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Producción de la proteína de choque térmico HSC70 Recombinante en Escherichia Coli BL21 (DE3) para generar anticuerpos policlonales
Production of recombinant heat shock protein HSC70 in escherinchia coli BL21(DE3) to obtain polyclonal antibodies
Palabras clave:
formación de anticuerpos, proteínas de choque térmico HSC70, Escherichia coli. (es)antibody formation, HSC70 heat-shock proteins, Escherichia coli (en)
Antecedentes. Los organismos vivos responden al estrés aumentando la síntesis de proteínas. El estrés por choque térmico ha sido el más estudiado y las proteínas que se inducen, se han denominado genéricamente como proteínas de choque térmico.
Objetivo.En este trabajo se establecieron las condiciones óptimas de producción de la proteína HSC70, expresada en E.coli BL21 (DE3) y de los anticuerpos policlonales que permitan identificarla.
Material y métodos. Mediante varios ensayos se establecieron las concentraciones óptimas del agente inductor isopropil- -D-thiogalactopiranosido (PTG), del inóculo bacteriano, de empleo de los plásmidos de expresión pET-3a y pET-28a (+); y el método más eficiente para la recuperación de las formas soluble o insoluble de la proteína y de anticuerpos policlonales que la identifiquen.
Resultados. Encontramos que el inóculo de cinco colonias con IPTG (2mM) en tubos con cinco mililitros de medio modificado e incubadas por 24 horas a 37°C con agitación constante (200 r.p.m) y tratamiento de sonicación, produce el mejor rendimiento de HSC70. La calidad de la proteína inducida se estableció mediante "Western blotting".
Conclusión. La proteína recombinante así obtenida permitió, generar anticuerpos policlonales que a su vez permiten detectar la proteína HSC70 natural en la membrana citoplasmática de diferentes células por inmunofluorescencia, en ELISA, en Western Blot y en pruebas de bloqueo de infección de rotavirus.
Background. Live organisms respond against stressing conditions raising the production of stress proteins. The heat shock stress is a very well kwon condition that produces heat shock proteins.
Objective. In this work we determined the optimum conditions to produce HSC70 protein in E. coli BL12 (DE3) under stress conditions, and the best way to obtain its polyclonal antibodies.
Materials and methods. The best concentrations for isopropyl- β -D-thiogalactopyranoside (IPTG), bacterial inoculum, type of vector plasmid used pET-3a and pET28a (+) and recovery method of soluble and insoluble forms of HSC70 protein and its polyclonal antibodies were established.
Results .Five-colony bacteria inoculum, 2 mM IPTG and sonication treatment were found as best conditions with either expression plasmid. We also produced polyclonal antibodies against the HSC70 protein by inoculating rabbits with this purified protein.
Conclusions.Specificity and titer of antiserum was determined by ELISA, Western blotting and immunofluorescence assays. Antiserum was also tested by its inhibition ability of rotavirus infection.
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