ANÁLISIS CLÍNICO Y MOLECULAR DE UNA PACIENTE CON PENTASOMIA DEL CROMOSOMA X.

INTRODUCCIÓN.

La Pentasomia del X (49,XXXXX) es una alteración cromosómica poco frecuente, que afecta a mujeres y fue descrita en 1963 por Kesaree y Wooley. Hasta la fecha se han reportado menos de 30 casos en la literatura. Se presenta un caso de pentasomia del cromosoma X, y mediante biología molecular se determino el origen materno de los cromosomas X adicionales.

CASO CLÍNICO:

Paciente de 28 meses, con talla baja proporcionada, braquicefalia, fascies característica, genitales externos femeninos con labios mayores hipoplásicos, braquidactilia, clinodactilia bilateral del quinto dedo, luxación de rodilla derecha, deformidad en varo.

Se realizó cariotipo en sangre periférica que reportó un complemento cromosómico 49,XXXXX.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Se realizó extracción de ADN y PCR para la amplificación de ocho microsatélites o STRs tetra y dinucleotídicos situados a lo largo del cromosoma X. Los productos amplificados se analizaron en el secuenciador ALF EXPRESS. Con la  información alélica se realizó la construcción del haplotipo y el análisis de dosis génica mediante la determinación del área bajo la curva.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

El análisis de los 8 STRs realizados en la paciente y sus padres, permitió establecer que los cromosomas X extras corresponden a información alélica heredada de la madre. Se analizan los resultados y los eventos que se han documentado como relacionados con los fenómenos de no disyunción.

CONCLUSIÓN:

El origen de la doble no disyunción que generó la pentasomia es materna, en donde un ovulo tetrasómico, con cuatro copias de cromosoma X fue fecundado con un espermatozoide monosómico normal.

Clinical and Molecular Analysis of a Patient with X-Chromosome Pentasomy.

HEIDI ELIANA MATEUS ARBELAEZ¹, M.D., M.Sc.; CLAUDIA TAMAR SILVA ALDANA¹, M.Sc.; NORA CONSTANZA CONTRERAS BRAVO¹, M.Sc.; SANDRA YANETH OSPINA², M.D., M.Sc.; DORA JANETH FONSECA MENDOZA¹, M.Sc. ¹ Unidad de Genética, Instituto de Ciencias Básicas, Universidad del Rosario. Carrera 24 # 63C-69. Tel.: 347 45 70, ext. 266. Fax: 310 12 75. Bogotá, Colombia. hmateus@urosario.edu.co ² Hospital de San José. Bogotá, Colombia. solospina@yahoo.es

Presentado 10 de marzo de 2009, aceptado 2 de septiembre de 2009, correcciones 15 de octubre de 2009.

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RESUMEN

Introducción: la Pentasomia del X (49,XXXXX) es una alteración cromosómica poco frecuente, que afecta a mujeres y fue descrita en 1963 por Kesaree y Wooley. Hasta la fecha se han reportado menos de 30 casos en la literatura. Se presenta un caso de pentasomia del cromosoma X, y mediante técnicas de biología molecular (microsatélites) se determino el origen materno de los cromosomas X adicionales. Caso clínico: paciente de 28 meses, con talla baja proporcionada, braquicefalia, fascies característica, genitales externos femeninos con labios mayores hipoplásicos, braquidactilia, clinodactilia bilateral del quinto dedo, luxación de rodilla derecha, deformidad en varo. Se realizó cariotipo en sangre periférica que reportó un complemento cromosómico 49,XXXXX. Materiales y métodos: se realizó extracción de ADN y PCR para la amplificación de ocho microsatélites o STR’s tetra y dinucleotídicos situados a lo largo del cromosoma X. Los productos amplificados se analizaron en el secuenciador ALF EXPRESS. Con la información alélica se realizó la construcción del haplotipo y el análisis de dosis génica mediante la determinación del área bajo la curva. Resultados y discusión: el análisis de los ocho STR’s realizados en la paciente y sus padres, permitió establecer que los cromosomas X extras corresponden a información alélica heredada de la madre. Se analizan los resultados y los eventos que se han documentado como relacionados con los fenómenos de no disyunción. Conclusión: el origen de la doble no disyunción que generó la pentasomia es materna, en donde un ovulo tetrasómico, con cuatro copias de cromosoma X fue fecundado con un espermatozoide monosómico normal.

Palabras clave: aberraciones cromosómicas sexuales, Cromosoma X, S. pentaX, No disyunciones, haplotipos.

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ABSTRACT

Introduction: Pentasomy X is a rare chromosomal disorder which affects women. It was first described in 1963 by Kesaree and Wooley. Up to date, less than 30 cases have been reported. We report a case of 28 month old female patient with clinical features of Pentasomy X. Cytogenetic and molecular analysis revealed that her karyotype was 49,XXXXX and that the additional X chromosomes were maternal in origin. Case report: We present a 28 month old female patient with short stature, brachycephaly, characteristic facies, with female external genitalia, hypoplasic labia majora, brachydactyly, bilateral clinodactyly of the fifth finger, dislocation of the right knee with genu varum deformities. Chromosome analysis revealed a karyotype of 49, XXXXX. Materials and methods: We performed DNA extraction and subsequent PCR amplification of 8 microsatellites (STR’s) throughout the X chromosome. The amplified products were analyzed in the ALF EXPRESS sequencer. The allelic information obtained was used to construct haplotypes and to analyze gene dosage through the determination of the area under the curve. Results and discussion: Through the analysis of eight STR’s in the patient and her parents we were able to determine that the extra X chromosomes were inherited from the mother. We analyze our results and other well documented events that have been related to non-disjunctions. Conclusion: We confirmed through molecular analysis of X-linked DNA markers that the aneuploidy developed from two maternal non-disjunctions.

Key words: Sex Chromosome Abnormalities, Diagnosis, DNA, Medical Genetic, Nondisjunctions, Microsatellite Repeats

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La Pentasomía del X (49,XXXXX) es una alteración cromosómica poco frecuente, que afecta solamente a las mujeres y fue descrita por primera vez en el hombre en 1963 por Kesaree y Wooley (Kesaree y Wooley, 1963). Hasta la fecha se han reportado menos de 30 casos en la literatura (Kesaree y Wooley, 1963, Ricci et al., 1968; Zajaczkowska et al., 1970; Sergovich et al., 1971; Yamada y Neriishi, 1971; Larget-Piet et al., 1972; Giovannucci-Uzielli et al., 1975; Kaufman et al., 1975; Mulcahy y Stevens 1975; Tumba et al., 1977;; Dryer etal., 1979; Schroeter etal., 1980; Monheit etal., 1980; Funderburk et al., 1981; Zhang et al., 1982; Fragoso et al., 1982; Gómez-Valencia et al., 1989; Deng et al., 1991; Nakano et al., 1992; Martini et al., 1993; Leal et al., 1994; Sijmons et al., 1995; Myles et al., 1995; Linden et al., 1995; Cho et al., 2004) y aunque su incidencia real es desconocida, se presume similar a la del síndrome 49,XXXXY, que ocurre en uno de cada 85.000 nacidos vivos (Sergovich etal. 1971). Esta pentasomía se caracteriza clínicamente por talla baja, retardo mental moderado a severo, microcefalia y otras malformaciones cráneo-faciales. Es también conocido con el nombre de síndrome Penta-X.

Los marcadores usados son los microsatélites o STR’s (Short Tandem Repeats), que corresponden a segmentos cortos repetidos en tandem que varían en tamaño de acuerdo con una unidad básica de repetición y los hay desde dos hasta nueve repeticiones; en el presente estudio se analizaron ocho STR’s distribuidos a lo largo del cromosoma X o dispuestos dentro del gen de la distrofina, situado en Xp21, que mostraron unidades de variación de dos o cuatro nucleótidos. Cada STR presenta varios alelos que permiten construir haplotipos e identificar la información genética del cromosoma X paterno, de cada uno de los X maternos y así reconocer en el hijo, mediante análisis de dosis génica, en que cromosoma parental ocurrió el evento de no disyunción. En este artículo presentamos un caso de pentasomia del cromosoma X, en el cual se iden-tificó mediante biología molecular el origen materno de los cromosomas X adicionales.

La paciente de 28 meses, es el producto de la primera gestación de padres no relacionados, madre de 36 años y padre de 38 años. El embarazo fue normal, controlado, sin complicaciones, parto vaginal eutosico, peso al nacer: 2.100 g (<Percentil 3), talla de 48 cm (Percentil 25). Se evidencia retardo en su desarrollo psicomotor, siendo sedente a los siete meses, gateó a los 11 meses y caminó a los 18 meses. Desde los 15 meses pronuncia bisílabos, actualmente tiene un vocabulario de menos de cinco palabras. Desde los primeros meses de vida ha presentado cuadros gripales recurrentes, síndrome coqueluchoide y prurigo estrófulo persistente.

Al examen físico se encuentra peso 10,5 kg (<Percentil 3), talla baja proporcionada de 80 cm (<Percentil 3), perímetro cefálico 46 cm (<Percentil 3), braquicefalia, fisuras mongoloides, epicanto, telecanto, estrabismo convergente, puente nasal ancho, nariz bulbosa, filtrum prominente, labio superior en arco de cupido, paladar integro, erup-ción dental normal, pabellones auriculares de implantación normal, no se observan fosetas o apéndices preauriculares. Cuello corto y ancho, implantación baja del pelo en la nuca. Tórax simétrico con teletelia y pezones hipoplásicos. Ruidos cardiacos rítmicos, sin soplos, ruidos respiratorios normales. Abdomen blando, globoso, sin viscerome-galias. Genitales externos femeninos con labios mayores hipoplásicos, manos pequeñas, braquidactilia, clinodactilia bilateral del quinto dedo, luxación de rodilla derecha, deformidad en varo e hiperlaxitud articular (Fig. 1).

Se realizó cariotipo en sangre periférica, en donde se analizaron 25 metafases, reportó un complemento cromosómico 49,XXXXX (Fig. 2).

ESTUDIO MOLECULAR

Se tomaron muestras de sangre periférica a la paciente y sus padres, para extracción de ADN mediante el Kit GFX (Invitrogen). Se realizó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la amplificación de ocho microsatélites o STR’s tetra y dinucleotídicos, cuatro situados a lo largo del cromosoma X y cuatro dentro del gen de la Distrofina (Xp21), (Fig. 3). La Reacción en Cadena de la Polimerasa para los STR’s DXS6800, DXYS218, DXS990 y DXYS154 se hizo bajo las siguientes condiciones de amplificación: desnaturalización inicial a 94 °C por 5’, 40 ciclos de desnaturalización parcial de 45’’, alineamiento a 61 °C 45’’, extensión a 72 °C 45’’ y extensión final a 72 °C por 5’. La mezcla de reacción se realizó a un volumen final de 20 ml con buffer de PCR 1X, primers 2,5 mM, MgCl2 1,5mM, dNTPs 0,04 mM y 1,2 U de Taq DNA polimerasa. Los primers usados en la amplificación fueron los descritos en OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim). La amplificación de los STR intragénicos del gen de la Distrofina DXS1214, DXS1237, DXS205 y DXS1219, se realizo con primers descritos en la pagina http://www.dmd.nl/DMD_mPCR.html (Leiden Muscular Dystrophy Data pages), bajo condiciones estandarizadas en nuestro laboratorio (Fonseca et al., 2008). Todas las reacciones de PCR fueron realizadas en el Termociclador MJ Research. En cada montaje se uso un control negativo de amplificación en donde se agregaba agua en vez de ADN con el objeto de verificar la presencia de posibles contaminantes de PCR. Los productos amplificados fueron sembrados sobre geles de poliacrilamida desnaturalizante (Reprogel® Pharmacia) y corridos en electroforesis vertical durante 200 minutos a 1.500 V, 60 mA y 50 °C en el secuenciador semiautomático ALF EXPRESS (Pharmacia®). El análisis se realizó con las aplicaciones ALFWin y Allelinks, que permitieron la asignación de los alelos, según el tamaño en pares de bases de los productos obtenidos para cada individuo analizado, teniendo como control de asignación los pesos reportados en la literatura para cada alelo de cada STR. En cada corrido se uso un marcador externo de 50-500 pb (Amersham) y uno interno de 300 pb (Amersham) que permitían asignar inequívoca-mente el alelo para cada persona. La información alélica fue organizada y analizada para cada miembro de la familia y se realizó la construcción del haplotipo para cada uno (Fig. 4). Acorde a los resultados obtenidos en los electroforetogramas los resultados para la hija con la pentasomia se dividían en monoalelico: cuando solo se observaba un pico de amplificación (Fig. 5A), dialélico: cuando se apreciaron dos picos de amplificación (Fig. 5B-C) y trialélico cuando aparecían tres (Fig. 5D). La dosis génica para la hija era determinada automáticamente por el secuenciador, que tenía en cuenta el área bajo la curva del producto amplificado para cada STR analizado, este cálculo permitió establecer la relación de dosis, de tal forma que la condición monoalélica corresponde a cinco dosis iguales del mismo alelo, la dialélica a una relación uno: cuatro (paterna: materna) y la trialélica uno: dos:dos (paterna:materna).

Basándose en los haplotipos y en la dosis génica obtenida para cada alelo en la hija con la pentasomia se determinó el origen parental de la doble no disyunción.

RESULTADOS

El análisis de los ocho STR’s realizados en la paciente con la pentasomia y sus padres, permitió establecer el haplotipo para cada uno de ellos (Fig. 4). Los sistemas DXS6800, DXSY218, DXSY154, DXS990 a lo largo del X y DXS205 del gen de la distrofina indicaron homocigocidad en la madre, lo cual llevó a que la hija afectada tenga un patrón dialélico, con cuatro dosis de estos alelos maternos y una dosis del alelo paterno (Fig. 5B-C). El sistema DXS1214 indico que la información alélica del padre y la madre era la misma, y así la hija afectada recibió cinco dosis del mismo alelo para este STR (Fig. 5A). Los sistemas DXS1237 y DXS1419, indicaron que la madre era heterocigota para estas secuencias y la afectada muestra tres picos de amplificación, en donde cada alelo materno esta en doble copia y el paterno en una copia simple (Fig. 5D).

El haplotipo de la paciente analizada indicó para todos los marcadores analizados una dosis génica del alelo materno heredado superior al alelo paterno. En los cinco STR en los que la madre era homocigota para el STR analizado, la hija era dialélica, con una relación de dosis génica de la información paterna y materna de uno:cuatro respectivamente; en el STR DXS1214 el padre y la madre portaban el mismo alelo, indicando que la hija era monoalélica con una dosis de cinco copias del mismo alelo de este marcador, para el caso de los STR DXS1219 Y DXS1237, la madre es heterocigota, y su hija trialélica con dosis génica de información paterna y materna de uno: dos: dos respectivamente.

Los resultados de los STR’s se corroboran con los análisis de dosis génica y permiten determinar que el origen de la doble no disyunción ocurrió en la madre generando un ovulo tetrasómico, con cuatro copias de cromosoma X, que fue fecundado con un espermatozoide monosómico normal determinando un cigoto con pentasomia del X.

DISCUSIÓN

El presente reporte de caso corresponde a una niña con cariotipo 49,XXXXX correspon-diente a una pentasomia. El cuadro clínico es consistente con lo reportado previamente en la literatura, bajo peso y talla al nacer, la cual es en promedio de 2.312 g (Martini et al., 1993) con facies característica dada por microcefalia, fisuras mongoloides, epicanto, telecanto, puente nasal deprimido, cuello corto y otros signos como hiperlaxitud y múl-tiples luxaciones, manos pequeñas y clinodactilia, los cuales estaban presentes en nuestro caso índice. Sin embargo no cursa con sinostosis radioulnar (presente en cerca del 50% de los casos reportados) (Martini et al., 1993) ni problemas dentales, también relativa-mente comunes en este síndrome.

El análisis molecular realizado con los STR’s mencionados, indicó en cuatro de ellos ho-mocigocidad materna, para este caso a pesar de una aparente no informatividad, la comparación de la dosis génica de madre e hija permite establecer una relación de disomia vs. tetrasomia respectivamente. Los STR’s heterocigotos en la hija resultaban en un patrón trialelico con una relación genica 2:2:1. Lo anterior indica que ambas condi-ciones de cigocidad son informativas y permiten establecer que el origen de los cromosomas X extras fue materno; resultado de la fusión de un óvulo tetrasómico producto de la no disyunción en meosis I y II de los cromosomas X con un espermatozoide mono-sómico normal (Fig. 6). Solo un STR (DXS1214) fue homocigoto en la madre y hemicigoto en el padre, lo que no permitiría con su análisis individual determinar el origen parental que genero la aneuploidia.

Aunque la no disyunción es la principal causa de anormalidades cromosómicas, las dobles no disyunciones sucesivas durante la ovogénesis son un fenómeno mucho menos frecuente, probablemente menor a 10-6 (Saldanhai, 1986). Estos eventos se correlacionan con edad materna avanzada, deterioro, falla o envejecimiento de proteínas de las fibras del huso, las cohesinas y las proteínas que hacen parte del punto de chequeo o checkpoint meiótico (Warren et al., 1987 ; Sherman et al., 1991; Hassold y Sherman, 2000).

El otro mecanismo que podría originar esta pentasomia (49,XXXXX) corresponde a un evento de nos disyunción en meiosis II paterna y en meiosis I y II materna, siempre y cuando en esta ultima la separación de las cromatides genere una celula con una y otra con tres cromosomas; esta última al ser fecundada con un espermatozoide disomico para el cromosoma X generará esta alteración numerica.

La razón del aumento de errores meioticos en los ovocitos dependiente de la edad de la mujer se ha atribuido a: La acumulación de alteraciones sobre el ovocito o su entorno a lo largo del tiempo, la disminución de las proteínas que mantienen unidas las cromátidas hermanas (Jeffreys et al., 2003; Warburton, 2005), los checkpoints meióticos (Zwick et al., 1999), la acumulación de daños dependientes del medio ambiente sobre la maquinaria meiótica a lo largo del tiempo o cambios genéticos como deleciones mitocondriales (Schon et al., 2000; Van Blerkom, 2004; Warburton, 2005).

También se han relacionado los eventos no disyuncionales con fallas en la recombinación dadas por una no recombinación que genera bivalentes aquiasmáticos con alto riesgo de mala segregación de los cromosomas homólogos durante la meiosis I. Pueden también generarse bivalentes o intercambios pericentroméricos que conducen a fallas durante la segregación de las cromátides hermanas en meiosis II, ya que los quiasmas (puntos de contacto entre los homólogos) proximales predisponen a que se genere un -enredo- o -enganche- entre los cromosoma homólogos durante la Meiosis I, el bivalente pasa intacto a la metafase II, generando un gameto disómico; además la presencia de un quiasma proximal puede interferir con la cohesión normal entre las cromátides hermanas generando una separación prematura de las mismas en meiosis I, si las cromátides se van unidas o migran al mismo polo durante la MI, habrá un chance del 50% de segregarse juntas en la MII, generando un aparente error en MII (Fig. 6) o eventualmente un doble error generando gametos trisómicos y tetrasómicos.

Adicionalmente, los errores no disyuncionales se han asociado con degradación temprana de las proteínas cohesinas, particularmente con rec 8 y con las cohesinas ORD quienes median el contacto físico entre las cromátides y juegan un papel clave en la estabilización de los quiasmas (Pellestor, 2004). En cuanto a las no disyunciones y a las fallas en las proteínas que hacen parte del punto de chequeo (checkpoint) se ha reportado una disminución en los niveles de proteínas especializadas tales como MAD2 y BUB1 las cuales están directamente relacionadas con la edad materna con y el aumento en la incidencia de aneuploidías (Taylor et al., 2004; Steuerwald et al., 2001).

De esta manera, se puede apreciar que hay diversidad de causas para las no disyunciones, más allá de la edad materna, factor que aunque muy importante, no es el único que determina la formación de óvulos con información extra que lleve a aneuploidias.

Con la aplicación de análisis de ADN polimórfico informativo se ha logrado determinar el origen parental de la no disyunción que origina la formación de aneuploidias como la descrita en el presente reporte de caso. Este tipo de abordaje ha permitido determinar que la gran mayoría de pentasomías en cromosomas sexuales corresponden a eventos no disyuncionales que involucran el mismo padre, siendo este en todos los casos reportados hasta ahora en la literatura, de origen materno, esta misma observación se ha hecho para otras aneuploidias, lo que ha permitido hipotetizar que esta alta tasa de no disyunciones maternas obedece a que la impronta genómica de loci específicos sobre ciertos cromosomas determina la supervivencia del feto afectado; así no disyunciones paternas de cromosomas sexuales que llevarían a una pentasomía como la descrita seria totalmente incompatible con la vida (Muller et al., 2000).

En las aneuploidias que involucran el cromosoma X como el síndrome Turner (45,X) y Klinefelter (47,XXY), el origen parental ha sido asociado a manifestaciones fenotípicas particulares, las no disyunciones de origen paterno influyen en el desarrollo psicomotor, crecimiento y habla, lo que ha llevado a pensar que la impronta genética afecta la expresión fenotipica en individuos con copias anormales del cromosoma X (Stemkens et al., 2006; Iitzuka et al., 2001).

La posibilidad de sobrevivencia de las pentasomías en los cromosomas sexuales en relación a autosomas, es favorecida por el fenómeno de inactivación del cromosoma X, lo cual permite que el nivel de sobreexpresión de los genes dispuestos sobre este, sea modulado. Bajo esta hipótesis, la expresión fenotípica en los pacientes con esta anor-malidad cromosómica estaría dada por el hecho que 19% de los genes sobre el cromosoma X escapan al fenómeno de inactivación, produciéndose una sobreexpresión elevada (cuatro dosis extras) de estos (Bacú, 2007).

AGRADECIMIENTOS

Al paciente y su familia por toda su colaboración. A Lida Triviño, auxiliar de laboratorio y a la Dra. Rosana Sánchez, por su invaluable aporte a la realización de este estudio.

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