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Diseño y producción de diversas proteínas fusión de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa (NMNAT) de Plasmodium falciparum
Design and production of various fusion proteins of the nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenilil transferase (NMNAT) of Plasmodium falciparum
Palabras clave:
Plasmodium falciparum, solubilidad, NMNAT, proteína recombinante, cuerpos de inclusión, TAG fusión (es)solubility, PfNMNAT, inclusion bodies, fusion TAG (en)
Las proteínas recombinantes se han convertido en herramientas útiles en la investigación bioquímica. Sin embargo, durante su producción, aparecen cuerpos de inclusión (IB), debido, por un lado, a la alta expresión de proteína producida a partir de los vectores usados que poseen promotores de alta eficiencia y, por otro lado, a características propias de la proteína. Ahora bien, la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenililtransferasa (NMNAT) es una proteína central en la biosíntesis del NAD(H)+, molécula esencial en el metabolismo celular, y ha sido estudiada en parásitos protozoos. Para el estudio de la NMNAT de estos parásitos se ha recurrido a la expresión de su versión recombinante en E. coli, obteniéndose gran cantidad de proteína como IB. Con el fin de aumentar la solubilidad de la proteína, se clonó la secuencia codificante de la NMNAT de Plasmodium falciparum en diferentes vectores de expresión, se indujo la expresión de la proteína recombinante en E. coli BL21(DE3) y se analizó la solubilidad. La proteína fusión con mayor solubilidad fue purificada y evaluada enzimáticamente. La adición de la etiqueta MBP (proteína de unión a maltosa) a la PfNMNAT incrementó su solubilidad y permitió obtener una proteína funcional con una alta pureza.
Recombinant proteins have become useful tools in biochemistry research. During their production, however, inclusion bodies (IB) appear, on the one hand, due to the high expression rate from the recombinant plasmids, which have high efficiency promoters, and, on the other hand, intrinsic characteristics of the expressed protein. Furhtermore, the nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenilyl transferase (NMNAT) is a central protein in NAD(H)+ biosynthesis, an essential cofactor in cell metabolism, and in protozoon parasite has been studied. To study the NMNAT protein of these parasites, their recombinant version in E. coli has been expressed, getting a great quantity of IB as a by-product. To increase the solubility of the protein, the coding sequence of the NMNAT enzyme of Plasmodium falciparum was cloned in different expression plasmids which were subsequently transformed into E. coli BL21(DE3) expression strain. The solubility of the recombinant proteins was assessed and the one with the highest presence in the soluble fraction was subsequently purified and its enzyme activity was determined. The recombinant protein with a MBP (maltose-binding protein) tag showed an increased solubility and purity.
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World Health Organization. World Malaria Report 2016. Disponible en: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/252038/1/9789241511711-eng.pdf?ua=1. [Consultado el 22 de febrero de 2017]
World Health Organization. Estrategia técnica mundial contra la malaria 2016 - 2030. Disponible en: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/186671/1/9789243564999_spa.pdf?ua=1. [Consultado el 22 de febrero de 2017]
Katoh, A.; Uenohara, K.; Akita, M.; Hashimoto. Early steps in the biosynthesis of NAD in Arabidopsis start with Aspartate and occur in the plastid. Plant Physiol. 2006.141(3), 851–857. DOI: http://dx.doi.org/10.1104/pp.106.081091
Zerez, C.; Roth, E.; Schulman, S.: Tanaka, K. Increased nicotinamide adenine dinucleotide content and synthesis in Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes. Blood. 1990. 75 (8), 1705-10.
Merrick, C.; Duraisingh, M. Plasmodium falciparum Sir2: an unusual sirtuin with dual histone deacetylase and ADP-ribosyltransferase activity. Eukaryot Cell. 2007. 6 (11), 2081-91. DOI: http://doi.org/10.1128/EC.00114-07.
Eren, D. Plasmodium falciparum, enzymes involved in redox balancing of nicotinamide nucleotides. Ph.D. Dissertation [Online]. College of Medicine, Drexel University. September 2003. P. 186. https://idea.library.drexel.edu/islandora/object/idea%3A477/datastream/OBJ/view [Consultado el 22 de febrero de 2017].
Muller, S. Redox and antioxidant systems of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Mol Microbiol, 2004, 53(5), 1291-305. DOI: http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2958.2004.04257.x.
Olszewski, K.; Morrisey, J.; Wilinski, D.; Vaidya, A.; Rabinowitz, J.; Llinás, M. Host-parasite interactions revealed by Plasmodium falciparum metabolomics. Cell Host Microbe. 2009, 5 (2), 191-9. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.chom.2009.01.004
O’Hara J.; Kerwin L.; Cobbold S.; Tai J.; Bedell T.; Reider, P.; et al. Targeting NAD+ Metabolism in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Plos ONE. 2014, 9 (4), e94061. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0094061
Marín, C.; Ramírez-Hernández, M. H. Identificación, expresión y caracterización de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenililtransferasa de Plasmodium falciparum (PfNMNAT). M. S. Tesis. Universidad Nacional de Colombia, 2010.
Sánchez, L.; Ramírez-Hernández, M. H. Obtención y caracterización parcial de la proteína recombinante nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Plasmodium falciparum (PfNMNAT). Tesis de pregrado, Universidad Nacional de Colombia, 2011.
Birkholtz L.; Blatch, G.; Coetzer, T.; Hoppe, H.; Human, E.; Morris, E.; et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 2008, 7, 197. DOI: http://doi.org/10.1186/1475-2875-7-197
Costa, S.; Almeida, A.; Castro, A.; Domingues, L. Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system. Front. Microbiol. 2014, 5, 63. DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063
Magnan, C.; Randall, A.; Baldi. P. SOLpro: accurate sequence-based prediction of protein solubility. Bioinformatics. 2009, 25 (17), 2200-2207 DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp386
Smialowski, P.; Doose, G.; Torkler, P.; Kaufmann, S.; Frishman, D. PROSO II – a new method for protein solubility prediction. FEBS J. 2009, 279, 2192–2200. DOI: http://dx.doi.org/10.1111/j.1742-4658.2012.08603.x
Hirose, S.; Kawamura, Y.; Yokota, K.; Natsume, T.; Komiya, K.; Tsutsumi, T.; et al. Statistical analysis of features associated with protein expression/solubility in an in vivo Escherichia Coli expression system and a wheat germ cell-free expression system. J. Biochem. 2011, 150 (1), 73-81. DOI: https://doi.org/10.1093/jb/mvr042
Sambrook, J.; Ruseell, D. Molecular cloning: a laboratory manual Tercera edición. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; 15.14 - 15.49.
Towbin, H.; Staehelin, T.; Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1979, 76 (9), 4350-4.
Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72, 248–254.
Kapust, R.; Waugh, D. S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Sci. 1999, 8, 1668–1674. DOI: http://dx.doi.org/10.1110/ps.8.8.1668
Fox, J; Kapust, R.; Waugh, D. Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteins. Protein Sci. 2001, 10, 622–630. DOI: http://dx.doi.org/10.1110/ps.45201
Duan, X.; Quiocho, F. Structural evidence for a dominant role of nonpolar interactions in the binding of a transport/chemosensory receptor to its highly polar ligands. Biochemistry. 2002, 41, 706–712. DOI: http://dx.doi.org/10.1021/bi015784n
Sharff, A.; Rodseth, L.; Spurlino, J.; Quiocho, F. Crystallographic evidence of a large ligand-induced hinge-twist motion between the 2 domains of the maltodextrin binding-protein involved in active-transport and chemotaxis. Biochemistry. 1992, 31, 10657–10663. DOI: http://dx.doi.org/10.1021/bi00159a003.
Spurlino, J.; Lu, G.; Quiocho, F. The 2.3-Å resolution structure of the maltose- or maltodextrin-binding protein, a primary receptor of bacterial active transport and chemotaxis. J. Biol. Chem. 1991, 266, 5202–5219.
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