Evaluación de métodos de extracción para la obtención del ácido giberélico en semillas germinadas de maíz (Zea mays L.)
Comparison of different extraction methods for giberelic acid obtention from corn (Zea mays L.) germinated seeds
DOI:
https://doi.org/10.15446/rev.colomb.quim.v46n2.63015Palabras clave:
Fitohormonas, extracción dinámica con disolvente asistido por sonicación, lixiviación, cromatografía líquida de alta eficiencia (es)Phytohormone, DSASE, lixiviation, HPLC, Zea mays L (en)
Corn (Zea mays L.) is the second most cultivated cereal in the world and is use as raw material for different kind of industries. To date no reports about obtaining giberellic acid (GA3) from corn have been found. In the present study two methods for extracting solid samples were evaluated: lixiviation and dynamic sonication-assisted solvent extraction (DSASE), for obtaining giberellic acid from corn germinated seeds. In lixiviation, the physical method (agitation and sonication), solvent, and time were the parameters analyzed; while in DSASE the variables were: solvent, flow, and time. The most efficient technique was DSASE employing acetonitrile-formic acid 5% (80:20, v:v) as solvent at a flow of 0.4 mL/min for 25,0 min, obtaining a concentration 30.012 mg/kg giberellic acid. The identification and quantification were performed by high performance liquid chromatography (HPLC) with diode array detector (DAD). These results showed that dynamic sonication-assisted solvent extraction (DSASE) is a novel and powerful alternative technique for obtaining giberellic acid, because of its high efficiency; low solvent consumption and simplicity in obtaining the extract.
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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Aplicada y Analítica
Evaluación de métodos de extracción para la obtención del ácido giberélico en semillas germinadas de maíz (Zea mays L.)
Comparison of different extraction methods for giberelic acid obtention from corn (Zea mays L.) germinated seeds
Avaliação de diferentes metodologias de extração para a obtenção do ácido giberélico em sementes germinadas de milho (Zea mays L.)
Evaluación de métodos de extracción para la obtención del ácido giberélico en semillas germinadas de maíz (Zea mays L.)
Revista Colombiana de Química, vol. 46, núm. 2, 2017
Universidad Nacional de Colombia
Recepción: 27 Octubre 2016
Aprobación: 15 Febrero 2017
Resumen: El maíz (Zea mays L.) es el segundo cereal de mayor cultivo a nivel mundial el cual es empleado como materia prima en diferentes industrias. Hasta el momento no se han encontrado reportes de la obtención del ácido giberélico (GA3) en esta planta. En el presente trabajo se compararon los métodos de extracción sólido-líquido por lixiviación y la extracción dinámica con disolvente asistida por sonicación (DSASE) para la obtención del GA3 a partir de semillas germinadas de maíz. Los factores trabajados en la extracción por lixiviación fueron el método físico, el solvente y el tiempo, mientras que los parámetros por DSASE fueron el flujo, el solvente y el tiempo. La mayor concentración del GA3 se obtuvo con el método DSASE (30,012 mg/kg), empleando como solvente acetonitrilo-ácido fórmico 5% (80:20, v:v) a un flujo de 0,4 mL/min y un tiempo de extracción de 25,0 min. La identificación y la cuantificación del GA3 se realizó mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) con detector de arreglo de diodos (DAD). Estos resultados evidenciaron que la DSASE es una alternativa novedosa para la obtención del GA3, dada su alta eficiencia, el bajo consumo de solvente y su simplicidad en la obtención del extracto.
Palabras clave: fitohormonas, DSASE, lixiviación, HPLC, Zea mays L.
Abstract: Corn (Zea mays L.) is the second most cultivated cereal in the world and is use as raw material for different kind of industries. To date no reports about obtaining giberellic acid (GA3) from corn have been found. In the present study two methods for extracting solid samples were evaluated: lixiviation and dynamic sonication-assisted solvent extraction (DSASE), for obtaining giberellic acid from corn germinated seeds. In lixiviation, the physical method (agitation and sonication), solvent, and time were the parameters analyzed; while in DSASE the variables were: solvent, flow, and time. The most efficient technique was DSASE employing acetonitrile-formic acid 5% (80:20, v:v) as solvent at a flow of 0,4 mL/min for 25,0 min, obtaining a concentration 30,012 mg/kg giberellic acid. The identification and quantification were performed by high performance liquid chromatography (HPLC) with diode array detector (DAD). These results showed that dynamic sonication-assisted solvent extraction (DSASE) is a novel and powerful alternative technique for obtaining giberellic acid, because of its high efficiency; low solvent consumption and simplicity in obtaining the extract.
Keywords: Phytohormone, DSASE, lixiviation, HPLC, Zea mays L.
Resumo: O milho (Zea mays L.) é o segundo cereal mais cultivado no mundo e é usado como matéria-prima em diferentes indústrias. Até a data não foram encontrados estudos da obtenção do ácido giberélico (GA3) neste cereal. Este trabalho teve como objetivo a comparação da metodologia de extração sólido-líquido por lixiviação e a metodologia de extração dinâmica com dissolvente assistida por sonicação (DSASE) para a obtenção do ácido giberélico a partir de sementes germinadas de milho (Zea mays L.). Na extração por lixiviação foram avaliados diferentes parâmetros: o método físico, o solvente e o tempo; e na metodologia DSASE estes parâmetros foram: o solvente, o fluxo e o tempo. A maior concentração de ácido giberélico (GA3) foi obtida com a metodologia DSASE, usando como solvente acetonitrila-ácido fórmico 5% (80:20), fluxo de 0,4 mL/min e tempo de extração de 25,0 min. A identificação e a quantificação do GA3 foi realizada mediante cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção de arreglo de diodos (DAD). Os resultados evidenciaram que a DSASE foi uma excelente alternativa para a obtenção do ácido giberélico, por apresentar alta eficiência, pouco consumo de solvente e ser uma técnica simples para a obtenção do extrato.
Palavras-chave: fitohormônios, DSASE, HPLC, Zea mays L.
Introducción
El ácido giberélico (GA3) (Figura 1) es una fitohormona que hace parte de la familia de los diterpenos tetracíclicos de naturaleza ácida ( 1 ). Este ejerce efectos diversos en el crecimiento y desarrollo de la planta, promueve la germinación de las semillas que se encuentran en estado de dormancia, la elongación del tallo, el brote de las yemas y el desarrollo de los frutos ( 2 , 3 ). La acción del GA3 en el crecimiento de los tejidos puede estar regulada por la modulación celular de sus concentraciones, por la habilidad de la célula para responder al estímulo de esta fitohormona, o por ambas ( 4 ).
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El GA3 ha sido obtenido a partir de diferentes tejidos vegetales utilizando principalmente métodos de extracción sólido-líquido, procesos en los cuales se extraen uno o varios solutos de un sólido mediante la utilización de un disolvente líquido. Ambas fases entran en contacto íntimo y el soluto o los solutos pueden difundirse desde la matriz sólida a la fase líquida, lo cual produce la separación de los componentes constitutivos de la muestra ( 5 ). Para llevar a cabo la lixiviación se han utilizado diferentes tipos de disolventes tales como el metanol frío ( 6 – 9 ), el metanol acuoso (80% v/v) ( 10 , 11 ), el metanol acuoso acidificado con ácido fórmico (0,05% v/v) ( 12 ), el acetato de etilo ( 13 , 14 ), el acetonitrilo acidulado con ácido fórmico (5% v/v) ( 15 , 16 ) y mezclas de isopropanol-ácido acético ( 17 , 18 ). El período de extracción ha sido variable debido a que se han empleado tiempos cortos, una o dos horas ( 6 , 16 , 19 , 20 ), hasta períodos prolongados, 24 o 48 h ( 21 – 23 ).
Otro método moderno de extracción sólido-líquido es la extracción dinámica con disolvente asistida por sonicación (DSASE). En este proceso la muestra es depositada en una celda por la cual hay paso continuo de solvente fresco y al mismo tiempo se aplican vibraciones acústicas con frecuencias por encima de 20 kHz, que promueven la transferencia de analitos desde la matriz en estudio hasta el disolvente. Esta técnica emplea los mismos solventes que la lixiviación, pero los tiempos de extracción y las cantidades de muestra son inferiores ( 24 ). La técnica de DSASE se ha empleado en la extracción de analitos como ésteres organofosforados, blanqueadores, colorantes y polifenoles, empleando flujos de solvente desde los 0,2 hasta 1,0 mL/min, con porcentajes de recuperación que se encuentran por encima del 85% ( 25 – 27 ).
Por otro lado, la cromatografía se encuentra entre las técnicas más empleadas para la identificación y la cuantificación del GA3, que tiene como ventajas mayor eficiencia en la separación y alta especificidad ( 11 , 13 , 28 ). La cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC, por sus siglas en inglés) es preferida sobre la cromatografía de gases ya que esta última requiere la derivatización previa del analito, lo cual aumenta el grado de complejidad del análisis ( 29 – 31 ).
Ahora bien, el GA3 ha sido evaluado por su importancia en la germinación y desarrollo de las plantas en diferentes especies vegetales como Arabidopsis ( 15 ), fresno blanco ( 21 ) y arroz ( 32 ). Sin embargo, no se han encontrado reportes de esta fitohormona en cereales como el maíz, el segundo cultivo más importante del mundo después del trigo ( 33 ). El maíz se cultiva en más de 140 millones de hectáreas con una producción anual de más de 580 millones de toneladas métricas. Toda la planta puede ser aprovechada y las aplicaciones posibles de este cereal incluyen alimento, forraje o materia prima para diferentes industrias ( 34 ). Adicionalmente, es de gran utilidad investigativa debido a su corto tiempo de germinación, lo que permite hacer diversidad de ensayos en los que se miden múltiples variables permitiendo alcanzar conclusiones de diferente índole ( 33 ).
El objetivo de este trabajo fue comparar los métodos de extracción por lixiviación y la extracción con disolvente asistida por ultrasonido (DSASE), con el fin de determinar el protocolo más eficiente para la obtención del ácido giberélico (GA3) a partir de semillas germinadas de maíz (Zea mays L.).
Materiales y métodos
Reactivos químicos
El estándar del ácido giberélico empleado fue Sigma Aldrich (Sigma, USA); el acetonitrilo y el metanol fueron grado cromatográfico (Fisher Scientific, USA); el acetato de etilo y el ácido fórmico fueron grado analítico (Scharlau, España). El agua fue purificada empleando un sistema Direct-Q (Millipore, USA).
Muestra de estudio
Se usaron semillas de maíz (Zea mays L.) variedad ICA-V305 tipo comercial producidas por la empresa Semillas del Pacífico (Cartago, Colombia). Se seleccionaron semillas sin daños visibles y con forma uniforme, con masa promedio de 0,3878 g ± 0,0002 g y volumen promedio de 0,356 cm3 ± 0,008 cm3.
Preparación de la muestra
Las semillas de maíz previamente seleccionadas se sembraron en cajas Petri (100 x 15 mm), con papel absorbente como soporte. A cada caja se le adicionaron 12,0 mL de agua destilada y se colocaron en una incubadora Incucell de 222 L sin luz, a una temperatura de 30,1 °C ± 0,1 °C. La humedad del sistema fue de 59,00% ± 3,39%. Después de 48 h, las semillas se sacaron de la incubadora y fueron trituradas con ayuda de un molino eléctrico hasta obtener un material muy fino que se guardó en bolsa con sello hermético y en nevera a -20 °C para su posterior extracción ( 35 ).
Método de extracción sólido-líquido (lixiviación)
Para la extracción del GA3 mediante lixiviación se emplearon tres solventes diferentes: solvente B, acetonitrilo–ácido fórmico 5% (80:20) ( 15 ); solvente C, metanol–ácido fórmico 5% (80:20) ( 13 ); solvente D, acetato de etilo ( 32 ). Se emplearon dos tiempos de extracción (1 y 2 h) y dos métodos extractivos diferentes, como se presenta a continuación.
Método I: agitación orbital
La extracción se realizó utilizando el procedimiento planteado por Stirk y colaboradores ( 16 ), con algunas modificaciones. Se adicionaron 20,0 mL del solvente de extracción (solvente B, C o D) a 10,0000 g de la muestra molida y se ésta se puso en un agitador orbital durante una o dos horas. Al cabo del respectivo tiempo, el material se decantó obteniéndose un sobrenadante y un pellet; el primero se retiró y se conservó, mientras que al segundo se le adicionó una nueva porción del respectivo solvente fresco y se reextrajo dos veces más. Los sobrenadantes obtenidos se mezclaron y se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min, obteniéndose un nuevo sobrenadante el cual fue secado en rotaevaporador a 40 ºC. El extracto sólido final se reconstituyó con acetonitrilo hasta un volumen de 5,0 mL previo a su análisis.
Método II: Ultrasonido
Se adicionaron 20,0 mL del solvente de extracción (solvente B, C o D) a 10,0000 g de la muestra molida y la mezcla se puso en un equipo de ultrasonido durante una o dos horas. En el transcurso de la extracción, la temperatura del agua en el baño nunca fue superior a 35 ºC. Al cabo del respectivo tiempo, el material se decantó obteniéndose un sobrenadante y un pellet; el primero se retiró y se conservó, mientras que al segundo se le adicionó una nueva porción del respectivo solvente fresco y se reextrajo dos veces más. Los sobrenadantes obtenidos se unieron y se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min, obteniéndose un nuevo sobrenadante el cual fue secado en rotaevaporador a 40 ºC. El extracto sólido final se reconstituyó con acetonitrilo hasta un volumen de 5,0 mL previo a su análisis.
Método de extracción DSASE
El procedimiento de extracción DSASE se basó en el trabajo previo de López y colaboradores ( 36 ) y se realizó con dos solventes diferentes: solvente B, acetonitrilo–ácido fórmico 5% (80:20) ( 15 ); solvente C, metanol–ácido fórmico 5% (80:20) ( 13 ). Se empleó una celda de extracción de acero inoxidable de 3,0 mL que se llenó con 0,8000 g de muestra y se colocó en el interior de un baño ultrasonido; se controló la temperatura del agua para que nunca fuera superior a 35 ºC. Posteriormente, el sistema se conectó a una bomba peristáltica que controló el flujo del solvente: (B o C) = 0,2 mL/min o 0,4 mL/min a través de la celda; la extracción se realizó por 12,5 min o 25,0 min. Al final de este periodo, se obtuvo el volumen de extracto deseado para cada una de las combinaciones de solvente y flujo.
Condiciones cromatográficas
Para el análisis del GA3, se utilizó un cromatógrafo líquido de alta eficiencia Shimadzu Prominence (USA), equipado con un desgasificador DGU 205 (USA), un detector de arreglo de diodos (DAD) prominence SPD-M20A (USA), un horno Shimadzu CTO-10AS VP (USA) y un automuestreador Shimadzu SIL-10AF (USA). El software empleado para el análisis de los datos fue LCsolution Shimadzu (USA).
Para la identificación y la cuantificación, se empleó la técnica de HPLC con modificaciones de la metodología planteada por Bhalla y colaboradores ( 13 ). Se utilizó una columna Supelcosil™ LC-18-DB 5,0 µm (150 x 4,6 mm). La fase móvil fue acetonitrilo-ácido fórmico 0,01% con gradiente lineal como se detalla a continuación: acetonitrilo-ácido fórmico 0,01 % (10:90) 5,0 min; (70:30) 40,0 min; (10:90) 10,0 min a un flujo de 0,5 mL/min. Una alícuota de 10 µL de cada solución que contenían las giberelinas se inyectó en el cromatógrafo y fueron detectadas a una longitud de onda de 195 nm. Previo al análisis cromatográfico, todas las muestras fueron filtradas a través de membranas (QLS) de 0,2 µm de poro.
Recta de calibración
La recta de calibrado fue elaborada con un estándar del GA3, empleando siete niveles con concentraciones de 1,0; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0 y 50,0 mg/kg. Las soluciones fueron preparadas al disolver el estándar con acetonitrilo.
Análisis estadístico
La optimización de los métodos de extracción por lixiviación y por DSASE se realizó mediante un ANOVA multifactorial, previa verificación de los supuestos (normalidad, homocedasticidad e independencia). Las diferencias estadísticas presentadas entre los tratamientos se analizaron mediante la prueba de rangos múltiples de Tukey. La comparación entre los métodos óptimos de extracción se realizó mediante la prueba t para diferencia de medias independientes con varianzas iguales, previa verificación de tal igualdad por el test F. Los análisis fueron realizados empleando el software Statgraphics centurión XI en modo demo.
Resultados y discusión
Recta de calibración
El modelo obtenido a partir de la recta de calibración explica el 99,51% de la variabilidad en las áreas calculadas en función de la concentración. El límite de detección (LOD) se determinó experimentalmente eligiendo la menor concentración del analito que presentó una señal cromatográfica integrable y el límite de cuantificación (LOQ) se calculó aplicando la expresión . Los resultados de la recta de calibración se muestran en la Tabla 1.
Analito | Ácido giberélico |
β0 | 0,00022 |
SD (β0) | 8,1543 |
β1 | 21,2131 |
SD (β1) | 0,3051 |
R2 | 0,9951 |
LOD (mg/kg) | 0,30 |
LOQ (mg/kg) | 1,00 |
β0 = Intercepto
β1 = Pendiente
SD β0 = Desviación estándar del intercepto
SD β1 = Desviación estándar de la pendiente
Evaluación de las condiciones de la extracción sólido-líquido
En el proceso de lixiviación para la obtención del GA3 a partir de semillas germinadas de maíz, se determinó que los factores método y solvente de extracción tuvieron un efecto estadísticamente significativo sobre la concentración del analito en estudio. Por el contrario, el tiempo de extracción (1 y 2 h) no mostró diferencias en la obtención del GA3. Los resultados obtenidos se presentan con una significancia del 5% (Figura 2).
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El solvente con el cual se obtuvo la mayor extracción del GA3 fue acetonitrilo–ácido fórmico 5% (80:20), obteniéndose una concentración de 11,871 mg/kg para el GA3 (Figura 2). Esto concuerda con los resultados obtenidos por Urbanová y colaboradores ( 15 ), quienes realizaron extracción del GA3 en Arabidopsis thaliana empleando diferentes combinaciones de solvente y obtuvieron como mejor resultado la mezcla de acetonitrilo-ácido fórmico 5%. Vale la pena resaltar que el GA3 es un analito de alta polaridad debido a la presencia de grupos funcionales como carboxilos, hidroxilos y lactonas en su estructura (Figura 1), por lo cual es más afín con solventes con índices de polaridad alta como el acetonitrilo y el metanol ( 37 ). Sin embargo, se podría decir que el acetonitrilo fue mejor en la extracción del GA3, debido a que este solvente es buen aceptor de protones, por lo cual interactúa fácilmente con solutos hidrolixados tales como el GA3, mientras que el metanol es un donador de protones e interacciona mayormente con solutos básicos ( 38 ). También es una ventaja la alta polaridad del acetonitrilo, dado que evita la extracción de compuestos lipídicos que pueden interferir en el proceso de cuantificación ( 39 ).
De los trabajados, el mejor método físico fue la agitación, pues se obtuvo una concentración de 7,531 mg/kg (Figura 2). Este resultado podría estar relacionado con la ausencia de ondas en el solvente extractor que pueden producir la degradación del analito y, por ende, conllevar a una disminución en la concentración del GA3 extraído ( 40 ). De igual manera, el método de agitación no conduce a la disociación de las moléculas de agua por lo cual no se generan radicales hidroxilos que, eventualmente, podrían reaccionar con el analito en estudio ( 41 ).
En resumen, las mejores condiciones evaluadas para extraer el GA3 por medio del método de lixiviación fueron: agitación como método físico, acetonitrilo-ácido fórmico 5% (80:20) como solvente y una hora como tiempo de extracción. Este tiempo fue el elegido dado que permite extraer la misma cantidad de GA3 que al emplear dos horas y, por tanto, fue el tratamiento más eficiente.
Evaluación de las condiciones de la extracción DSASE
Para la extracción por DSASE, los factores flujo y tiempo tuvieron diferencias estadísticamente significativas, mientras que con el factor solvente no se presentaron diferencias estadísticamente considerables, con una significancia del 5% (Figura 3).
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El mejor flujo dentro de los dos niveles evaluados fue 0,4 mL/min, pues permitió una desorción rápida del analito presente en la matriz. Lo anterior debido a que, posiblemente, al haber solvente fresco en tiempos cortos, las interacciones solvente-matriz repetidas veces conllevaron a un equilibrio químico, lo que facilita la obtención de una mayor cantidad de analito extraído ( 24 , 26 ). Finalmente, y dado que el factor tiempo presentó diferencias significativas, siendo 25,0 min el tiempo que permitió una mayor extracción con una concentración del GA3 de 24,93 mg/kg, se escogió este valor como el óptimo para la extracción por DSASE (Figura 3).
Lo anterior permitió determinar que las mejores condiciones evaluadas para la extracción del GA3 por el método de DSASE fueron: acetonitrilo-ácido fórmico 5% (80:20) con 0,4 mL/min de velocidad de flujo y un tiempo de extracción de 25,0 min.
Al comparar los procedimientos de extracción por lixiviación y DSASE, se encontró que las concentraciones medias obtenidas por los dos métodos empleados fueron diferentes con un nivel de confianza del 95%. Estos valores, así como sus desviaciones estándar, se muestran en la Tabla 2.
Método de extracción | Concentración GA3 (mg/kg) |
Lixiviación | 15,062 ± 3,431 |
DSASE | 30,012 ± 4,121 |
En la Tabla 2 se observa que la extracción por DSASE fue la más eficiente, reportándose una concentración del GA3 de 30,012 mg/kg. Esta técnica tiene varias ventajas sobre la extracción por lixiviación dado que presenta bajo consumo de solvente, emplea menor cantidad de muestra, disminuye drásticamente los tiempos de extracción y es menos laboriosa al momento de implementarse ( 25 ). Además, al ser un sistema dinámico la muestra está continuamente expuesta al disolvente fresco, lo cual promueve la transferencia de analitos desde la matriz hasta el disolvente ( 24 ). Todo esto confirma la bondad de esta técnica por lo cual es usada en la actualidad para la obtención de diferentes biomoléculas.
Conclusiones
Se evaluaron las mejores condiciones para la extracción del ácido giberélico (GA3) en semillas de maíz (Zea mays L) por lixiviación y por DSASE. Para la primera metodología los parámetros óptimos fueron agitación, con acetonitrilo-ácido fórmico 5% (80:20) y una hora. Para el segundo proceso las condiciones óptimas fueron acetonitrilo-ácido fórmico 5% (80:20), a un flujo de 0,4 mL/min y 25,0 min.
Se compararon los procedimientos de extracción por lixiviación y por DSASE, siendo este último el mejor método, debido a su alta eficiencia y correspondiéndose con las tendencias de la química verde al utilizar las mínimas cantidades de disolvente y muestra.
Se aplicó por primera vez una metodología de extracción por DSASE para la obtención del GA3 en semillas de maíz, obteniéndose una concentración del analito de 30,012 mg/kg. Este resultado abre el camino para usar esta técnica en estudios posteriores en el campo de los productos naturales.
Agradecimientos
A la vicerrectoría de investigaciones y posgrados de la Universidad de Caldas, por el financiamiento del proyecto 0455216.
Referencias
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Notas de autor
yaned.correa@ucaldas.edu.co
Recibido: 27 de octubre de 2016; Aceptado: 15 de febrero de 2017
Resumen
El maíz (Zea mays L.) es el segundo cereal de mayor cultivo a nivel mundial el cual es empleado como materia prima en diferentes industrias. Hasta el momento no se han encontrado reportes de la obtención del ácido giberélico (GA3) en esta planta. En el presente trabajo se compararon los métodos de extracción sólido-líquido por lixiviación y la extracción dinámica con disolvente asistida por sonicación (DSASE) para la obtención del GA3 a partir de semillas germinadas de maíz. Los factores trabajados en la extracción por lixiviación fueron el método físico, el solvente y el tiempo, mientras que los parámetros por DSASE fueron el flujo, el solvente y el tiempo. La mayor concentración del GA3 se obtuvo con el método DSASE (30,012 mg/kg), empleando como solvente acetonitrilo-ácido fórmico 5% (80:20, v:v) a un flujo de 0,4 mL/min y un tiempo de extracción de 25,0 min. La identificación y la cuantificación del GA3 se realizó mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) con detector de arreglo de diodos (DAD). Estos resultados evidenciaron que la DSASE es una alternativa novedosa para la obtención del GA3, dada su alta eficiencia, el bajo consumo de solvente y su simplicidad en la obtención del extracto.
Palabras clave
fitohormonas, DSASE, lixiviación, HPLC, Zea mays L.Abstract
Corn (Zea mays L.) is the second most cultivated cereal in the world and is use as raw material for different kind of industries. To date no reports about obtaining giberellic acid (GA3) from corn have been found. In the present study two methods for extracting solid samples were evaluated: lixiviation and dynamic sonication-assisted solvent extraction (DSASE), for obtaining giberellic acid from corn germinated seeds. In lixiviation, the physical method (agitation and sonication), solvent, and time were the parameters analyzed; while in DSASE the variables were: solvent, flow, and time. The most efficient technique was DSASE employing acetonitrile-formic acid 5% (80:20, v:v) as solvent at a flow of 0,4 mL/min for 25,0 min, obtaining a concentration 30,012 mg/kg giberellic acid. The identification and quantification were performed by high performance liquid chromatography (HPLC) with diode array detector (DAD). These results showed that dynamic sonication-assisted solvent extraction (DSASE) is a novel and powerful alternative technique for obtaining giberellic acid, because of its high efficiency; low solvent consumption and simplicity in obtaining the extract.
Keywords
Phytohormone, DSASE, lixiviation, HPLC, Zea mays L.Resumo
O milho (Zea mays L.) é o segundo cereal mais cultivado no mundo e é usado como matéria-prima em diferentes indústrias. Até a data não foram encontrados estudos da obtenção do ácido giberélico (GA3) neste cereal. Este trabalho teve como objetivo a comparação da metodologia de extração sólido-líquido por lixiviação e a metodologia de extração dinâmica com dissolvente assistida por sonicação (DSASE) para a obtenção do ácido giberélico a partir de sementes germinadas de milho (Zea mays L.). Na extração por lixiviação foram avaliados diferentes parâmetros: o método físico, o solvente e o tempo; e na metodologia DSASE estes parâmetros foram: o solvente, o fluxo e o tempo. A maior concentração de ácido giberélico (GA3) foi obtida com a metodologia DSASE, usando como solvente acetonitrila-ácido fórmico 5% (80:20), fluxo de 0,4 mL/min e tempo de extração de 25,0 min. A identificação e a quantificação do GA3 foi realizada mediante cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção de arreglo de diodos (DAD). Os resultados evidenciaram que a DSASE foi uma excelente alternativa para a obtenção do ácido giberélico, por apresentar alta eficiência, pouco consumo de solvente e ser uma técnica simples para a obtenção do extrato.
Palavras-chave
fitohormônios, DSASE, HPLC, Zea mays L.Introducción
El ácido giberélico (GA3) (Figura 1) es una fitohormona que hace parte de la familia de los diterpenos tetracíclicos de naturaleza ácida ( 1 ). Este ejerce efectos diversos en el crecimiento y desarrollo de la planta, promueve la germinación de las semillas que se encuentran en estado de dormancia, la elongación del tallo, el brote de las yemas y el desarrollo de los frutos ( 2 , 3 ). La acción del GA3 en el crecimiento de los tejidos puede estar regulada por la modulación celular de sus concentraciones, por la habilidad de la célula para responder al estímulo de esta fitohormona, o por ambas ( 4 ).
El GA3 ha sido obtenido a partir de diferentes tejidos vegetales utilizando principalmente métodos de extracción sólido-líquido, procesos en los cuales se extraen uno o varios solutos de un sólido mediante la utilización de un disolvente líquido. Ambas fases entran en contacto íntimo y el soluto o los solutos pueden difundirse desde la matriz sólida a la fase líquida, lo cual produce la separación de los componentes constitutivos de la muestra ( 5 ). Para llevar a cabo la lixiviación se han utilizado diferentes tipos de disolventes tales como el metanol frío ( 6 – 9 ), el metanol acuoso (80% v/v) ( 10 , 11 ), el metanol acuoso acidificado con ácido fórmico (0,05% v/v) ( 12 ), el acetato de etilo ( 13 , 14 ), el acetonitrilo acidulado con ácido fórmico (5% v/v) ( 15 , 16 ) y mezclas de isopropanol-ácido acético ( 17 , 18 ). El período de extracción ha sido variable debido a que se han empleado tiempos cortos, una o dos horas ( 6 , 16 , 19 , 20 ), hasta períodos prolongados, 24 o 48 h ( 21 – 23 ).
Otro método moderno de extracción sólido-líquido es la extracción dinámica con disolvente asistida por sonicación (DSASE). En este proceso la muestra es depositada en una celda por la cual hay paso continuo de solvente fresco y al mismo tiempo se aplican vibraciones acústicas con frecuencias por encima de 20 kHz, que promueven la transferencia de analitos desde la matriz en estudio hasta el disolvente. Esta técnica emplea los mismos solventes que la lixiviación, pero los tiempos de extracción y las cantidades de muestra son inferiores ( 24 ). La técnica de DSASE se ha empleado en la extracción de analitos como ésteres organofosforados, blanqueadores, colorantes y polifenoles, empleando flujos de solvente desde los 0,2 hasta 1,0 mL/min, con porcentajes de recuperación que se encuentran por encima del 85% ( 25 – 27 ).
Por otro lado, la cromatografía se encuentra entre las técnicas más empleadas para la identificación y la cuantificación del GA3, que tiene como ventajas mayor eficiencia en la separación y alta especificidad ( 11 , 13 , 28 ). La cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC, por sus siglas en inglés) es preferida sobre la cromatografía de gases ya que esta última requiere la derivatización previa del analito, lo cual aumenta el grado de complejidad del análisis ( 29 – 31 ).
Ahora bien, el GA3 ha sido evaluado por su importancia en la germinación y desarrollo de las plantas en diferentes especies vegetales como Arabidopsis ( 15 ), fresno blanco ( 21 ) y arroz ( 32 ). Sin embargo, no se han encontrado reportes de esta fitohormona en cereales como el maíz, el segundo cultivo más importante del mundo después del trigo ( 33 ). El maíz se cultiva en más de 140 millones de hectáreas con una producción anual de más de 580 millones de toneladas métricas. Toda la planta puede ser aprovechada y las aplicaciones posibles de este cereal incluyen alimento, forraje o materia prima para diferentes industrias ( 34 ). Adicionalmente, es de gran utilidad investigativa debido a su corto tiempo de germinación, lo que permite hacer diversidad de ensayos en los que se miden múltiples variables permitiendo alcanzar conclusiones de diferente índole ( 33 ).
El objetivo de este trabajo fue comparar los métodos de extracción por lixiviación y la extracción con disolvente asistida por ultrasonido (DSASE), con el fin de determinar el protocolo más eficiente para la obtención del ácido giberélico (GA3) a partir de semillas germinadas de maíz (Zea mays L.).
Materiales y métodos
Reactivos químicos
El estándar del ácido giberélico empleado fue Sigma Aldrich (Sigma, USA); el acetonitrilo y el metanol fueron grado cromatográfico (Fisher Scientific, USA); el acetato de etilo y el ácido fórmico fueron grado analítico (Scharlau, España). El agua fue purificada empleando un sistema Direct-Q (Millipore, USA).
Muestra de estudio
Se usaron semillas de maíz (Zea mays L.) variedad ICA-V305 tipo comercial producidas por la empresa Semillas del Pacífico (Cartago, Colombia). Se seleccionaron semillas sin daños visibles y con forma uniforme, con masa promedio de 0,3878 g ± 0,0002 g y volumen promedio de 0,356 cm3 ± 0,008 cm3.
Preparación de la muestra
Las semillas de maíz previamente seleccionadas se sembraron en cajas Petri (100 x 15 mm), con papel absorbente como soporte. A cada caja se le adicionaron 12,0 mL de agua destilada y se colocaron en una incubadora Incucell de 222 L sin luz, a una temperatura de 30,1 °C ± 0,1 °C. La humedad del sistema fue de 59,00% ± 3,39%. Después de 48 h, las semillas se sacaron de la incubadora y fueron trituradas con ayuda de un molino eléctrico hasta obtener un material muy fino que se guardó en bolsa con sello hermético y en nevera a -20 °C para su posterior extracción ( 35 ).
Método de extracción sólido-líquido (lixiviación)
Para la extracción del GA3 mediante lixiviación se emplearon tres solventes diferentes: solvente B, acetonitrilo–ácido fórmico 5% (80:20) ( 15 ); solvente C, metanol–ácido fórmico 5% (80:20) ( 13 ); solvente D, acetato de etilo ( 32 ). Se emplearon dos tiempos de extracción (1 y 2 h) y dos métodos extractivos diferentes, como se presenta a continuación.
Método I: agitación orbital
La extracción se realizó utilizando el procedimiento planteado por Stirk y colaboradores ( 16 ), con algunas modificaciones. Se adicionaron 20,0 mL del solvente de extracción (solvente B, C o D) a 10,0000 g de la muestra molida y se ésta se puso en un agitador orbital durante una o dos horas. Al cabo del respectivo tiempo, el material se decantó obteniéndose un sobrenadante y un pellet; el primero se retiró y se conservó, mientras que al segundo se le adicionó una nueva porción del respectivo solvente fresco y se reextrajo dos veces más. Los sobrenadantes obtenidos se mezclaron y se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min, obteniéndose un nuevo sobrenadante el cual fue secado en rotaevaporador a 40 ºC. El extracto sólido final se reconstituyó con acetonitrilo hasta un volumen de 5,0 mL previo a su análisis.
Método II: Ultrasonido
Se adicionaron 20,0 mL del solvente de extracción (solvente B, C o D) a 10,0000 g de la muestra molida y la mezcla se puso en un equipo de ultrasonido durante una o dos horas. En el transcurso de la extracción, la temperatura del agua en el baño nunca fue superior a 35 ºC. Al cabo del respectivo tiempo, el material se decantó obteniéndose un sobrenadante y un pellet; el primero se retiró y se conservó, mientras que al segundo se le adicionó una nueva porción del respectivo solvente fresco y se reextrajo dos veces más. Los sobrenadantes obtenidos se unieron y se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min, obteniéndose un nuevo sobrenadante el cual fue secado en rotaevaporador a 40 ºC. El extracto sólido final se reconstituyó con acetonitrilo hasta un volumen de 5,0 mL previo a su análisis.
Método de extracción DSASE
El procedimiento de extracción DSASE se basó en el trabajo previo de López y colaboradores ( 36 ) y se realizó con dos solventes diferentes: solvente B, acetonitrilo–ácido fórmico 5% (80:20) ( 15 ); solvente C, metanol–ácido fórmico 5% (80:20) ( 13 ). Se empleó una celda de extracción de acero inoxidable de 3,0 mL que se llenó con 0,8000 g de muestra y se colocó en el interior de un baño ultrasonido; se controló la temperatura del agua para que nunca fuera superior a 35 ºC. Posteriormente, el sistema se conectó a una bomba peristáltica que controló el flujo del solvente: (B o C) = 0,2 mL/min o 0,4 mL/min a través de la celda; la extracción se realizó por 12,5 min o 25,0 min. Al final de este periodo, se obtuvo el volumen de extracto deseado para cada una de las combinaciones de solvente y flujo.
Condiciones cromatográficas
Para el análisis del GA3, se utilizó un cromatógrafo líquido de alta eficiencia Shimadzu Prominence (USA), equipado con un desgasificador DGU 205 (USA), un detector de arreglo de diodos (DAD) prominence SPD-M20A (USA), un horno Shimadzu CTO-10AS VP (USA) y un automuestreador Shimadzu SIL-10AF (USA). El software empleado para el análisis de los datos fue LCsolution Shimadzu (USA).
Para la identificación y la cuantificación, se empleó la técnica de HPLC con modificaciones de la metodología planteada por Bhalla y colaboradores ( 13 ). Se utilizó una columna Supelcosil™ LC-18-DB 5,0 µm (150 x 4,6 mm). La fase móvil fue acetonitrilo-ácido fórmico 0,01% con gradiente lineal como se detalla a continuación: acetonitrilo-ácido fórmico 0,01 % (10:90) 5,0 min; (70:30) 40,0 min; (10:90) 10,0 min a un flujo de 0,5 mL/min. Una alícuota de 10 µL de cada solución que contenían las giberelinas se inyectó en el cromatógrafo y fueron detectadas a una longitud de onda de 195 nm. Previo al análisis cromatográfico, todas las muestras fueron filtradas a través de membranas (QLS) de 0,2 µm de poro.
Recta de calibración
La recta de calibrado fue elaborada con un estándar del GA3, empleando siete niveles con concentraciones de 1,0; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0 y 50,0 mg/kg. Las soluciones fueron preparadas al disolver el estándar con acetonitrilo.
Análisis estadístico
La optimización de los métodos de extracción por lixiviación y por DSASE se realizó mediante un ANOVA multifactorial, previa verificación de los supuestos (normalidad, homocedasticidad e independencia). Las diferencias estadísticas presentadas entre los tratamientos se analizaron mediante la prueba de rangos múltiples de Tukey. La comparación entre los métodos óptimos de extracción se realizó mediante la prueba t para diferencia de medias independientes con varianzas iguales, previa verificación de tal igualdad por el test F. Los análisis fueron realizados empleando el software Statgraphics centurión XI en modo demo.
Resultados y discusión
Recta de calibración
El modelo obtenido a partir de la recta de calibración explica el 99,51% de la variabilidad en las áreas calculadas en función de la concentración. El límite de detección (LOD) se determinó experimentalmente eligiendo la menor concentración del analito que presentó una señal cromatográfica integrable y el límite de cuantificación (LOQ) se calculó aplicando la expresión . Los resultados de la recta de calibración se muestran en la Tabla 1.
β0 = Intercepto β1 = Pendiente SD β0 = Desviación estándar del intercepto SD β1 = Desviación estándar de la pendiente:
Tabla 1. Parámetros de la recta de
calibración
Analito
Ácido
giberélico
β0
0,00022
SD
(β0)
8,1543
β1
21,2131
SD
(β1)
0,3051
R2
0,9951
LOD
(mg/kg)
0,30
LOQ
(mg/kg)
1,00
Evaluación de las condiciones de la extracción sólido-líquido
En el proceso de lixiviación para la obtención del GA3 a partir de semillas germinadas de maíz, se determinó que los factores método y solvente de extracción tuvieron un efecto estadísticamente significativo sobre la concentración del analito en estudio. Por el contrario, el tiempo de extracción (1 y 2 h) no mostró diferencias en la obtención del GA3. Los resultados obtenidos se presentan con una significancia del 5% (Figura 2).
El solvente con el cual se obtuvo la mayor extracción del GA3 fue acetonitrilo–ácido fórmico 5% (80:20), obteniéndose una concentración de 11,871 mg/kg para el GA3 (Figura 2). Esto concuerda con los resultados obtenidos por Urbanová y colaboradores ( 15 ), quienes realizaron extracción del GA3 en Arabidopsis thaliana empleando diferentes combinaciones de solvente y obtuvieron como mejor resultado la mezcla de acetonitrilo-ácido fórmico 5%. Vale la pena resaltar que el GA3 es un analito de alta polaridad debido a la presencia de grupos funcionales como carboxilos, hidroxilos y lactonas en su estructura (Figura 1), por lo cual es más afín con solventes con índices de polaridad alta como el acetonitrilo y el metanol ( 37 ). Sin embargo, se podría decir que el acetonitrilo fue mejor en la extracción del GA3, debido a que este solvente es buen aceptor de protones, por lo cual interactúa fácilmente con solutos hidrolixados tales como el GA3, mientras que el metanol es un donador de protones e interacciona mayormente con solutos básicos ( 38 ). También es una ventaja la alta polaridad del acetonitrilo, dado que evita la extracción de compuestos lipídicos que pueden interferir en el proceso de cuantificación ( 39 ).
De los trabajados, el mejor método físico fue la agitación, pues se obtuvo una concentración de 7,531 mg/kg (Figura 2). Este resultado podría estar relacionado con la ausencia de ondas en el solvente extractor que pueden producir la degradación del analito y, por ende, conllevar a una disminución en la concentración del GA3 extraído ( 40 ). De igual manera, el método de agitación no conduce a la disociación de las moléculas de agua por lo cual no se generan radicales hidroxilos que, eventualmente, podrían reaccionar con el analito en estudio ( 41 ).
En resumen, las mejores condiciones evaluadas para extraer el GA3 por medio del método de lixiviación fueron: agitación como método físico, acetonitrilo-ácido fórmico 5% (80:20) como solvente y una hora como tiempo de extracción. Este tiempo fue el elegido dado que permite extraer la misma cantidad de GA3 que al emplear dos horas y, por tanto, fue el tratamiento más eficiente.
Evaluación de las condiciones de la extracción DSASE
Para la extracción por DSASE, los factores flujo y tiempo tuvieron diferencias estadísticamente significativas, mientras que con el factor solvente no se presentaron diferencias estadísticamente considerables, con una significancia del 5% (Figura 3).
El mejor flujo dentro de los dos niveles evaluados fue 0,4 mL/min, pues permitió una desorción rápida del analito presente en la matriz. Lo anterior debido a que, posiblemente, al haber solvente fresco en tiempos cortos, las interacciones solvente-matriz repetidas veces conllevaron a un equilibrio químico, lo que facilita la obtención de una mayor cantidad de analito extraído ( 24 , 26 ). Finalmente, y dado que el factor tiempo presentó diferencias significativas, siendo 25,0 min el tiempo que permitió una mayor extracción con una concentración del GA3 de 24,93 mg/kg, se escogió este valor como el óptimo para la extracción por DSASE (Figura 3).
Lo anterior permitió determinar que las mejores condiciones evaluadas para la extracción del GA3 por el método de DSASE fueron: acetonitrilo-ácido fórmico 5% (80:20) con 0,4 mL/min de velocidad de flujo y un tiempo de extracción de 25,0 min.
Al comparar los procedimientos de extracción por lixiviación y DSASE, se encontró que las concentraciones medias obtenidas por los dos métodos empleados fueron diferentes con un nivel de confianza del 95%. Estos valores, así como sus desviaciones estándar, se muestran en la Tabla 2.
:
Tabla 2. Concentración de GA3
obtenida con los métodos de extracción empleados.
Medias ± desviación estándar
Método
de extracción
Concentración
GA3 (mg/kg)
Lixiviación
15,062 ± 3,431
DSASE
30,012 ± 4,121
En la Tabla 2 se observa que la extracción por DSASE fue la más eficiente, reportándose una concentración del GA3 de 30,012 mg/kg. Esta técnica tiene varias ventajas sobre la extracción por lixiviación dado que presenta bajo consumo de solvente, emplea menor cantidad de muestra, disminuye drásticamente los tiempos de extracción y es menos laboriosa al momento de implementarse ( 25 ). Además, al ser un sistema dinámico la muestra está continuamente expuesta al disolvente fresco, lo cual promueve la transferencia de analitos desde la matriz hasta el disolvente ( 24 ). Todo esto confirma la bondad de esta técnica por lo cual es usada en la actualidad para la obtención de diferentes biomoléculas.
Conclusiones
Se evaluaron las mejores condiciones para la extracción del ácido giberélico (GA3) en semillas de maíz (Zea mays L) por lixiviación y por DSASE. Para la primera metodología los parámetros óptimos fueron agitación, con acetonitrilo-ácido fórmico 5% (80:20) y una hora. Para el segundo proceso las condiciones óptimas fueron acetonitrilo-ácido fórmico 5% (80:20), a un flujo de 0,4 mL/min y 25,0 min.
Se compararon los procedimientos de extracción por lixiviación y por DSASE, siendo este último el mejor método, debido a su alta eficiencia y correspondiéndose con las tendencias de la química verde al utilizar las mínimas cantidades de disolvente y muestra.
Se aplicó por primera vez una metodología de extracción por DSASE para la obtención del GA3 en semillas de maíz, obteniéndose una concentración del analito de 30,012 mg/kg. Este resultado abre el camino para usar esta técnica en estudios posteriores en el campo de los productos naturales.
Agradecimientos
A la vicerrectoría de investigaciones y posgrados de la Universidad de Caldas, por el financiamiento del proyecto 0455216.
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CrossRef Cited-by
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