Implementación de un método fluorométrico para evaluación de actividad anti transcriptasa reversa del virus VIH-1

Implementation of a fluorometric method for the anti HIV-1 virus reverse transcriptase activity evaluation

Se implementó una prueba de tamizaje preliminar para evaluar la potencial inhibición ejercida por productos de origen natural y sintético sobre la actividad de la proteína Transcriptasa Reversa del virus VIH-1, en respuesta a la necesidad de disponer de un ensayo in vitro no radioactivo, relativamente rápido, que arroje resultados válidos, con costos moderados, bioseguro y de fácil acceso. Esta prueba se basa en la capacidad que tiene la proteína transcriptasa reversa viral para formar DNA de cadena sencilla (cDNA) a partir de RNA, utilizando deoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs), proceso conocido como transcripción reversa. Para detectar la actividad de la proteína se realizaron ensayos fluorométricos in vitro, usando proteína recombinante sin purificar, y nucleótidos fluorescentemente marcados (Cy3-dCTP) como parte del sustrato. Las condiciones establecidas para la actividad de la proteína fueron 5µg/reacción de RNA total y 2µg/reacción de oligo-dT_12-18, reflejadas en 43.6% de incorporación del nucleótido fluoromarcado

A preliminary screening test to asses the potential of natural and synthetic products to inhibit the HIV-1 reverse transcriptase activity was implemented. This method is a response to the need of an in vitro, non radioactive, easy, biosafety and rapid test, with reliable results and accesible to our laboratories. This test is based on the ability of the viral reverse trascriptase (RT) of synthesize single strand DNA (cDNA) from a RNA strand, using triphosphate deoxynucleotides (dNTPs), process known as reverse transcription. In order to detect the enzyme activity in vitro fluorometric assays were carried out, with unpurified recombinant protein and fluorescently marked nucleotides as part of the substrate (Cy3-dCTP). Conditions for the protein activity were established at 5µg/reaction of total RNA and 2µg/reaction of oligo-dT_12-18, which gave a 43.6% of incorporation of fluorescent nucleotide (Cy3-dCTP).