Determination of verapamil through LC-ESI-MS/MS in a case of fatal intoxication

Determinación de verapamilo mediante LC-ESI-MS/MS en un caso de intoxicación fatal

Verapamil is a synthetic derivative of papaverine, which is used therapeutically as a hypertensive, antiarrhythmic and antianginal. This study describes an analytical method for the determination of verapamil in biological matrices of blood and urine, which consists of a liquid-liquid extraction of samples for analysis using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-ESI-MS/ MS), with flurazepam as an internal standard. The method was applied to the acute fatal intoxication of a 17-year-old young woman who consumed 170 tablets of verapamil; the concentration of this medication found in the blood was 18.261mg/L and 0.369mg/L in the urine. This study also puts forth the use of LC-ESI-MS/MS in the analysis of verapamil in biological samples for applications in forensic toxicology.

El verapamilo es un derivado sintético de la papaverina que se emplea a nivel terapéutico como antihipertensivo, antiarrítmico y antianginoso. El presente estudio describe un método analítico para la determinación de verapamilo en las matrices biológicas sangre y orina, que consiste en una extracción líquido-líquido de las muestras, para luego ser analizadas por cromatografía líquida con ionización electro-spray y espectrometría de masas tándem (LC-ESI-MS/MS), empleando el flurazepam como estándar interno. El método desarrollado fue aplicado a la intoxicación aguda fatal de una joven de 17 años de edad quien consumió 170 tabletas de verapamilo; la concentración de este medicamento encontrada en sangre fue de 18.261mg/L y de 0.369mg/L en la orina. De igual forma, este estudio expone la utilidad de emplear LC-ESI-MS/ MS en el análisis de verapamilo en muestras biológicas para su aplicación en toxicología forense. 

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National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences, Special Edition

Sindy Varon1,

Diana Mariño2

1. Pharmacological chemist.

National Institute of Legal Medicine and Forensic Science

- Bogotá Office -

Toxicology Group.

2. Chemist. M.Sc.

National Institute of Legal Medicine and Forensic Science

- Office Bogotá -

Toxicology Group

Correspondence to:

Sindy Varón.

Toxicology Group,

National Institute of Legal Medicine and Forensic Science.

Email: svaron@medicinalegal.gov.co

SUMMARY

Keywords: Verapamil; Liquid chromatography with electrospray ionization and tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS); Forensic toxicology.

INTRODUCTION

A large number of cases of unspecified deaths which arrive at the National Institute of Legal Medicine and Forensic Science (INMLCF for it’s acronym in Spanish) in Bogotá lack adequate information to establish an apparent cause of death. Toxicological analysis is used to identify the substances of habitual consumption to assist in determining the cause of death. In the experience of the Toxicology Laboratory at the INMLCF, some suicide deaths are associated with the consumption of pest-control substances and various pharmaceutical drugs.

Verapamil is a drug that acts by inhibiting slow calcium channels, which are dependent on the voltage of cardiac muscle cells, reducing the intracellular ion concentration. This medication is classified as a calcium blocker which acts on the vascular system, heart, and conduction tissue; it has clinically useful effects in relaxing blood vessels, reducing the need for the heart to pump with such force; it also increases blood flow and oxygenation of the heart while diminishing the electrical activity to control heart rate (1,2,3,4).

Verapamil is administered orally and the therapeutic dosage is determined by pharmacokinetics as well as the clinical actions and characteristics of the patient. Overdosing can be fatal, which is why the analysis to determine biological matrices is very important in forensic toxicology to establish the cause of death.

A quick and simple method was developed to determine the quantity of verapamil in blood and urine using LC-ESI-MS/MS. The analytical methodology was obtained by reviewing articles that analyze these substances (5,6,7,8), which were then applied to a case of fatal intoxication presumably caused by this drug.

Presentation of the case

A young woman of 17 years of age with a 53kg weight was brought to the emergency room due to intoxication symptoms after consuming a mixture of drugs including metformin, gemfibrozil and verapamil, which produced vomiting, tonic-clonic seizures, abundant secretions from the airways and finally, a cardio- respiratory arrest.

In the medical-legal examination, the patient presented signs of minor blunt trauma in the inferior extremities with different stages of evolution. There were also nonspecific signs, both internal and external, of marked hypoxia, pulmonary oedema and cerebral and pulmonary lesions suggesting pulmonary hemorrhaging. From the medical forensic opinion, the findings were nonspecific and were not enough to determine the cause of death; therefore the toxicological analysis was necessary, considering that, along with the cadaver, 17 packs of 120mg of verapamil were found, which correspond to 170 tablets (20.4g), 3 packs of 850mg of metformin, which correspond to 30 tablets (25.5g), and 4 packs of 600mg of gemfibrozil, which correspond to 40 tablets (24g). The research was then narrowed down to verapamil since literature reports a lethal dose for this drug, in contrast with the other substances that were ingested (Table 1).

Based on the number of tablets consumed, the volume of distribution of each substance, the concentration in plasma and the weight of the deceased, theoretical values of the concentrations of each substance in the blood were calculated supposing that they were totally absorbed.

It is not known if any other attempts at disintoxication, aside from vomiting, were made in the emergency room to eliminate the absorption of the active principles in the gastric content (Table 2). These calculations allow for the establishment of an approximate value of the concentration in the blood of each drug supposing a total absorption of these substances. As the ingested dose of verapamil was so high and the lethal dose low, it is likely that a total absorption did not occur since the organs failed quickly.

Substance in blood	Therapeutic concentration (μg/mL)	Toxic concentration (μg/mL)	Lethal concentration (μg/mL)
Verapamil	0.08-0.3	0.36	1
Gemfibrozilo	Not reported	Not reported	Not reported
Metformina	1-4	45-70	Not reported

Table 1. Therapeutic, toxic and lethal concentrations of the drugs in this study.

Source: (9,10).

Substance in blood	Volume of distribution (L/kg)3,9	Dose taken (g)	Maximum concentration in blood (mg/L)
Verapamil	2-6	20.4	64.15
Gemfibrozilo	Not reported	24.0	---
Metformin	1-4	25.5	120.28

Table 2. Volume of distribution, dose taken of each drug and maximum concentration in blood of the deceased.

Source: (3).

 

Cp (mg/L): Concentration in plasma.

A (mg/L): Dose taken over weight.

Vd (L/Kg): Volume of distribution for each active component.

METHODOLOGY

Procedure

The levels of the calibration curve were prepared in triplicate by taking 2mL of blank blood in test tubes and adding verapamil to obtain concentrations of 5, 10, 15, 20 and 25μg/mL and 0.1μg/mL of flurazepam (enriched blood). For the urine, the same preparation was done with concentrations of 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0 and 1.5 μg/mL of verapamil and 0.1μg/mL of flurazepam (enriched). Flurazepam was added to the blood and urine samples of the cadaver as internal standard with a concentration of 0.1μg/mL.

Levels of enriched blood and urine, along with the respective samples from the cadaver, were submitted to liquid-liquid extraction to recover the verapamil by adding a pH 6 buffer of 4.0 mL of phosphates and 6.6 mL of extraction solvent (dichloromethane/isopropanol/ammonium hydroxide 80/20/2). They were then submitted to sonication for 30 minutes and centrifuged at approximately 2000 rpm. The upper organic layer was then transferred to clean and dry test tubes of 6 mL, evaporated at 60°C, and agitated to achieve an approximate volume of 0.5 mL. Maximum vacuum was applied until dry. Finally, the evaporated extracts were reconstituted with 50μL of ACN/H20 solution (50:50 v/v) with 0.1% formic acid.

Each solution of verapamil and flurazepam analytes were prepared at 1mg/mL in methanol, both reactions are standard. The reagents were at analytic grade with the exception of methanol and acetonitrile (ACN), which were at HPLC grade. Blank urine was obtained through volunteers and blank blood was obtained from a 50:50 dilution of concentrated red blood cells with deionized water.

Conditions of the liquid chromatography-mass spectrometry

PA liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of the Thermo Electron Corporation brand and Thermo Surveyor-LCQ Advantage Max model was used. The conditions were: Column HPLC Hypersil Gold PFP of (50mm X 2.1mm, 5μm); the temperature of the column was 40°C. An acetonitrile gradient was used with 0.1% formic acid and a 10 mm solution of ammonium formiate with 0.1% of formic acid at a constant flowrate of 200 μL/min. The programming was the following: 0-0.5 min 5% of ACN, 0.5-5.5 increase of 5-95%, 5.5-8.5 minutes remaining at 95% of ACN, 8.6-13 minute decrease of 95-5%. The solvents of the mobile phase had been vacuum filtered earlier using a hydrophilic polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with a pore size of 0.22μm. The injection volume was 10μL.

Mass spectometry was conducted in tandem with the ion trap analyzer using a product ion scan, equipped with an electrospray ionization source (ESI) in positive mode. The conditions were optimized for the verapamil through infusion to the mass spectrometer. The conditions of the main parameters were: capillary voltage 9.00V, source voltage of 5.00kV, capillary temperature of 160ºC, lense voltage of 5V, flow of ionization gas of 55 units and flow of auxiliary gas of 15 units. Table 3 shows the values of ions (m/z), retention time (RT) and collision energy (CE) and the isolation width optimized for the identification of each composite.

Composite	Transition (m/z)	CE (%)	isolation width	Polarity	RT (min)
Verapamil	455.1→303.2 455.1→165.1	35	1	positive	6.23
Fluazepam (SI)	388.1→315.1 388.1→317.1	35	1	positive	5.52

Table 3. Data of the LC-ESI-MS/MS

Source: Author.

RESULTS

The correlation coefficients for the calibration curve were 0.0047 and 0.9960 in blood and urine respectively, with a variation coefficient lower than 5% in each level. The concentration of verapamil found in the blood of the deceased was 18,26mg/L and 0.37mg/L in the urine. The chromatogram and calibration curve of the verapamil in blood are presented in Figure 1.

Fig 1. Chromatogram and calibration curve of the verapamil in blood (LC-MS)

Source: Author.

Fig 2. Chromatogram of the verapamil and flurazepam, and mass spectrum of the verapamil

Source: Author.

DISCUSSION AND CONCLUSIONS

A new method was established to determine verapamil in blood and urine through LC-ESI-MS/MS. The method presents linear results that comply with the acceptance criteria of bioanalytical guidelines (11).

LC-ESI-MS/MS is a sensitive technique to detect verapamil in biological samples; the method is highly selective and allows for the unequivocal determination of the drug in question, which is a fundamental requirement of forensic toxicology.

According to information found in bibliographical references, the lethal concentration of verapamil is 1μg/mL and in the results obtained, the concentration of verapamil was 18.26mg/L (18.26μg/mL) after the deceased had consumed 170 tablets of 120 mg of verapamil for a total dosage of 20.4g, which was potentially modified by vomiting. Plasma concentration levels could have theoretically reached 64.15mg/L if the drug had been completely absorbed.

The lethal dose of verapamil can be considered the cause of rapid organ failure, indicating that she suffered from an acute intoxication that led to her death.

Finally, in the forensic context, it is good practice to determine the presence of a substance with different matrices or, if there is only one sample, to undertake analyses with different techniques or assays repeated on different days (12). While components are not necessarily present in all matrices (according to the variables involved in toxicokinetics), in the current case, the concentration of verapamil in blood and urine definitely proved the cause of death by intoxication with this drug.

REFERENCES

1. Isaza C, Isaza G, Fuentes J. Fundamentos de Farmacología en Terapéutica. 4th ed. Pereira: Postergraph; 2002.

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3. Moffat A, Osselton D, Widdop B. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons: In Pharmaceuticals, Body Fluids, and Postmortem Material. 3rd ed. London: Pharmaceutical Press; 2004.

4. Baselt RC. Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man. 7th Ed. Foster City: Biomedical Publications; 2004.

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6. Chytil L, Strauch B, Cvačka J, Marešová V, Widimský J Jr, Holaj R, et al. Determination of doxazosin and verapamil in human serum by fast LC-MS/MS: application to document non-compliance of patients. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2010;878(30):3167-73. http://doi.org/chw3c7.

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8. Mullett WM, Walles M, Levsen K, Borlak J, Pawliszyn J. Multidimensional on-line sample preparation of verapamil and its metabolites by a molecularly imprinted polymer coupled to liquid chromatography– mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2004;801(2):297- 306. http://doi.org/bpv568.

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11. U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation. Washington, D.C.: U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM); 2001.

12. Society of Forensic Toxicologists Inc, American Academy of Forensic Sciences, Toxicology Section. SOFT/AAFS Forensic Laboratory Guidelines. Forensic Toxicology Laboratory Guidelines. 2006:1-24

Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses, Suplemento

Sindy Varon1,

Diana Mariño2

1. Química Farmacéutica.

National Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses

- Regional Bogotá -

Grupo de Toxicología.

2. Química. M.Sc.

Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses

- Regional Bogotá -

Grupo de Toxicología.

Correspondencia:

Sindy Varón.

Grupo de Toxicología,

Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses.

Correo electrónico: svaron@medicinalegal.gov.co

RESUMEN

Palabras clave: Verapamilo; Cromatografía Líquida con ionización electro-spray y Espectrometría de Masas tándem (LC-ESI-MS/MS); toxicología forense.

INTRODUCCIÓN

Gran cantidad de muertes inespecíficas que ingresan al Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses (INMLCF) de Bogotá, D.C. carecen de información que asocie a estas personas con una causa aparente de muerte. Mediante el análisis toxicológico se busca identificar las sustancias de consumo habituales apoyando la determinación de la causa de la muerte. En experiencia del laboratorio de toxicología del INMLCF, algunas muertes suicidas están asociadas al consumo de sustancias plaguicidas y diversos fármacos.

El verapamilo es un fármaco que actúa inhibiendo los canales lentos de calcio, que son dependientes del voltaje de las células cardíacas y las del músculo liso, reduciendo la concentración intracelular de iones. Este medicamento está clasificado como un bloqueador de calcio con actividad sobre el sistema vascular, miocardio y tejido de conducción; tiene efectos clínicamente útiles al relajar los vasos sanguíneos, haciendo que el corazón no tenga que bombear con tanta fuerza; también aumenta el flujo sanguíneo y la oxigenación del corazón, y disminuye la actividad eléctrica de este para controlar la frecuencia cardíaca (1,2,3,4).

La administración del verapamilo se realiza mediante vía oral y su dosis terapéutica se determina de acuerdo a la farmacocinética, acción y características clínicas del paciente. Al sobrepasar la dosis terapéutica, las consecuencias pueden ser fatales y por lo tanto el análisis para su determinación en matrices biológicas es muy importante en toxicología forense para establecer la causa de muerte.

Se desarrolló un método rápido y sencillo para cuantificar verapamilo en sangre y orina mediante LC-ESI-MS/MS. La metodología analítica propuesta se obtuvo a partir de la revisión de artículos de análisis de estas sustancias (5,6,7,8) y se aplicó a un caso de intoxicación fatal presuntamente por este fármaco.

Presentación del caso

Una joven de 17 años y 53kg de peso corporal fue llevada a urgencia hospitalaria por presentar intoxicación al consumir una mezcla de fármacos como metformina, gemfibrozilo y verapamilo, los cuales produjeron un cuadro clínico de emesis, convulsiones tónico-clónicas, abundantes secreciones de la vía aérea y finalmente paro cardio-respiratorio.

La paciente, al examen médico legal, presentaba signos de trauma contundente menor en extremidades inferiores con diferentes estadios de evolución, signos inespecíficos tanto internos como externos de hipoxia marcada, de edema pulmonar y cerebral y lesiones pulmonares sugestivas de hemorragia pulmonar. En concepto del médico forense, los hallazgos fueron inespecíficos y no permitían determinar la causa de muerte; por lo tanto, fue necesario el análisis toxicológico teniendo en cuenta que con el cadáver se encontraron 17 blísteres de verapamilo por 120mg que corresponden a 170 tabletas (20.4g), 3 blísteres de metformina de 850mg que corresponden a 30 tabletas (25.5g) y 4 blísteres de gemfibrozilo de 600mg que corresponden a 40 tabletas (24g). La búsqueda se orientó hacia el verapamilo ya que la literatura reporta dosis letal, cntrario a las otras sustancias ingeridas (Tabla 1).

Con el número de tabletas que consumió la occisa, el volumen de distribución de cada sustancia, la concentración en plasma y el peso de la fallecida se calcularon los valores teóricos de las concentraciones que cada una de las sustancias hubiesen alcanzado en sangre si se absorbían en su totalidad.

Se desconoce si, aparte de la emesis, se realizaron procesos de desintoxicación en urgencias para eliminar la absorción de los principios activos en contenido gástrico (Tabla 2). Estos cálculos permiten establecer el valor aproximado de la concentración en sangre de cada fármaco si hubiese existido absorción total de estos. Como la dosis consumida de verapamilo fue tan alta y su dosis letal es baja, es probable que no permitiera la absorción total de las sustancias por causar fallo orgánico rápidamente.

Sustancia en sangre	Concentración terapéutica (μg/mL)	Concentración tóxica (μg/mL)	Concentración letal (μg/mL)
Verapamilo	0.08-0.3	0.36	1
Gemfibrozilo	No reporta	No reporta	No reporta
Metformina	1-4	45-70	No reporta

Tabla 1. Concentración plasmática terapéutica, tóxica y letal de los fármacos en estudio.

Fuente: (9,10).

Sustancia en sangre	Volumen de distribución (L/kg)3,9	Dosis tomada (g)	Concentración máxima en sangre (mg/L)
Verapamilo	2-6	20.4	64.15
Gemfibrozilo	No reporta	24.0	---
Metformina	1-4	25.5	120.28

Tabla 2. Volumen de distribución, dosis tomada de cada fármaco y concentración máxima en sangre por la occisa.

Fuente: (3).

 

Cp (mg/L): Concentración en plasma.

A (mg/L): Dosis tomada sobre peso.

Vd (L/Kg): Volumen de distribución para cada principio activo.

METODOLOGÍA

Procedimiento

Los niveles de la curva de calibración se prepararon por triplicado tomando dos mililitros de sangre blanco en tubos de ensayo y se le adicionó respectivamente verapamilo para obtener la concentraciones de 5, 10, 15, 20 y 25μg/mL y flurazepam de 0.1μg/mL (sangre enriquecida). Para la orina se realizó la misma preparación con concentraciones de 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0 y 1.5μg/mL

de verapamilo y de 0.1μg/mL de flurazepam (enriquecida). A las muestras de sangre y orina del cadáver se adicionó el flurazepam como estándar interno a una concentración de 0.1μg/mL. Los niveles de sangre y orina enriquecidos, junto con las respectivas muestras del cadáver, se sometieron a un procedimiento de extracción líquido- líquido para recuperar el verapamilo mediante la adición de 4.0mL de buffer de fosfatos pH 6.0 y 6mL del solvente de extracción (diclorometano/ isopropanol/hidróxido de amonio 80/20/2). Luego se sometieron a sonicación por 30 minutos, centrifugación aproximadamente a 2000rpm y posterior transferencia de la capa superior orgánica a tubos de ensayo de 6mL limpios y secos, evaporación a 60°C con agitación hasta volumen aproximado de 0.5mL y aplicación de vacío máximo hasta sequedad; finalmente, se reconstituyeron los extractos evaporados con 50μL de solución ACN/H20 (50:50 v/v) con 0.1% de ácido fórmico.

Cada solución de los analitos verapamilo y flurazepam se preparó a 1mg/mL en metanol, ambos reactivos son estándares. Los reactivos son grado analítico a excepción del metanol y el acetonitrilo (ACN) que fueron grado HPLC. La orina blanco fue obtenida de voluntarios y la sangre blanco se obtuvo de la dilución 50:50 de glóbulos rojos concentrados con agua desionizada.

Condiciones de la cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem

Se empleó un cromatógrafo líquido con espectrometría de masas (LC-MS) marca Thermo Electron Corporation, Modelo Thermo Surveyor- LCQ Advantage Max. Las condiciones fueron: Columna HPLC Hypersil Gold PFP de (50mm X 2.1mm, 5μm); temperatura de la columna de 40°C. Se utilizó un gradiente de Acetonitrilo con 0.1% de ácido fórmico y solución de formiato de amonio de 10mM con 0.1% de ácido fórmico a flujo constante de 200μL/min. La programación fue la siguiente: 0-0.5 min 5% de ACN, 0.5-5.5 aumenta de 5-95%, 5.5-8.5 min permanece a 95% de ACN, 8.6-13 min decrece de 95-5%. Previamente los solventes de la fase móvil fueron filtrados al vacío utilizando una membrana hidrofílica en difluoruro de polivinilideno (PVDF) de tamaño de poro de 0.22μm. Volumen de inyección 10μL.

La espectrometría de masas fue llevada a cabo por el analizador de trampa de iones en tándem mediante barrido de los iones producto (product ion scan), equipado con una fuente de ionización electro-spray (ESI) modo positivo. Las condiciones fueron optimizadas para el verapamilo mediante su infusión al espectrómetro de masas. Las condiciones de los principales parámetros fueron: Voltaje del capilar 9.00V, voltaje de la fuente 5.00kV, temperatura del capilar 160ºC, voltaje de las lentes 5V, flujo del gas de ionización 55 unidades, flujo del gas auxiliar 15 unidades. En la Tabla 3 se muestran los valores de los iones (m/z), el tiempo de retención (TR), la energía de colisión (EC) y el isolation width optimizados para la identificación de cada compuesto.

Compuesto	Transición (m/z)	EC (%)	isolation width	Polaridad	TR (min)
Verapamilo	455.1→303.2 455.1→165.1	35	1	positiva	6.23
Fluazepam (SI)	388.1→315.1 388.1→317.1	35	1	positiva	5.52

Tabla 3. Datos de LC-ESI-MS/MS

Fuente: Elaboración propia.

RESULTADOS

Los coeficientes de correlación para la curva de calibración fueron de 0.9947 y 0.9960 en sangre y orina respectivamente, con coeficiente de variación en cada nivel menor al 5%. La concentración de verapamilo encontrada en sangre de la occisa fue de 18,26mg/L y en orina de 0.37mg/L.

El Cromatograma y la curva de calibración del verapamilo en sangre se presentan en la Figura 1.

Fig 1. Cromatograma y curva de calibración del verapamilo en sangre (LC-MS)

Fuente: Elaboración propia.

Fig 2. Cromatograma del verapamilo y el flurazepam, y el espectro de masas del Verapamilo.

Fuente: Elaboración propia.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Se estableció un método nuevo para la determinación de verapamilo en sangre y orina mediante LC-ESI-MS/MS. El método presenta resultados de linealidad que cumplen los criterios de aceptación de acuerdo a las guías bioanalíticas (11).

LC-ESI-MS/MS es una técnica sensible para la detección de verapamilo en muestras biológicas; el método presenta alta selectividad y permite la determinación inequívoca del fármaco, condición fundamental en los laboratorios de toxicología forense.

De acuerdo a información encontrada en las referencias bibliográficas, la concentración letal del verapamilo es de 1μg/mL y en los resultados obtenidos se encontró verapamilo en un concentración de 18.26mg/L (18.26μg/ mL) después de haber consumido 170 tabletas de verapamilo de 120mg para una dosis de 20.4g que posiblemente fue modificado por la emesis proferida por la occisa, quien en teoría hubiese alcanzado una concentración plasmática de 64.15mg/L si se hubiese absorbido en su totalidad el fármaco.

Se puede considerar que la dosis letal de verapamilo causó un fallo orgánico rápidamente, indicando que tuvo una intoxicación aguda que condujo a su fallecimiento.

Finalmente, en el contexto forense es una buena práctica determinar la presencia de una sustancia en diferentes matrices o, si solo se cuenta con una muestra, realizar los análisis con diferentes técnicas o ensayos repetidos en días diferentes (12). Con la salvedad que, de acuerdo a las variables que intervienen en la toxicocinética, un compuesto no necesariamente está presente en todas las matrices, en el presente caso la concentración de verapamilo en sangre y en orina definitivamente evidencian la causa de muerte por intoxicación con este fármaco.

REFERENCIAS

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