
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